摘要：二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）是黃酮類化合物合成途徑中的重要酶之一。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)注冊的植物DFR基因核酸以及氨基酸序列，以擬南芥DFR為主，對其組成成分、疏水性/親水性、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)等方面進行分析及預測，結(jié)果表明：擬南芥等植物DFR不具有明顯的疏水或親水區(qū)域；主要構(gòu)件為α-螺旋和不規(guī)則卷曲；植物DFR在高級結(jié)構(gòu)、活性位點等方面具有較高的保守性。

關(guān)鍵詞：二氫黃酮醇4-還原酶；生物信息學；黃酮類合成

中圖分類號： Q554文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0030-04

收稿日期：2013-09-16

基金項目：牡丹江師范學院青年學術(shù)骨干項目（編號：G201210）。

作者簡介：郝愛平（1979—），女，山東莘縣人，碩士，講師，研究方向為分子生物學。E-mail：swxhap@126.com。隨著人們生活水平的提高，對花卉的需求量也越來越大，花卉市場有著越來越廣闊的發(fā)展前景。花色和果色是植物的重要遺傳性，決定花卉和果實的商品性和價值性[1]?；ɑ艿钠贩N和色澤是育種中最為關(guān)鍵的因素，傳統(tǒng)的育種技術(shù)選育稀有花色品種的難度很大，不斷成熟的基因工程育種為花卉新品種的選育開辟了一條有效的途徑[2]。二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是花青素合成過程中的關(guān)鍵酶，決定植物的顏色、葉色和果色。本研究運用生物信息學的方法，以擬南芥DFR為重點，對葡萄、小麥、玉米、大豆等植物的DFR基因及其推導的氨基酸序列的組成、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征及功能等方面進行預測和分析，以期為今后進一步深入開展該酶的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。1材料與方法

1.1材料

數(shù)據(jù)資料來源于National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已注冊的植物二氫黃酮醇 4-還原酶的核酸序列及其對應(yīng)的氨基酸序列：葡萄（XP_002281858.1）、擬南芥（NP_199094.1）、玉米（NP_001152467.1）、小麥（CAW59975.1）、大豆（NP_001238612.1）。

1.2方法

根據(jù)DNAStar、ClustalW軟件及相關(guān)網(wǎng)站提供的生物信息學軟件分析核酸、氨基酸序列的組成、理化性質(zhì)及親水性/疏水性、蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。表1軟件名稱和地址

名稱地址Protparamhttp：//web.expasy.org/protparamBlasthttp：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiProtscalehttp：//web.expasy.org/protscale/SOPhttp：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.htmlORFhttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/SWISS-modelhttp：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html

2結(jié)果與分析

2.1不同植物DFR基因蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析用DNAStar軟件分析DFR基因核苷酸序列及氨基酸序列，結(jié)果表明：不同植物的DFR的基本組成存在一定的差異，擬南芥DFR的ORF為1149bp，推導氨基酸分子量表2不同植物DFR基因編碼氨基酸序列的組成成分及理化性質(zhì)分析

物種ORF

（bp）推導氨基

酸殘基數(shù)（個）分子量

（ku）pI氨基酸比例（%）酸性氨基酸堿性氨基酸疏水性氨基酸極性氨基酸蛋白不穩(wěn)定性

系數(shù)擬南芥1 14938245.875.3513.0910.7323.9827.2337.63葡萄1 12837541.936.3311.7310.9335.4725.0739.92玉米1 07435738.795.4812.3210.0838.1020.7335.53大豆1 04434738.857.5412.6812.9735.4521.3339.44小麥1 17339062.676.1411.7910.5137.6920.7734.57

為45.87 ku，pI為5.35；小麥的ORF長度最長（1 173 bp），分子量最大（62.67 ku）；大豆的pI最大，為754，擬南芥的pI最小， 為5.35。擬南芥、葡萄、玉米、小麥DFR中酸性氨基酸含量要高于堿性氨基酸，而大豆的DFR堿性氨基酸含量微高于酸性氨基酸，這5種植物DFR都屬于相對穩(wěn)定類的蛋白質(zhì)。

