朱金鑫，孫金金，原曉龍，王 娟，楊宇明，王 毅

( 1.國家林業(yè)局重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201； 2．云南林業(yè)學(xué)科院云南，昆明 650201； 3．西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224)

巴拉圭瓜多竹CCR基因的克隆與分析

朱金鑫1,3，孫金金1,3，原曉龍1,2，王 娟1,2，楊宇明1,2，王 毅1,2

( 1.國家林業(yè)局重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201； 2．云南林業(yè)學(xué)科院云南，昆明 650201； 3．西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224)

肉桂酰輔酶A還原酶(cinnamoyl-CoA reductase，CCR)是木質(zhì)素生物合成途徑中關(guān)鍵酶。本研究依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR方法成功地從巴拉圭瓜多竹(Guaduaparaguayanan)中克隆得到一個(gè)全新的CCR基因的全長cDNA序列，命名為GpCCR。序列分析結(jié)果表明，GpCCR包含完整的cDNA開放閱讀框(ORF)，由1065bp組成，編碼354個(gè)氨基酸。Blast比對結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)屬于CCR家族蛋白；系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示瓜多竹與禾本科植物大麥、水稻等親緣關(guān)系較近。熒光定量PCR檢測顯示GpCCR在巴拉圭瓜多竹的莖稈中表達(dá)量最高，在葉中表達(dá)量最低。

瓜多竹；木質(zhì)素生物合成；肉桂酰輔酶A還原酶；基因克隆；熒光定量PCR

竹(Bamboo)屬禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusadea)植物，全世界有竹類70余屬1 200多種，我國有40屬500多種，是世界上最主要的產(chǎn)竹國，且竹在中國幾千年工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、文化藝術(shù)、日常生活等諸多方面占據(jù)著重要地位[1]。巴拉圭瓜多竹(Guaduaparaguayanan)隸屬于瓜多竹屬，分布于南美洲巴西、巴拉圭、阿根廷等國[2]，稈徑5～8 cm，為熱帶大型實(shí)心稈叢生竹種，該竹種具有生長迅速、易繁殖、生物量大、結(jié)構(gòu)性能優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)[3]，在哥倫比亞、厄瓜多爾、尼加拉瓜建筑業(yè)得到廣泛利用[4-5]，具有重要的商業(yè)潛在開發(fā)價(jià)值。云南省林業(yè)科學(xué)院于2014年從巴西引種栽培，種植于云南省云興園藝有限公司普洱市曼昔壩苗圃基地。

竹材造紙?jiān)谖覈哂杏凭脷v史，目前仍是造紙工業(yè)的重要原料。雖然竹材造紙具有原料易得、成漿容易、成紙光滑等優(yōu)點(diǎn)，但其木質(zhì)素是影響竹漿產(chǎn)量和質(zhì)量的一個(gè)重要因素，去除過程需要大量消耗能源和使用一些有毒化學(xué)物質(zhì)，且黑液難以回收，嚴(yán)重影響竹漿品質(zhì)，增加成本的同時(shí)造成很大的環(huán)境負(fù)擔(dān)[6-9]。木質(zhì)素(Lignin)是由3種單體聚合而成的、包圍在木纖維等管束細(xì)胞和厚壁細(xì)胞的一類復(fù)雜的化合物，木質(zhì)素不僅是細(xì)胞壁的基本組成成分，參與細(xì)胞壁木質(zhì)化過程，對植物有形態(tài)建成、機(jī)械強(qiáng)度支撐等重要作用，且保衛(wèi)植物免受病原菌侵害方面，其總體含量、各單體比例對植物物理特性、抗病和抗逆性等具有決定性影響作用，是陸生維管植物進(jìn)化過程中的必要因子[10-12]。其生物合成途徑主要為：單體合成、儲存、運(yùn)輸、聚合而成木質(zhì)素[13]，其單體生物合成的起始物為L-苯丙氨酸，而L-苯丙氨酸在合成植物體內(nèi)次生酚類物質(zhì)的過程中有著多種合成流向，其產(chǎn)物除木質(zhì)素外還有類黃酮、黃酮、鞣質(zhì)、花色素苷、香豆素等多種次生酚類物質(zhì)[14]。肉桂酰輔酶A還原酶(Cinnamoyl-CoA Reductase，CCR)是木質(zhì)素單體合成特異途徑的第1個(gè)關(guān)鍵酶，在NADPH的輔助下，以3種2肉桂酰輔酶A酯類作為底物(香豆酰輔酶A、阿魏酰輔酶A、芥子酰輔酶A)催化生成相應(yīng)的肉桂醛，決定著苯丙氨酸代謝途徑的最終流向，對木質(zhì)素單體生物合成起著重要作用[15-16]。目前已報(bào)道的CCR分子量一般在38 kD左右，其分子量、等電點(diǎn)、最適pH、米氏常數(shù)均隨不同物種而略有差異[17-19]，且不同來源的CCR對各種底物的親和力不同[20]，已報(bào)道的CCR的氨基酸序列保守位點(diǎn)[21]有：(1)VCVTGAGGFIASWLVKLLL;(2)GYTVKG-TVRNP;(3)GVFHTASP;(4)VTDDPEQMVEPAV;(5)VRRVVFTSSIGVA;(6)TKNWYCYGKAVAE;(7)GVDLVVVNPVLVIGPLLQ;(8)ASGRYLC-AE;(9)TVKSLQEKGHL，利用基因工程定向改良木質(zhì)素的含量或單體比例已經(jīng)成為木質(zhì)素的研究熱點(diǎn)之一，而CCR被認(rèn)為是最佳研究對象之一[22]，在保證植物正常生長發(fā)育的前提下，可以使用RNAi技術(shù)特異性的抑制CCR基因表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量下降[23-26]。目前，CCR基因已在水稻(Oryzasativa)[27]、馬尾松(Pinusmassonian-a)[28]、象草(Pennisetumpurpureum)[29]、銀杏(Ginkgobiloba)[30]、苧麻 (Boehmerianivea)[31]等多種植物中發(fā)現(xiàn)，但目前尚未見到在實(shí)心稈的瓜多竹中克隆得到CCR基因的相關(guān)報(bào)道，本研究對瓜多竹CCR基因進(jìn)行克隆與分析，為深入研究瓜多竹木質(zhì)素代謝途徑相關(guān)基因、木質(zhì)素生物合成的分子機(jī)理以及通過基因工程等手段對木質(zhì)素的含量和單體比例進(jìn)行調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)，為其在造紙工業(yè)的應(yīng)用、減輕環(huán)境污染、促進(jìn)生態(tài)文明建設(shè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

