李新鑫, 余學軍，俞 暾，蔣玉儉

(浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300)

竹林環(huán)境中木質(zhì)素降解菌株的分離鑒定

李新鑫, 余學軍，俞 暾，蔣玉儉

(浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300)

為篩選竹林環(huán)境中較為高效的木質(zhì)素降解菌，采用分析苯胺藍和愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基變色情況和相關(guān)酶活大小，從浙江臨安市竹林地中分離篩選出一株高效木質(zhì)素降解菌27-1，根據(jù)形態(tài)學觀察和ITS序列分析，確定該菌株為多孔菌科栓菌屬毛栓菌(Trameteshirsuta)。

木質(zhì)素降解菌；變色；漆酶；篩選

纖維素是自然界中儲量最豐富的有機物[1]，是一種潛在的十分重要的生物能源。木質(zhì)素的去除是纖維素進一步高效利用的關(guān)鍵[2-3]。竹子作為一種木本禾本科植物，生長更新速度很快，每年能夠產(chǎn)生大量的纖維素類有機物。木質(zhì)素的存在使得纖維素的的利用和降解程度大大降低。如何降解木質(zhì)素成為了提高纖維素利用率的關(guān)鍵。竹林中殘存過多的覆蓋物和枯落物也不利于竹林的良好更新，必須在次年對覆蓋物進行及時的清除，而木質(zhì)素的去除是進一步加快纖維類有機物降解的關(guān)鍵，也是造紙行業(yè)中制漿的關(guān)鍵。在過去，纖維類有機物在利用前均會進行不同程度、不同方式的預(yù)處理，如碾壓，蒸汽爆破[4]，酸堿處理[5]，超流體萃取[6]，有機溶劑處理等[7-9]。但這些方法處理成本高，且容易造成環(huán)境污染，因此如何快速、有效、安全、方便的去除木質(zhì)素一直是纖維類有機物質(zhì)利用或降解的重點，生物降解是降解竹材木質(zhì)素和林地覆蓋物的一種安全可靠的方法。

國內(nèi)對木質(zhì)素降解微生物的研究起步于20世紀90年代中期，并且分別從造紙廢液、藥渣、堆肥和森林土壤中分離篩選出不同的木質(zhì)素降解菌。晉果果等[10]人從張家界土壤中分離篩選出一株只降解木質(zhì)素而對纖維素沒有降解能力的高溫木質(zhì)素降解菌地芽孢桿菌GeobacilluscaldoxylosilyticusJ16，李紅亞等[11]人從牛糞中分離出一株解淀粉芽孢桿菌，該細菌對玉米秸稈中的木質(zhì)素有很好的降解作用。習興梅[12]從堆肥中分離到一株黑曲霉，不僅對木質(zhì)素有一定降解能力，對半纖維素和纖維素也有很好的降解能力。木質(zhì)素的微生物降解主要通過木質(zhì)素降解酶系完成[13]，其中漆酶、木質(zhì)素過氧化氫酶、錳過氧化氫酶3種酶起著主要的作用[14,15]。本研究通過測定分離菌株的變色能力大小和3種酶活大小來篩選降解木質(zhì)素的優(yōu)良竹林微生物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 本實驗55個樣品為采自浙江臨安及其周邊地區(qū)竹林地的朽竹和腐殖質(zhì)豐富的土壤，采集時間為2014年8月到9月和2015年4月到8月。

1.1.2 培養(yǎng)基 液體PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.01 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 L。

固體PDA培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20 g·L-1的瓊脂。

定性篩選培養(yǎng)基：分別在固體培養(yǎng)基中加入0.1 g·L-1的苯胺藍和0.04%愈創(chuàng)木酚。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：參照劉小剛，呂聰?shù)萚16-17]的產(chǎn)酶培養(yǎng)基配比，將葡萄糖濃度改為10 g·L-1，氮源改為酒石酸銨0.2g·L-1， NH4NO30.1g·L-1和麩皮8g·L-1的混合氮源，培養(yǎng)基pH為4.5。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃，滅菌15分鐘。

