西安市中心醫(yī)院燒傷整形外科 (西安710003)　郝　劍　劉　賓　李　菲　韓　悅　陶　諫

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磷脂酰膽堿及膽汁酸鹽體外溶脂的實(shí)驗(yàn)研究*

西安市中心醫(yī)院燒傷整形外科 (西安710003)郝劍劉賓▲李菲△韓悅陶諫

摘要目的: 通過對(duì)保脂妥(Lipostabil)、磷脂酰膽堿(PC)以及脫氧膽酸鹽(DC)的體外對(duì)照觀察試驗(yàn)，對(duì)其溶脂效果進(jìn)行初步觀察及探討。方法:分別將Lipostabil組、5%PC組、不同濃度DC組分別與分化成熟的脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察脂肪細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞活性以及脂溶度。結(jié)果： PC由于必須溶解于溶劑中，故其獨(dú)立于DC以及其它溶劑對(duì)脂肪組織的破解作用在本實(shí)驗(yàn)中無法得到證實(shí)；DC對(duì)于脂肪細(xì)胞具有明顯的破壞作用且與其一定范圍的濃度無明顯正相關(guān)性；Lipostabil具明顯的脂肪細(xì)胞破壞作用。結(jié)論：DC及Lipostabil組均具有明確的脂肪細(xì)胞破壞作用。

主題詞磷脂酰膽堿類膽酸鹽(酯)類@注射溶脂

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)目前最常用的注射溶脂藥物L(fēng)ipostabil以及其有效成分磷脂酰膽堿和及脫氧膽酸鹽的體外對(duì)照觀察試驗(yàn)，對(duì)其溶脂效果作用進(jìn)行初步的觀察及探討。

材料與方法

1材料3T3-Ll前體脂肪細(xì)胞(ATCC細(xì)胞株來源于美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心提供。) Lipostabil[主要成分5%磷脂酰膽堿(PC)、4.75%脫氧膽酸鹽(DC)，法國 Aventis 公司產(chǎn)]；5%PC及4.5%DC、膠原酶、胰蛋白酶、胎牛血清及DMEM/F12 培養(yǎng)基(美國 Sigma 公司)；噻唑蘭(美國 Amresco 公司)；1-甲基 3-異丁基黃嘌呤、地塞米松、胰島素及油紅O等(北京知麟堂生物科技發(fā)展有限公司)。TDL-40C 臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠), 全自動(dòng)生化分析儀 7180(日本日立公司),全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀(瑞士 HAMILTON公司)。

2方法

2.1體外培養(yǎng)3T3-Ll前體脂肪細(xì)胞：用含100U/ml青、鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞融合至約70%時(shí)，傳代至六孔板中；待細(xì)胞生長至完全融合后48h，加入0.5mmol/L 1-甲基3-異丁基黃嘌呤(IBMX)、1μ mol/L 地塞米松(DEX)、10 μg/ml 胰島素(INS)； 48h后撤去IBMX和DEX；培養(yǎng)至第8～9天時(shí)觀察分化成熟的前體脂肪細(xì)胞。

2.2分化成熟的3T3-Ll前體脂肪細(xì)胞油紅O染色：光鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的聚集并拍照。

2.3分組培養(yǎng)：于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)分化成熟的脂肪細(xì)胞，培養(yǎng)密度5000 cells/cm2，分6組進(jìn)行培養(yǎng)，分別為空白對(duì)照組、Lipostabil組、5%磷脂酰膽堿組、4.5%脫氧膽酸鹽組。

2.4不同濃度(1%、2%、3%、4%、5%、6%、)脫氧膽酸鹽與分化成熟的脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)。

3觀察項(xiàng)目

3.1光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及狀態(tài)。

3.2MTT法鑒定細(xì)胞活性:收集各組細(xì)胞于96孔板中，每孔加MTT溶液20μl；繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150μl DMSO，脫色搖床振蕩10min，選擇490nm(570nm)波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

3.3用 5% PC、4. 5% DC、Lipostabil 分別作用于分化的脂肪細(xì)胞 72 h，采用酶法檢測培養(yǎng)液內(nèi)中的 TC 含量，評(píng)價(jià)其脂肪細(xì)胞的溶解程度。

結(jié)果

1光鏡下脂肪細(xì)胞形態(tài)及狀態(tài)3T3-Ll前體脂肪細(xì)胞(圖1)；分化成熟的3T3-Ll脂肪細(xì)胞(圖2)； 油紅染色的3T3-Ll脂肪細(xì)胞(圖3)； 成熟的脂肪細(xì)胞與各實(shí)驗(yàn)組藥物共培養(yǎng)后均出現(xiàn)明顯的溶解與破壞(圖4)。

