陳海英 蔡阿明 張趁華

1.福建莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 莆田 351100 2.福建莆田學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，福建 莆田 351100

CGRP來(lái)源于感覺(jué)神經(jīng)，主要分布在骨骺，骨膜及骨髓等骨組織代謝活躍的地方。這些神經(jīng)肽被認(rèn)為是間充質(zhì)細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞有絲分裂或骨細(xì)胞功能的局部調(diào)節(jié)因子，具備調(diào)節(jié)骨內(nèi)微循環(huán)、對(duì)骨組織雙向調(diào)控的作用[1]。CGRP是目前已知的作用廣泛的內(nèi)源性舒血管物質(zhì)，可以減少自由基產(chǎn)生、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[2]。束縛應(yīng)激作為一種非損傷性刺激，能夠較好地模擬人類生活中“無(wú)法控制”的擁擠、挫折等生活狀態(tài)，束縛應(yīng)激對(duì)機(jī)體各大系統(tǒng)包括骨代謝均產(chǎn)生較大的影響。為模擬人類在生活、工作中處于無(wú)法控制的緊張狀態(tài)而出現(xiàn)的對(duì)身心的損害而對(duì)動(dòng)物進(jìn)行定時(shí)和較低強(qiáng)度的束縛，本研究采用特定的束縛工具，應(yīng)用免疫組化染色觀察軟骨下骨組織中神經(jīng)肽CGRP 的陽(yáng)性表達(dá)，深層次探討CGRP 在束縛應(yīng)激對(duì)骨代謝作用。

1 材料和方法

1.1 大鼠束縛應(yīng)激模型的建立

束縛應(yīng)激造模在王逸基礎(chǔ)上進(jìn)行改良[3]，包括束縛固定、孤養(yǎng)以及短時(shí)間禁食禁水，其中以束縛為主，制束縛應(yīng)激模型。繩栓術(shù)后孤養(yǎng)。大鼠束縛應(yīng)激(即將大鼠固定在特定束縛固定籠中，大鼠可自由呼吸但不能活動(dòng)，每天2 h，分別持續(xù)7 d、14 d、21 d。束縛時(shí)間在08:00-18:00，不影響大鼠正常的晝夜節(jié)律。束縛期間禁食、禁水，尚不影響大鼠機(jī)體功能。分組為正常組、束縛A組、束縛B組、束縛C組。

1.2 外周血處理

大鼠麻醉后，心臟取血4 mL，置于EP管(10% 依地酸二鈉30 μL，抑肽酶2000U)?；靹蚝箅x心(4℃, 4500 r·min-1, 10 min)，分離血漿。取血漿置于EP管，-70℃冰箱保存。

1.3 軟骨下骨組織計(jì)量學(xué)指標(biāo)比較

25%的烏拉坦麻醉后取股骨，4%多聚甲醛固定24-36 h，脫水脫脂，再以10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，石蠟包埋(冠狀面)，酸處理，烘干，用多聚賴氨酸包被干燥。切片(德國(guó)Leica RM2015)。HE染色，顯微鏡(日本Olympus BX51T-PHD-J11)觀察，鏡下觀察各組軟骨下骨組織中各、骨陷窩、骨小梁。每個(gè)切片隨機(jī)選5個(gè)高倍視野，鏡下定位生長(zhǎng)板下的軟骨下區(qū)統(tǒng)計(jì)出每一視野內(nèi)的空缺骨陷窩數(shù)，求出空缺骨陷窩所占的百分?jǐn)?shù)。

1.4 CGRP的放射免疫測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照操作試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。將200 uL CGRP標(biāo)準(zhǔn)品(包括20、60、150、300、600及1200 pg·mL-1)待測(cè)樣品先后加入100 uL CGRP抗血清，100 uL125 I-CGRP,免疫分離劑,分離出抗原抗體復(fù)合物。3500 r·min-1離心25 min,取上清液,計(jì)數(shù)器測(cè)定復(fù)合物的放射性(B),計(jì)算各標(biāo)誰(shuí)管的結(jié)合率(B/B0%),GC-1200型Y放射免疫計(jì)數(shù)器計(jì)算機(jī)可自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并給出樣品濃度,濃度單位為pg·m L-1。得到各樣品CGRP濃度后,再換算成每毫升血漿或每毫克組織CGRP的含量。