1.1.3 實驗器材 高壓蒸汽滅菌鍋，電子分析天平，紫外-可見光分光光度計，離心機，電磁爐，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫搖床，電泳儀，PCR儀，連接儀，超低溫冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離與篩選 樣品破碎后，稱取適量樣品(土壤樣品5 g，植物樣品2 g)加入到裝有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d(30 ℃,160 r·min-1)，取1 mL培養(yǎng)液梯度稀釋，取20 μl稀釋倍數(shù)在10-3，10-4，10-5的樣品涂布于平板培養(yǎng)基上，每個樣品及梯度做3次重復并在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5 d，挑取單菌落在平板培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)3-5 d，反復劃線以獲得單一菌株。將獲得的純菌株劃線接種于苯胺藍PDA平板培養(yǎng)基和愈創(chuàng)木酚PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察。對引起苯胺藍PDA培養(yǎng)基褪色或愈創(chuàng)木酚PDA培養(yǎng)基出現(xiàn)紅褐色變化的菌株進行連續(xù)接種培養(yǎng)，觀察其在培養(yǎng)期間的變色能力有無明顯差異，將在培養(yǎng)過程中均能引起篩選培養(yǎng)基有效變色的菌種斜面接種，保存于4 ℃冰箱備用。

將篩選的菌株活化后點狀接種于苯胺藍PDA平板培養(yǎng)基和愈創(chuàng)木酚PDA平板培養(yǎng)基中，觀察菌落生長和變色情況，并測量菌落及變色圈直徑。對比各菌株對苯胺藍平板的褪色效果和愈創(chuàng)木酚平板的變色能力。

1.2.2 菌株酶活復篩 將變色能力強的菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)數(shù)天，以獲得足夠的菌株。用打孔器取下直徑7 mm的菌餅三片接種于裝有100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件30 ℃,200轉(zhuǎn)每分鐘，從第7天起每兩天取樣測定各菌株發(fā)酵液的酶活活力，至第15天。

1.2.3 酶活測定方法

(1)粗酶液提取。取適量發(fā)酵液，在4 ℃環(huán)境下8 000 r·min-1離心10 min，移取上清液備用。以沸水滅活10 min的酶液作為對照。

(2)漆酶(lac)酶活測定方法。漆酶酶活測定采用以2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為反應(yīng)底物的方法測定，反應(yīng)環(huán)境為25 ℃，反應(yīng)體系3 mL,反應(yīng)底物為2 mL的溶解于0.1 mmol·L-1的醋酸-醋酸鈉(pH=5.0)緩沖液中的濃度為0.5 mmol·L-1的ABTS，加入1 mL的酶液啟動反應(yīng)，測定最初3分鐘內(nèi)420 nm處的吸光值變化。定義每分鐘氧化1 μmol的ABTS為一個酶活單位(ε=3.6×104[(mol/L)-1·cm-1])[18]。

(3)錳過氧化氫酶(MnP)酶活的測定方法。反應(yīng)體系4 mL，50 mmol·L-1(pH=4.5)的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液3.4 mL，1.6 mmol·L-1的MnSO4水溶液0.1 mL，酶液0.4 mL，混勻后37 ℃水域保溫，反應(yīng)時添加1.6 mmol·L-1的H2O20.1 mL啟動反應(yīng)，測定最初3分鐘內(nèi)240 nm處的吸光值變化。定義每分鐘使Mn2+轉(zhuǎn)化為Mn3+所需的酶量為一個酶活單位(ε=6.5×103[(mol/L)-1·cm-1])[19]。

(4)木質(zhì)素過氧化氫酶(Lip)酶活測定方法。反應(yīng)體系3 mL，0.24 mol·L-1(pH=3)的酒石酸-就是酸鈉緩沖液1.85 mL，24 mmol·L-1的藜蘆醇0.1 mL，酶液1 mL，混勻后37 ℃水域保溫，反應(yīng)時添加6 mmol·L-1的H2O20.05 mL啟動反應(yīng)，測定最初3分鐘內(nèi)310 nm處的吸光值變化。定義每分鐘氧化1 μmol的藜蘆醇為一個酶活單位(ε=9.3×106[(mol/L)-1·cm-1])[20]。

1.2.4 菌種鑒定

(1)菌種的形態(tài)觀察。采用插片發(fā)制作菌體玻片，采用革蘭氏染色法對其進行染色，將玻片置于顯微鏡下觀察。參考《真菌鑒定手冊》[21]和《中國真菌志》[22]對其進行初步的分類。