圖1　3T3-Ll前體脂肪細(xì)胞(10×10)

圖2　分化成熟的3T3-Ll脂肪細(xì)胞(10×10)

2MTT法鑒定細(xì)胞活性

2.1選擇第2天培養(yǎng)的快速增殖脂肪細(xì)胞開始給藥，各組細(xì)胞分別于接種后0～4d采用MTT法測細(xì)胞A值。與對(duì)照組比較，三組細(xì)胞的增殖活性顯著降低(P<0.05)，其中DC組作用更明顯，但三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

圖3　油紅染色的3T3-Ll脂肪細(xì)胞(10×10)

圖4　溶解破壞的3T3-Ll脂肪細(xì)胞(10×10)

2.2不同濃度的DC對(duì)脂肪細(xì)胞活性的影響：選擇第2天培養(yǎng)的快速增殖脂肪細(xì)胞分別給于給予1%-6%濃度的DC，各組細(xì)胞分別于接種后0～4d采用MTT法測細(xì)胞A值。與對(duì)照組(DMEM)比較，各濃度組細(xì)胞的增殖活性均顯著降低(P<0.05)，濃度越高作用相對(duì)更明顯，但各濃度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

3脂解程度測定測定培養(yǎng)基中甘油含量作為評(píng)價(jià)脂肪分解的指標(biāo)。脂肪分解數(shù)據(jù)表示為每升脂肪細(xì)胞壓積的毫摩爾甘油釋放量(mmol/L packed cell volume, mmol/LPCV)。PC 組 TC(4.09±0.78mmol/L)、DC(4.28±0.81mmol/L)、Lipostabil(4.19±0.79mmol/L)顯著高于對(duì)照組 TC(P<0.05)；結(jié)果顯示DC組溶脂作用較好，但三組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1　不同溶脂成份對(duì)脂肪細(xì)胞增殖活性不同時(shí)間作用效果

注：與對(duì)照組(DMEM)比較，*P<0.05；各實(shí)驗(yàn)組間比較，P>0.05

表2　不同濃度DC對(duì)脂肪細(xì)胞增殖活性不同時(shí)間作用效果±s)

注：與對(duì)照組(DMEM)比較，*P<0.05；各實(shí)驗(yàn)組間比較，P>0.05

討論

目前的身體塑形技術(shù)包括兩個(gè)發(fā)展方向：一方面，腹壁整形和吸脂等傳統(tǒng)手術(shù)仍將是最有效和流行的美容手術(shù)；另一方面，以消減局部皮下脂肪為目的的新型能源類和注射類技術(shù)正在迅速得到開展和部分認(rèn)同。

Lipostabil由法國Sanofi-Aventis公司生產(chǎn)，在部分歐洲國家被許可用于靜脈注射治療脂肪栓塞、血脂障礙和酒精性肝硬化。其為含大豆提取卵磷脂(Phosphatidylcholine，PC)5%、去氧膽酸(Deoxycholate，DC)4.5%及維生素E、氫氧化鈉、乙醇和苯甲醇的無菌水溶劑。Lipostabil注射消脂的療法受到國際業(yè)界關(guān)注始于巴西皮膚科醫(yī)生Patricia Rittes發(fā)表的一篇關(guān)于眶下注射Lipostabil消脂的報(bào)告[1]。之后，關(guān)于局部注射磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)及脫氧膽酸鹽(Deoxycholate,DC)消脂的研究報(bào)告大量涌現(xiàn)[2-7]。而隨著大量的相關(guān)雙盲臨床試驗(yàn)而獲得了一些重要的發(fā)現(xiàn)[8]，在認(rèn)同注射溶脂的脂肪溶解作用的同時(shí)，對(duì)其臨床安全性也提出了質(zhì)疑。為此我們通過對(duì)目前最常用的注射溶脂藥物的有效成分，磷脂酰膽堿以及脫氧膽酸鹽的體外對(duì)照觀察試驗(yàn)，對(duì)其溶脂效果作用進(jìn)行初步的觀察及探討。

從體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，5%PC組與Lipostabil一樣同樣具有明顯的脂肪細(xì)胞破壞作用。但是由于PC不可溶解于水，而實(shí)驗(yàn)中PC的溶劑DC或者其他膽汁鹽以及乙醇等也會(huì)產(chǎn)生類似的脂肪溶解作用。因此PC獨(dú)立于DC以及其它溶劑對(duì)脂肪組織的破解作用在本實(shí)驗(yàn)中無法得到證實(shí)，目前國內(nèi)的相關(guān)試驗(yàn)和臨床研究報(bào)道也很少。至于PC在Lipostabil中的真正作用，有研究推測： PC可能具有對(duì)DC溶解脂肪組織進(jìn)行乳化和消除的作用，可以減輕注射溶脂后常見副反應(yīng)，但具體機(jī)制不清楚。這一點(diǎn)我們將在后期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