Guaduaparaguayanan分子樣本采于普洱市云興園藝有限公司苗圃基地，樣本經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。pEASY-T3克隆試劑盒及Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金公司；TaKaRaLATaq酶、Prime Script1st Stand cDNA Synchesis Kit購自大連寶生物工程有限公司；TRIzol試劑購自上海生工生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.2.1 GpCCR基因克隆 以肉桂酰輔酶A還原酶的保守序列氨基酸為模板，通過本地 Blast技術(shù)分析獲得莖稈轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中存在的可能肉桂酰輔酶A還原酶序列。根據(jù)篩選出來的序列設(shè)計(jì)基因特異引物，按TRIzol試劑盒操作步驟提取瓜多竹莖稈總RNA，cDNA合成參照PrimeScriptTMⅡ 1st Stand cDNA Synchesis Kit試劑盒說明書操作，以cDNA第一鏈為模板、GpCCR-F和GpCCR-R為引物，PCR擴(kuò)增獲得GpCCR基因片段。PCR擴(kuò)增體系：10×LATaqBufferⅡ 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，引物GpCCR-F 1 μL，引物GpCCR-R 1 μL，cDNA 3 μL，TaKaRaLATaq1 μL，ddH2O 30 μL；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，最后延伸7 min；4 ℃結(jié)束反應(yīng)。用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后，將PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pEASY-T3載體，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布在含有AMP抗性的LB固體平板培養(yǎng)基上過夜，第2天挑選克隆，接種到0.5mL液體培養(yǎng)基中，200 r·min-1，37 ℃培養(yǎng)6 h后，進(jìn)行菌落PCR檢測陽性克隆插入片段，將有預(yù)期插入片段的陽性克隆送往測序公司檢測，并對測序結(jié)果用Conting Express序列拼接軟件進(jìn)行全長序列拼接，同時(shí)利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析。

表1 引物序列

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對cDNA序列和氨基酸序列進(jìn)行Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比對分析，使用Protparam、NCBI ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)和DNAMAN生物學(xué)軟件對GpCCR基因的cDNA序列和氨基酸序列進(jìn)行生物學(xué)信息分析；利用軟件MEGA 5以鄰位連接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建GpCCR的氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 RT-PCR檢測GpCCR組織表達(dá)分析 采集巴拉圭瓜多竹莖稈，竹筍和竹葉三個(gè)不同組織提取RNA，采用TaKaRa Super RT Kit試劑盒獲得cDNA第一鏈。Real-time RT-PCR反應(yīng)用熒光染料SYBR Green Ⅰ，GAPDH為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min;95 ℃ 15 s；57 ℃ 15 s，72 ℃ 25 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃單點(diǎn)檢測信號。反應(yīng)結(jié)束后，60 ℃連續(xù)檢測信號產(chǎn)生溶解曲線。用Opticon monitor 3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的記錄和分析。每個(gè)樣品3次重復(fù)，滅菌水對空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 GpCCR基因的克隆