(2)菌種的ITS序列分析。采用CTAB法提取菌株DNA，引物采用通用引物ITS1(TCCGATGGTGA ACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)并以提取的DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變形30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，72 ℃保持10 min，12 ℃保溫。對PCR產(chǎn)物進行回收，連接到PMD-19載體上，導入DH5α型感受態(tài)細胞，并將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細胞涂布于含有AMP的LB平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12-15小時，挑取單菌落進行菌落PCR。將菌落PCR結(jié)果為陽性的菌液送交生工生物工程有限公司進行序列測定，對所得序列進行人工剪切并在NCBI上進行BLAST。選取同源性較高的菌種，采用Mega.5.0軟件NJ法進行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩與復篩

從富含腐殖質(zhì)的竹林土壤和朽竹中初步選出85份可以引起培養(yǎng)基變色的菌株，經(jīng)過連續(xù)接種培養(yǎng)，篩選出一些能穩(wěn)定的使定性培養(yǎng)基變色的菌株。通過測量變色圈直徑、菌落直徑測定初步判斷各菌株的產(chǎn)酶活力大小。各菌株在定性篩選培養(yǎng)基上的變色能力大小如表1所示：菌株6-1，27-1，39-1的Hb較大，菌株1-1，48-2，48-5等有較大的Ha比值。通過酶活測定，從中選出了8株酶活較為明顯的的菌株。其中以菌株6-1和27-1有最大的Hb值，但在培養(yǎng)10天后，兩者的液體發(fā)酵產(chǎn)酶活力相差較大，菌株27-1的漆酶酶活可以達到94.389 U，而6-1只有2.111U左右(部分菌株酶活見表2)，究其原因可能是6-1的適宜培養(yǎng)條件與當前發(fā)酵條件相差較大或該菌株分泌的是其他類型的多酚氧化酶。48-5有最大的Hb值。雖然27-1的Hb值很小，但培養(yǎng)菌株十天后，其MnP活性最大，達到了34.87 U·mL-1，其他菌株均有一定的Mnp活性，但酶活不高，一般在3-7 U左右。而Lip酶活活性均未檢測到。綜合27-1有著較高的Lac活性和Mnp活性，故確定最佳木質(zhì)素降解菌株為27-1。

2.2 菌株27-1的產(chǎn)酶周期測定

對選出的27-1進行發(fā)酵周期測定，結(jié)果如圖1，由圖中可知，菌株27-1在第9天的時候表現(xiàn)出一定的產(chǎn)酶活性。其中Lac活性在第15天達到74.86 U,比菌株復篩時酶活性大小略有差異且產(chǎn)酶略晚，可能是不同傳代次數(shù)的菌株間的產(chǎn)酶能力大小差異引起；Mnp活性僅在第11天時達到一般正常產(chǎn)酶水平，為3.248 U，在第23天時達到最大為16.068 U。與酶活篩選時酶活性差異較大，且產(chǎn)酶較晚。說明菌株27-1的Mnp活性并不是十分穩(wěn)定；整個周期中依然沒有表現(xiàn)出Lip活性。

表1 部分菌株的定性篩選結(jié)果

表2 8株菌的三種酶活力大小

圖1 菌株27-1發(fā)酵過程中三種酶活的活性大小Fig.1 The activities of three enzymes during the fermentation of fungus 27-1

2.3 菌株27-1鑒定

菌體形態(tài)特征見圖 。菌株27-1在PDA培養(yǎng)基上生長時，菌絲白色，絨毛狀，有橫隔與分枝，有鎖狀聯(lián)合，菌落圓形邊緣不整齊，初步判斷菌株27-1為擔子菌綱的真菌。采用真菌通用引物序列ITS1和ITS4對所提取的菌株DNA進行PCR擴增后，得到一組長度大約在600 bp左右的片段，將其擴增序列通過連接轉(zhuǎn)化，然后交由生工生物工程有限公司進行測序，并將其序列與GenBank中已有DNA序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)同源性在99%以上的ITS序列均為栓菌屬的毛栓菌。故判斷菌株27-1為多孔菌科栓菌屬毛栓菌Trameteshirsuta，是一種白腐真菌。

圖2 菌株27-1及來自Genbank的相似物種的ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of fungus 27-1 and similar speices from Genbank