1.5 CGRP的免疫組化檢測(cè)

每組隨機(jī)選取6只大鼠，麻醉處死，取軟骨下骨，多聚甲醛固定， EDTA脫鈣處理，切片。按照SABC試劑盒(博士德中國(guó))說(shuō)明進(jìn)行，加入羊抗兔CGRP單克隆抗體。FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，以 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，應(yīng)用 Image-ProPlus 圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值(IOD)，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，觀察拍照，測(cè)定陽(yáng)性物質(zhì)IOD值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 軟骨下骨組織觀察

HE染色可見(jiàn)正常組軟骨下骨骨小梁粗大稍厚(初級(jí)骨小梁)，排列整齊有序，骨細(xì)胞胞質(zhì)細(xì)密，核呈圓形或卵圓形，小梁間為骨髓組織(圖1)。A組軟骨下骨結(jié)構(gòu)尚無(wú)明顯變化(圖2)。B組可見(jiàn)軟骨下區(qū)小梁變薄，骨基質(zhì)染色淺，可見(jiàn)少量空缺骨陷窩(圖3)。C組軟骨下骨骨小梁變細(xì)變薄，不規(guī)則彎曲、間距增大，結(jié)構(gòu)紊亂，空骨陷窩明顯增多，骨髓腔普遍增大，造血組織明顯減少(圖4)。

2.2 空缺骨陷窩測(cè)定統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

A組的軟骨下骨空缺骨陷窩數(shù)與CON組(3.70±1.14)比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B、C組的軟骨下骨組織空缺骨陷窩數(shù)(9.58±0.38，12.21±2.02，P<0.01)均高于正常組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖5)。

2.3 外周血CGRP含量

各組外周血CGRP與CON組含量(0.337±0.043)(pg·mL-1)比較：A組的外周血CGRP含量(0.370±0.052)沒(méi)有明顯變化，B組的外周血CGRP含量(0.288±0.035)也沒(méi)有顯著差異，C組的外周血CGRP含量(0.189±0.071)表達(dá)明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)(圖6)。

2.4 免疫組化結(jié)果檢測(cè)

造模后時(shí)，CON組軟骨下骨組織活躍，CGRP的陽(yáng)性表達(dá)在軟骨下骨組織，而成熟骨細(xì)胞中未見(jiàn)明顯著色(圖7)，A組與CON組比較CGRP呈陽(yáng)性表達(dá)部位大致相同，主要的CGRP的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8)。B組、C組的軟骨下骨組織CGRP 的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)(2.37±0.38.1.75±0.41，P<0.01)均低于正常對(duì)照組(圖9) (圖10)，含量明顯降低(P<0.01) (圖11)。

3 討論

圖1 正常組軟骨下骨組織排列整齊,形態(tài)正常，HE法，標(biāo)尺示20μm;圖2 A組軟骨下骨組織形態(tài)正常，HE法，標(biāo)尺示20μm;圖3 B組可見(jiàn)軟骨下骨小梁變薄， HE法，標(biāo)尺示20μm;圖4 C組軟骨下骨小梁無(wú)序排列，空缺骨陷窩.明顯增多，HE法，標(biāo)尺示20μmFig.1 In normal group, cartilage bone showed normal morphology.HE method, Bar=20μm; Fig.2 Normal morphology of cartilage bone in group A.HE method, Bar=20μm; Fig.3 Trabecular bone thinning in cartilage bone of B group, HE method, Bar=20μm; Fig.4 Trabecular bone arrangement disordered and empty bone lacunae increased in cartilage bone of group C, HE method, Bar=20 μm.

圖5 各組軟骨下骨空缺骨陷窩數(shù)，*P<0.01Fig.5 The namber of empty bone lacunae in cartilage bone of every group *P<0.01

圖6 各組外周血CGRP的含量，*P<0.01Fig.6 Concentration of CGRP in plasma,*P<0.01

圖7 正常組軟骨下骨組織CGRP陽(yáng)性表達(dá)，免疫組化法，標(biāo)尺示20 μm；圖8 A組軟骨下骨組織7d周后CGRP 陽(yáng)性表達(dá)，免疫組化法，標(biāo)尺示20 μm；圖9 B組軟骨下骨組織14d周后 CGRP 陽(yáng)性表達(dá)，免疫組化法，標(biāo)尺示20μm；圖10 C組軟骨下骨組織21d周后 CGRP陽(yáng)性表達(dá)，免疫組化法，標(biāo)尺示20μmFig.7 Positive expression of CGRP in cartilage bone of normal group, SABC method, Bar=20μm; Fig.8 Positive expression of CGRP in cartilage bone in group A at 7d, SABC method, Bar=20 μm; Fig.9 Positive expression of CGRP in cartilage bone in group B at 14d, SABC method, Bar=20 μm; Fig.10 Positive expression of CGRP in cartilage bone in group C at 21d, SABC method, Bar=20μm