DC是在肝臟分泌初級(jí)膽汁酸(膽酸)后由腸道細(xì)菌生成的次級(jí)膽汁酸，存儲(chǔ)于膽囊內(nèi)，分泌進(jìn)入十二指腸，其中包含可溶解攝入油脂的游離結(jié)合膽汁酸。之后，大部分(90%～95%)DC被再次吸收，但被排出DC由從肝臟膽固醇合成物取代。因?yàn)槟懰崾悄懝檀嫉淖罱K產(chǎn)品，因此不再降解為其他降解物。 DC被用于試驗(yàn)清潔劑已有數(shù)十年歷史，是藥廠普用于生產(chǎn)靜脈注射制劑的常規(guī)生理兼容溶劑成分之一。動(dòng)物和人體組織與DC或PC/DC復(fù)合物接觸后可發(fā)生內(nèi)出血、炎癥和組織壞死。作為一種非離子清潔劑，DC還可引發(fā)細(xì)胞膜穿孔、細(xì)胞質(zhì)滲漏、胞膜不穩(wěn)，從而導(dǎo)致溶解。本實(shí)驗(yàn)中DC組對(duì)于脂肪細(xì)胞的溶解作用更加明顯、持久，且其對(duì)脂肪細(xì)胞的破壞作用與實(shí)驗(yàn)組中的濃度相關(guān)性不大。因此DC在Lipostabil中不僅充當(dāng)著PC溶劑的角色，其對(duì)脂肪細(xì)胞的溶解和破壞也起著非常重要的作用，另外我們也將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證是否可以在溶脂藥物的配方中適當(dāng)降低DC的濃度以減少其對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)。

Lipostabil組在體外試驗(yàn)中，與其它兩組一樣均對(duì)脂肪細(xì)胞有著明顯的脂肪細(xì)胞破壞作用。那么PC或DC溶解脂肪細(xì)胞與Lipostabil的區(qū)別在于哪里？ 有研究推測： PC和DC復(fù)合溶液可導(dǎo)致混合膠束聚合物形成，從而(因游離DC減少)減弱DC的溶脂活性。另外 PC可能具有對(duì)DC溶解脂肪組織進(jìn)行乳化和消除的作用；可能有減輕注射溶脂后常見副反應(yīng)的作用，但其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

目前，由于注射溶脂藥物劑量和配方的非標(biāo)準(zhǔn)化引發(fā)了許多并發(fā)癥。其中最常見者包括：即時(shí)水腫、紅斑、瘙癢、甚至壞死和炎癥組織結(jié)節(jié)等。在這些注射部位出現(xiàn)的副反應(yīng)，多數(shù)可能與注射技術(shù)或注射藥物濃度過高有關(guān)。對(duì)于注射溶脂藥物中PC、DC各自的比例、濃度以及注射時(shí)的層次把握，我們將在接下來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步探討和驗(yàn)證。

總之，DC及Lipostabil均具有明確的脂肪細(xì)胞破壞作用，且DC的脂肪細(xì)胞破壞作用在一定范圍內(nèi)與其濃度無明顯正相關(guān)性。

參考文獻(xiàn)

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(收稿：2016-03-07)

【中圖分類號(hào)】R33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.08.003

Experimental study of phospholipids and deoxycholate in vitro lipolysis

Department of Bum and plastic surgery, Xi’an Central Hospital(Xi'an 710003)

Hao JianLiu BinLi Feiet al

ABSTRACTObjective By fat injection lipolysis medication properly (Lipostabil), phosphatidylcholine (PC) and deoxycholate (DC) in vitro controlled observation experiment, observing and discussing its preliminary lipolysis effect. Methods: The Lipostabil group, 5% PC group, various concentration DC group were co-cultured with fat cells ， cell morphology、 activity and lipid solubility was observed. Results: PC-independent DC and other solvents cracks on the role of adipose tissue in this experiment could not be confirmed; DC for adipocytes has obvious destructive effects. Conclusion: DC and Lipostabil has a clear role in the destruction of fat cells.

KEY WORDSPhosphatidylcholinesCholates@Injectionsolution

*陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(SFα-06)

△西安醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院

▲通迅作者