根據(jù)CCR轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)特異引物(CCR-F和CCR-R)，克隆得到巴拉圭瓜多竹的肉桂酰輔酶A還原酶(GPCCR)基因片段；Blast比對結(jié)果表明其屬于肉桂酰輔酶A還原酶合成基因家族。再以所獲得的序列設(shè)計(jì)特異性引物，RACE法擴(kuò)增得到GPCCR的3′端和5′端；軟件拼接而得到GpCCR全長cDNA序列，以此設(shè)計(jì)含有起始密碼子和終止密碼子的引物，以cDNA為模板擴(kuò)增得到完整的基因片段，利用NCBI ORF Finder軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示GpCCR基因片段包含完整的cDNA開放閱讀框(ORF)，序列全長1065bp，編碼含有354個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，起始密碼子為ATG，終止密碼子TGA。

圖1 瓜多竹CCR與其他植物CCR部分氨基酸序列比對結(jié)果注：CCR NADPH結(jié)合位點(diǎn)用綠色熒光標(biāo)志，保守位點(diǎn)用方框標(biāo)志；用于對比的氨基酸序列分別為：Lolium perenne,AAL47182.1;Miscanthus sacchariflorus,ALG76005.1;Oryza sativa Japonica Group,NP001061909.1;Saccharum officinarum,CAA13176.1.Fig.1 Multiple alignment of the part of amino acid sequences of GpCCR with CCRs from other plant species.(A)Residues of the NADPH blinding marked with emitting green substrate, conserved site of the amino acid sequences marked with textbook; (B)The accession numbers of the sequences used in the comparison are: Lolium perenne,AAL47182.1;Miscanthus sacchariflorus,ALG76005.1;Oryza sativa Japonica Group,NP001061909.1;Saccharum officinarum,CAA13176.1.

2.2 GpCCR氨基酸序列比對分析

將克隆出來的GpCCR基因編碼的氨基酸蛋白序列與已報(bào)道的CCR的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對。結(jié)果顯示該蛋白與已報(bào)道的CCR超家族的保守結(jié)構(gòu)域具有高度一致性，共用signatural CCR催化位點(diǎn)，表明該蛋白屬于CCR家族蛋白。GpCCR的氨基酸序列與85.6%黑麥草序列相同(AAL47182.1)，與76.2%荻序列相同(ALG76005.1)，與81%水稻序列相同(NP_001061909.1)，與76.8%甘蔗序列相同(CAA13176.1)(圖1)。

2.3 GpCCR基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA5的Neighbor-Joining構(gòu)建基于瓜多竹CCR氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，分析結(jié)果表明，瓜多竹CCR與禾本科植物大麥關(guān)系最近，與禾本科植物水稻、玉米、芒等聚為一個(gè)分支，與雙子葉植物沙梨、白楊、陸地棉等聚為不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由CCR基因系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，CCR基因的聚類與植物分類大體一致，表明CCR基因和植物的進(jìn)化過程密切相關(guān)。

圖2 瓜多竹CCR與其他植物CCR部分氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree based on the amino acid sequences of GpCCR with CCRs from other plant species

2.3 熒光定量PCR檢測GpCCR

為確定GpCCR的功能，熒光定量PCR技術(shù)用來檢測GpCCR基因在不同組織的表達(dá)情況。熒光定量PCR結(jié)果顯示GpCCR在莖稈中表達(dá)量最高，竹筍中的表達(dá)量次之，在葉中的表達(dá)量最低(圖3)。研究顯示巴拉圭瓜多竹實(shí)心稈的主要成分之一是木質(zhì)素，而熒光定量PCR結(jié)果顯示GpCCR組織特異性地在莖稈中大量表達(dá)。這說明GpCCR參與了巴拉圭瓜多竹實(shí)心稈的形成過程。

圖3 瓜多竹CCR不同組織表達(dá)Fig.3 Real time PCR detection of GpCCR in culms, leaves and shoots