3 結(jié)論討論

本研究通過培養(yǎng)基變色初篩、酶活測定復篩的方法，從竹林地中分離出1株高效木質(zhì)素降解菌，通過生物學初步觀察和ITS序列分子鑒定，確定該菌株為擔子菌綱多孔菌科栓菌屬毛栓菌。測定了該菌株的Lac酶活和MnP酶活。目前，對木質(zhì)素降解菌的分離篩選已經(jīng)有了很多的報道，參與降解木質(zhì)素的微生物包括細菌、放線菌和真菌，其中真菌是最為重要的一類，且關(guān)于竹林中相關(guān)類型的微生物的研究報道不多，這些篩選到的微生物廣泛的應(yīng)用到，生物制漿、造紙、廢水及污染處理、廢棄物再利用、生物預(yù)處理等方面。本研究篩選到的毛栓菌27-1分泌的木質(zhì)素降解酶系中Lac酶活性較高，在30 ℃，pH 4.5葡萄糖為碳源，麩皮、硝酸銨、酒石酸銨為混合氮源的條件下，Lac酶活達到74.86 U，高于曾祥康[23]從枯朽木中篩選到的毛栓菌SYBC-LZ(漆酶酶活為60.50 U)，由于真菌漆酶是一種多酚氧化酶[24]，能夠催化多種酚類[25]、羧酸、以及甲氧基酚酸的脫甲基反應(yīng)[26]等，可以用于廢水處理、土壤修復、重金屬處理和木質(zhì)素降解等多個方面[25-27]。尤其是近年來雷竹林地由于長期覆蓋經(jīng)營引起的多酚氧化酶活性降低，酚酸類物質(zhì)和重金屬積累等問題[28-29]。篩選到的毛栓菌可以配合一些纖維素降解菌共同施放到覆蓋竹林中，共同促進木質(zhì)素和纖維素的降解，降低林地的C/N比；消除林地重金屬；降低酚酸含量，修復林地土壤。

[1] Lynd L R, Wyman C E, Gerngross T U. Biocommodity engineering[J]. Biotechnology progress, 1999, 15(5): 777-793.

[2] 吳薇，姜訓鵬，呂程序，等．高效木質(zhì)素降解菌的分離篩選[J]．食品科技，2008，3：22-25．

[3] 趙紅霞, 楊建軍, 詹勇. 白腐真菌在秸稈作物資源開發(fā)中的研究[J]. 飼料工業(yè), 2002, 23(11): 40-42.

[4] Beltrame P L, Carniti P, Visciglio A, et al. Fractionation and bioconversion of steam-exploded wheat straw[J]. Bioresource technology, 1992, 39(2): 165-171.

[5] Han Y W, Callihan C D. Cellulose fermentation: effect of substrate pretreatment on microbial growth[J]. Applied Microbiology, 1974, 27(1): 159-165.

[6] 劉江燕，武書彬．稻草和毛竹CO_2超臨界流體萃取脫木質(zhì)素研究燕[J]．北京林業(yè)大學學報，2011，33(2)：96-104．

[7] Wyman C E, Dale B E, Elander R T, et al. Coordinated development of leading biomass pretreatment technologies[J]. Bioresource technology, 2005, 96(18): 1959-1966.

[8] Demirba A. Utilization of lignin degradation products from hazelnut shell via supercritical fluid extraction[J]. Energy sources, 2002, 24(9): 891-897.

[9] 張學俊, 張?zhí)帐|. 超臨界流體萃取原理用于制漿研究[J]. 中國造紙學報, 1995: 77-85.

[10] 晉果果，翁海波，李萍萍，等．高溫木質(zhì)素降解菌Geobacil_省略_J16的篩選及其產(chǎn)酶發(fā)酵性質(zhì)研究[J]．中國農(nóng)學通報，2011，27(8)：334-339．

[11] 李紅亞，李術(shù)娜，王樹香，等．產(chǎn)芽孢木質(zhì)素降解菌MN_8的篩選及其對木質(zhì)素的降解[J]．中國農(nóng)業(yè)科學，2014，47(2)：324-333．

[12] 習興梅, 曾光明, 郁紅艷, 等. 黑曲霉 Aspergillus niger 木質(zhì)纖維素降解能力及產(chǎn)酶研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2007, 26(4): 1506-1511.