2.2不同植物DFR基因核酸及氨基酸序列比對分析

用Blast程序?qū)M南芥DFR的核酸及氨基酸序列進行同源性比對，結(jié)果表明擬南芥的核酸序列與紫菜薹（gb|ABQ81927.1）、薺菜（gb|EOA14701.1）、夏堇（dbj|BAJ16335.1）、美洲山楊（gb|AAN63056.1）、彩葉草（gb|ABP57077.1）、紅花油菜（gb|AFC37249.1）、毛果楊（ref|XP_002307667.1）、陸地棉（gb|ACV72642.1）、芍藥（gb|AFI71899.1）、黑核桃（emb|CAB94914.1）同源性較高，分別為60%、93%、61%、54%、74%、68%、54%、66%、66%、67%。

用Clustal W程序?qū)M南芥、葡萄、玉米、小麥、大豆5種氨基酸序列進行了多序列的比對，比對結(jié)果表明，植物DFR的N-端區(qū)域并沒有同源性，而在這個區(qū)域后是高度同源的區(qū)域（即DFR的功能區(qū)段）。擬南芥等植物DFR在活性位點上表現(xiàn)的非常保守，推測不同植物的DFR具有很高的同源性。

2.3DFR蛋白疏水性/親水性預測和分析

自然界中存在的20種常見氨基酸都具有疏水/親水性，它們的排列順序和側(cè)鏈基團的互相作用共同決定了蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)，通過對蛋白質(zhì)的疏水性/親水性進行預測和分析，可以為蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)預測提供一些理論上的參考。用ProtScale對擬南芥、葡萄、小麥、大豆、玉米5種植物的DFR蛋白進行疏水性/親水性預測，結(jié)果見圖2至圖6。

圖2表明：擬南芥的多肽鏈在第139位上具有最低分值-2.447，在第188位上具有最高的分值2.500，即在多肽鏈上第139位親水性最強、第188位疏水性最強，但在總體上多肽鏈并沒有過于明顯的親水或疏水性區(qū)域。對葡萄、小麥、大豆、玉米的DFR蛋白的疏水性/親水性進行預測也得到了類似的結(jié)果。因此可以推斷，植物DFR中不存在特別明顯的親水或疏水的區(qū)域。

2.4DFR蛋白二級及三級結(jié)構(gòu)預測和分析

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)即氨基酸殘基的排列順序決定了其高級結(jié)構(gòu)，并且它的生物學功能又是由高級結(jié)構(gòu)決定的。對蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的預測和分析，有助于理解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性。使用SOPMA對擬南芥、小麥、葡萄、大豆的DFR蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行了預測，結(jié)果見圖7。

表3表明，擬南芥DFR的二級結(jié)構(gòu)由36.65%的α-螺旋、14.14%的延伸鏈、6.81%的β-折疊以及42.41%的不規(guī)則卷曲構(gòu)成，α-螺旋和不規(guī)則卷曲為最主要的元件。大豆、葡萄、小麥、玉米的二級結(jié)構(gòu)與擬南芥基本相似，三級結(jié)構(gòu)模型預測結(jié)果表明：擬南芥、大豆、小麥DFR空間結(jié)構(gòu)十分相似，推測植物的DFR結(jié)構(gòu)比較保守。

3討論

花色是衡量觀賞植物的重要標準之一，改變花色一直是轉(zhuǎn)基因花卉研究比較熱門的問題?；ㄉ饕怯深慄S酮（flavonoid）、類胡蘿卜素（carotenoid）和甜菜色素（betalain）三大色素決定[3]。黃酮類化合物是一類以C6—C3—C6碳骨架為

表35種植物預測的DFR蛋白二級結(jié)構(gòu)構(gòu)成比例

物種α-螺旋

（%）延伸區(qū)

（%）β-折疊

（%）不規(guī)則卷曲

（%）擬南芥36.6514.146.8142.41大豆35.4716.538.8039.20葡萄41.0316.156.4136.41小麥40.6313.266.9239.19玉米37.5413.737.5641.18