圖11 不同組別CGRP陽(yáng)性表達(dá)的IOD值，*P<0.01Fig.11 Comparison of IOD value of CGEP,*P<0.01

近年來(lái)已明確神經(jīng)肽類可調(diào)節(jié)骨重建再生[4]，CGRP是目前已知神經(jīng)肽類中與成骨關(guān)系最密切、在骨組織中分布最為廣泛的一種，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表達(dá)CGRP受體是CGRP調(diào)控功能存在的有力證據(jù)，Kawase 等證實(shí)每個(gè)成骨細(xì)胞有3000～3500個(gè)CGRP受體[5]。骨組織中含有豐富的神經(jīng)纖維，骨是神經(jīng)系統(tǒng)的靶器官, 有研究證實(shí)CGRP作為一種具有多種生物活性的神經(jīng)肽，能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的活性，刺激骨形成。CGRP以不同密度廣泛分布于骨組織中，在骨代謝活躍的區(qū)域，CGRP分布密度較高。皮質(zhì)骨內(nèi)CGRP 密度最低，軟骨下骨，骨膜、骨髓和骨骺?jī)?nèi)等骨代謝活躍的區(qū)域CGRP分布均明顯較骨干豐富[6]，通過(guò)提高成骨細(xì)胞活性、抑制破骨細(xì)胞骨吸收作用進(jìn)而促進(jìn)骨再生[7]。骨組織神經(jīng)主要通過(guò)其神經(jīng)末梢分泌的多種神經(jīng)肽作用于骨組織。CGRP合成于神經(jīng)節(jié)內(nèi)的感覺(jué)神經(jīng)元，并通過(guò)軸漿運(yùn)輸傳遞到達(dá)感覺(jué)神經(jīng)末梢。隨著骨的發(fā)育周圍神經(jīng)逐漸長(zhǎng)入新組織，其中以CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維居多[8]。Jimenez-Andrade 等采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的方法發(fā)現(xiàn)人成骨細(xì)胞表面有CGRP受體的mRNA表達(dá)[9]；Han N等認(rèn)為CGRP對(duì)成骨細(xì)胞增殖具有明顯促進(jìn)作用[10]，CGRP能夠調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、活性，抑制骨質(zhì)吸收；還能作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨質(zhì)形成，CGRP間接地參與骨折愈合過(guò)程的調(diào)節(jié)[11]。

束縛應(yīng)激能引起海馬錐體神經(jīng)元萎縮?？山档湍X源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，直接抑制了神經(jīng)元的生存、分化和生長(zhǎng)等能力，出現(xiàn)神經(jīng)元的退行性病變[12]。而由于CGRP的釋放受到高級(jí)中樞的調(diào)控，可能與局部刺激及由此引起的軸突反射有關(guān)[13]，那么由于束縛應(yīng)激狀態(tài)下出現(xiàn)機(jī)體的神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂，下丘腦調(diào)控垂體等內(nèi)分泌腺體功能障礙[14]，導(dǎo)致CGRP在外周神經(jīng)中的合成受到抑制。另束縛應(yīng)激狀態(tài)下肢體的骨代謝活躍區(qū)內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物含量升高和氧自由基產(chǎn)生增加等多方面改變[15]，抑制了成骨過(guò)程，而長(zhǎng)期的慢性應(yīng)激則使機(jī)體抗氧化能力下降，失去對(duì)機(jī)體束縛應(yīng)激的調(diào)節(jié)能力，于是在組織上就看到軟骨下骨再生修復(fù)障礙，骨代謝失衡，并呈現(xiàn)骨衰退狀態(tài)[16]。另應(yīng)激所引起的機(jī)體CGRP改變可以刺激成骨細(xì)胞自分泌IGF-I，間接地影響成骨細(xì)胞的活性，影響成骨效應(yīng)[13]。