[13] Keyser P, Kirk T K, Zeikus J G. Ligninolytic enzyme system of Phanaerochaete chrysosporium: synthesized in the absence of lignin in response to nitrogen starvation[J]. Journal of bacteriology, 1978, 135(3): 790-797.

[14] 張輝．木質(zhì)素降解酶系研究新進展[J]．天津農(nóng)業(yè)科學，2006，12(3)：8-12．

[15] 侯紅漫，周集體，陳麗．白腐菌漆酶特性及異生芳香化合物的降解[J]．林產(chǎn)化學與工業(yè)，2003，23(1)：89-94．

[16] 劉小剛．葡萄枝條木質(zhì)素降解菌的篩選[D]．楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2009：1-51．

[17] 呂聰. 茯苓菌產(chǎn)錳過氧化物酶及其應(yīng)用的研究[D]. 中南林業(yè)科技大學, 2008.

[18] Arora D S, Gill P K. Effects of various media and supplements on laccase production by some white rot fungi[J]. Bioresource Technology, 2001, 77(1): 89-91.

[19] Zunong L Y G P W. NUTRITIONAL REGULATION OF SYNTHESIS OF LIGNIN PEROXIDASE BY PHANEROCHATE CHRYSOSPORIUM ME-446 [J]. Acta Microbiologica Sinica, 1994, 1: 005.

[20] 李娜. 木質(zhì)素降解菌的篩選及其產(chǎn)酶性質(zhì)的研究 [D]. 西北農(nóng)林科技大學, 2008.

[21] 張紀忠. 真菌鑒定手冊[J]. 1990.

[22] 中國真菌志: Flora fungorun sinicorun. Vol. 3, Polyporaceae. 多孔菌科. 第三卷[M]. 科學出版社, 1998.

[23] 曾祥康. 毛栓菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶及其在合成染料脫色中的應(yīng)用[D]. 江南大學, 2012.

[24] 吳晴. 白腐真菌及其漆酶的應(yīng)用研究[J]. 安徽科技, 2010 (3): 47-48.

[25] 王華, 金大勇, 趙建夫. 真菌漆酶及其在環(huán)境污染控制中的應(yīng)用[J]. 環(huán)境科學與技術(shù), 2003, 26(6): 58-60.

[26] 王國棟, 陳曉亞. 漆酶的性質(zhì), 功能, 催化機理和應(yīng)用[J]. 植物學通報, 2003, 20(4): 469-475.

[27] 周雪婷, 張躍華, 羅志文, 等. 真菌漆酶的研究進展及其應(yīng)用前景[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù), 2013, 32(9): 2-4.

[28] 劉國群, 莊舜堯, 孫繡華. 不同種植年限雷竹林土壤微生物, 量和酶活性變化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2012, 40(2): 866-868.

[29] 鄭仁紅. 覆蓋栽培對雷竹林衰退的化感效應(yīng)研究[D]. 北京: 中國林業(yè)科學研究院, 2006.

Separation and Identification of Lignin-degrading Microorganisms from Bamboo Stand Soils

LI Xin-xin， YU Xue-jun， YU Tun， JIANG Yu-jian

(The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A&F University, Lin'an 311300, Zhejiang, China)

Cellulose is the most extensive and abundant renewable resource in nature， being a potentially important biological energy. As the cellulose and hemicelluloses are coated by the lignin, the removal of lignin is the key to efficiently use cellulose. At present, few studies on the separation and identification of lignin-degrading microorganisms from bamboo stand soils have been described. Based on the analysis of discoloration and related enzyme activity of aniline blue and guaiacol medium, an efficient lignin-degrading fungus 27-1, was obtained from the bamboo stand soils in Lin'an and the surrounding area, and identified asTrameteshirsuteby morphological observation and sequence analysis.

Lignin degrading microorganisms; Discoloration; Laccase; Separation and Identification

2015-11-10

浙江省重大推廣工程項目(2012T201)

李新鑫(1989-)，男，碩士研究生，從事竹林培育與利用研究。E-mail：muyelxx@163.com。通信作者：余學軍，男，副研究員，從事竹子栽培與利用研究。E-mail：yuxj@zafu.edu.cn