基本組成的天然化合物，分布廣泛，種類繁多，結(jié)構(gòu)復雜。據(jù)統(tǒng)計，植物體內(nèi)的黃酮類化合物多達8 000余種，不僅能夠參與花色的形成、花粉的發(fā)育，在雄性育性、細胞周期的調(diào)節(jié)和植物激素的傳送等生理功能方面也有重要作用，還具有抗炎、抗癌、抗氧化、保護心腦血管系統(tǒng)等多種藥理作用[4-6]。花青素是一類重要的黃酮類化合物，廣泛存在于被子植物，是植物花、葉和果實紅色、紫色、藍色形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。二氫黃酮醇4-還原酶是花色素苷合成過程中的第一個至關(guān)重要的酶，它是將二氫堪非醇（dihydrokaempferol，DHK）、二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）、二氫楊梅黃酮（dihydromyricetin，DNM）等作為反應(yīng)的底物，在輔助因子NADPH的作用下可以把第4位的羰基轉(zhuǎn)換還原為羥基，以轉(zhuǎn)化生成相對應(yīng)的不穩(wěn)定的無色花青苷元，然后這些生成的無色花青苷元在花色素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）和類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)化酶（flavonoid 3-O-glucosyltransferase，3GT）催化下分別形成花青素（紅色粉紅色）、花葵素（橙色磚紅色）、花翠素（藍紫色），與花色的產(chǎn)生直接相關(guān)[7]。

DFR屬于NADPH依賴性的短鏈DFR還原酶超家族，最早于1985年由OReilly等從玉米（Zea mays）和金魚草（Antirrhinum majus）中分離出來。隨后，Beld等又在1989年以部分金魚草DFR表型突變基因為探針分離了矮牽牛（Petunia hybrida）DFR基因。至今，通過同源克隆等方法，已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、蘭花（Bromheadia finlaysoniana）、山茶（Camellia sinensis）、番茄（Lycopersicon esculentum）、水稻（Oryza sativa）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）、玫瑰（Rose rugosa）、香石竹（Dianthus caryophyllus）、百合（Lilium brownii var. viridulum）等多種植物中成功分離出了DFR基因[8]。

經(jīng)過科學家們研究發(fā)現(xiàn)，DFR基因的全長包括5′、3′非編碼區(qū)和1個開放閱讀框，由于來源于多種不同的植物，造成DFR基因的非編碼區(qū)長度差異都比較大，致使它們的全長從1 272 bp到4 467 bp不等，開放閱讀框（ORF）長度差異較小，從1 044 bp到1 341 bp不等，ORF的起始密碼子均為ATG，終止密碼子為TAG、TGA或TAA，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)從347個到446個不等，DFR為酸性蛋白，含量最豐富的氨基酸基本均為Ala、Glu、Leu、Lys、Val，并且都不含有Pyl和Sec，屬于穩(wěn)定類蛋白質(zhì)。

經(jīng)過研究以后發(fā)現(xiàn)，氨基酸種類是由DFR確定的，不同物種的DFR和底物結(jié)合區(qū)里面的134個氨基酸殘基是高度保守的，因而直接決定了底物特異性。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)：多種植物DFR的第134位氨基酸殘基，是天冬酰胺殘基（Asn），因此被稱為Asn型DFR；第2類DFR與矮牽牛和蘭花（Bromheadia finlaysoniana）的DFR一樣，不能有效地將DHK還原為無色花葵素，它們在第134位上面都有1個天冬氨酸殘基（Asp），因此這一類DFR也被稱為Asp型DFR；第3類DFR的第134位氨基酸殘基既不是天冬酰胺也不是天冬氨酸，因此被命名為非Asn/Asp型DFR[9]。

近些年來作為一種天然的食用素，花色素苷具有安全、無毒、資源豐富的特點，并具有一定的藥理作用和應(yīng)用價值。國內(nèi)外對各種植物花色素苷類物質(zhì)進行了大量研究，但花色素苷類色素的市場還遠未飽和，仍然有著很大的發(fā)展空間[10]。

參考文獻：

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近些年來作為一種天然的食用素，花色素苷具有安全、無毒、資源豐富的特點，并具有一定的藥理作用和應(yīng)用價值。國內(nèi)外對各種植物花色素苷類物質(zhì)進行了大量研究，但花色素苷類色素的市場還遠未飽和，仍然有著很大的發(fā)展空間[10]。

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近些年來作為一種天然的食用素，花色素苷具有安全、無毒、資源豐富的特點，并具有一定的藥理作用和應(yīng)用價值。國內(nèi)外對各種植物花色素苷類物質(zhì)進行了大量研究，但花色素苷類色素的市場還遠未飽和，仍然有著很大的發(fā)展空間[10]。

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