3 結(jié)論與討論

木質(zhì)素不僅參與細(xì)胞壁木質(zhì)化過程，是細(xì)胞壁的基本組成成分，對植物具有形態(tài)建成、機(jī)械強(qiáng)度支撐等重要作用，并且保衛(wèi)植物免受病原菌侵害。肉桂酰輔酶A還原酶(Cinnamoyl-CoA Reductase，CCR)是木質(zhì)素單體特異合成途徑的第1個(gè)關(guān)鍵酶，催化3種在木質(zhì)素生物合成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。此前人們通過化學(xué)和生化角度研究木質(zhì)素的合成途徑，本研究通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析后篩選出的CCR基因設(shè)計(jì)特異性引物，從瓜多竹中克隆出其木質(zhì)素生物合成途徑中的肉桂酰輔酶A還原酶基因(GpCCR)。該cDNA全長1 065 bp，編碼含有354個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，測序結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)真實(shí)有效。酶的催化能力主要在于其活性位點(diǎn)，只有少數(shù)特異氨基酸殘基參與底物結(jié)合及催化作用，酶活性部位氨基酸序列較為保守，氨基酸序列分析表明該蛋白與已報(bào)道的CCR超家族的保守結(jié)構(gòu)域具有高度一致性，表明該蛋白屬于CCR家族蛋白；系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示瓜多竹GpCCR蛋白與禾本科的大麥、水稻、玉米CCR蛋白等親緣關(guān)系較近，說明本實(shí)驗(yàn)克隆出來的基因是肉桂酰輔酶A還原酶基因。

竹材一直是我國造紙行業(yè)的重要原材料，隨著中國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，造紙行業(yè)也得到快速增長，但自2014年后中國政府對造紙行業(yè)環(huán)保要求趨于嚴(yán)格，加快淘汰落后產(chǎn)能，造紙行業(yè)2005年至2010年的急劇擴(kuò)張勢頭趨于平緩，市場調(diào)整、行業(yè)整合進(jìn)度加快，一些企業(yè)必將遭淘汰出局[32]。因此，改進(jìn)生產(chǎn)工藝、降低成本、減輕行業(yè)對環(huán)境污染成為企業(yè)的唯一選擇，而采用基因工程手段來調(diào)控木質(zhì)素的生物合成，從材料源頭降低木質(zhì)素含量，可以在提高紙漿的得率和質(zhì)量、降低成本的同時(shí)減輕對環(huán)境的壓力，胡可等通過利用含有目標(biāo)基因正向和反向重復(fù)序列片段能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA(hpRNA)沉默編碼CCR的基因，得到木質(zhì)素含量顯著降低的轉(zhuǎn)基因黑麥草，在為影響黑麥草生長發(fā)育的狀況下提高了黑麥草的利用率和消化率；宋恩慧等[33]培育出了生長發(fā)育正常的轉(zhuǎn)基因楊樹，對其莖橫截面進(jìn)行組織化學(xué)染色分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量較對照組平均降低9.7%，表明轉(zhuǎn)基因植株更適合于造紙。瓜多竹具有生長迅速、易繁殖、生物量大、結(jié)構(gòu)性能優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)，其優(yōu)良的生物特性使其在造紙業(yè)具有極大的潛在商業(yè)價(jià)值。本研究進(jìn)一步證實(shí)CCR在瓜多竹木質(zhì)素生物合成途徑中起著重要作用，為下一步深入研究瓜多竹的木質(zhì)素生物合成途徑及生物總量和單體比例調(diào)控提供了理論依據(jù)。

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Cloning and Sequence Analysis of Cinnamoyl-CoA Reductase Gene fromGuaduaparaguayana

ZHU Jin-xin1,3, SUN Jin-jin1,3, YUAN Xiao-long1,2, WANG Juan1,2, YANG Yu-ming1,2, WANG Yi1,2

(1.Yunnan Laboratory for Conservation of Rare, Endangered & Endemic Forest Plants, Public Key Laboratory of the State Forestry Administration; Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants, Kunming 650204, Yunnan, China;2.Yunnan Forestry Academy, Kunming 650204,Yunnan, China; 3．Southwest Forestry University, Kunming 650204,Yunnan, China)

Cinnamoyl-coA reductase(CCR) is an important enzyme in the biosynthetic pathway of lignin. GpCCR was successfully obtained fromGuaduaparaguayananby RT-PCR with the primers specially designed based on the data from transcriptome. Sequence analysis showed the GpCCR had complete cDNA open readimg frame(ORF), which consisted of 1065bp encoding 354 amino acids. Blast analysis showed that GPCCR belonged to the CCR family. Phylogenetic analysis showed that theGuaduaparaguayananhad closer relative relationship withHordeumvulgareandOryzasativain the Gramineae. Real time PCR detection showed GpCCR was expressed the strongest in culms and the lowest in leaves ofGuaduaparaguayana.

Guaduaparaguayanan; Lignin biosynthesis; Cinnamoyl-coA reductase; Gene clone; Real time PCR

2015-12-04

云南省對外科技合作計(jì)劃(2014IA3)；云南省基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2013FA054)；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2010CI016)；國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物繁育和保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開發(fā)基金共同資助

朱金鑫(1993-)，男，碩士研究生，主要從事植物學(xué)竹類研究。E-mail：1639807959@qq.com。通信作者：王毅(1981-)，男，助理研究員，博士，主要從植物分子生物學(xué)研究。E-mail：228285818@qq.com