李永賢 張順聰 粱德 楊志東 郭丹青 莫國(guó)業(yè) 李大星 馮蓬勃 唐永超 莫凌

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510407

骨質(zhì)疏松癥是一種中老年人常見(jiàn)的、多發(fā)的全身性骨代謝性疾病[1，2]。骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折作為其最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響中老年人的生存質(zhì)量及生活水平。因此，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行研究具有重要的意義。從目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道來(lái)看，主要以研究原發(fā)性骨質(zhì)疏松為主。造模方法主要有三種，去勢(shì)法(摘除卵巢或睪丸)，維甲酸誘導(dǎo)法和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)法[3]。而以摘除雙側(cè)卵巢法制造骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型較為常見(jiàn)，但是對(duì)于選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠的鼠齡、以及造模時(shí)間仍然存在較大的爭(zhēng)議。本文通過(guò)使用切除卵巢法作用于12月齡雌性大鼠，并飼養(yǎng)觀察時(shí)間為1個(gè)月，最后通過(guò)檢測(cè)其骨密度以及了解骨小梁情況，以探討切除雙側(cè)卵巢法一個(gè)月對(duì)12月齡雌性大鼠骨質(zhì)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

12月齡雌性SD大鼠，SPF級(jí)，400±20 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：NO.44005800001890。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心室內(nèi)(SYXK(粵)2013—0034)。大鼠維持飼料購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，并預(yù)先經(jīng)輻照消毒處理。飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室的大鼠分為實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組，各3只12月齡雌性SD大鼠，并進(jìn)行稱重與編號(hào)。

1.2 方法

1.2.1制造動(dòng)物模型：實(shí)驗(yàn)組操作方法：配制10%水合氯醛溶液，按4 ml/kg劑量腹腔注射麻醉；摘除雙側(cè)卵巢，術(shù)后連續(xù)3 d預(yù)防性使用青霉素抗感染[im，20萬(wàn)U/(只·d)]。

假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)操作方法：用相同的方法麻醉、固定、消毒后，切除與卵巢重量相同的皮下脂肪組織術(shù)后連續(xù)3d預(yù)防性使用青霉素抗感染(im，20萬(wàn)U/(只·d)。

1.2.2取骨與骨密度測(cè)量：造模一個(gè)月后，將各組大鼠用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，隨后從腹部切口，取出全部椎體骨，切下第三椎體用于骨密度的檢查，其余椎體骨用甲醛溶液保存起來(lái)。然后取下雙側(cè)的股骨和脛骨，左側(cè)股骨用于骨密度檢查，其余用甲醛溶液保存起來(lái)。

骨密度檢查的設(shè)備為廣州軍區(qū)總醫(yī)院骨科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的Micro-CT，設(shè)備編號(hào)為EWK-149，規(guī)格型號(hào)為L(zhǎng)CT200。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMD檢測(cè)結(jié)果

對(duì)12月齡雌性大鼠使用切除卵巢法并飼養(yǎng)觀察時(shí)間為一個(gè)月后實(shí)驗(yàn)組腰3椎體皮質(zhì)骨BMD相對(duì)于假手術(shù)組有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而實(shí)驗(yàn)組腰3椎體松質(zhì)骨BMD以及腰3椎體總體BMD卻有所上升，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)股骨相對(duì)于假手術(shù)組其皮質(zhì)骨BMD、松質(zhì)骨BMD、總體BMD均有所下降，但經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

組別n皮質(zhì)骨BMD松質(zhì)骨BMD總體BMD假手術(shù)組3904.53±60.12486.37±139.21604.97±129.92實(shí)驗(yàn)組3871.27±36.24551.47± 51.12657.33± 50.44

組別n皮質(zhì)骨BMD松質(zhì)骨BMD總體BMD假手術(shù)組31098.97±70.66551.20±36.38701.10±82.22實(shí)驗(yàn)組31057.23±21.99528.00±10.05666.47± 8.58

2.2 骨小梁相關(guān)情況

假手術(shù)組中12月齡雌性大鼠左側(cè)股骨頭端骨小梁情況，其骨小梁BMD為728.6 mg/cm3，骨小梁較為密集；實(shí)驗(yàn)組中12月齡雌性大鼠左側(cè)股骨頭端骨小梁情況，其骨小梁BMD為699.6 mg/cm3，提示實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)過(guò)切除雙側(cè)卵巢1個(gè)月后骨小梁密度有所下降。從表3數(shù)據(jù)也可看出實(shí)驗(yàn)組的腰椎骨小梁、股骨骨小梁BMD與假手術(shù)組腰椎骨小梁、股骨骨小梁BMD相比，均有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組別n腰椎骨小梁股骨骨小梁假手術(shù)組3630.50±65.82707.60±25.17實(shí)驗(yàn)組 3621.57±38.33701.13±14.96

3 討論

骨質(zhì)疏松時(shí)骨的脆性增加，骨量減少，骨的生物力學(xué)強(qiáng)度明顯改變，應(yīng)力強(qiáng)度降低。切除大鼠卵巢法制造絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型于1969年Saville建立[4]，為美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的最佳模型[5]。其優(yōu)點(diǎn)在于，造模因素單一、模型確定、重復(fù)性好。此外，摘除雙側(cè)卵巢后，體內(nèi)雌激素缺乏，其對(duì)破骨細(xì)胞功能的抑制減弱，致破骨細(xì)胞的功能活躍，成骨細(xì)胞功能呈代償性增強(qiáng)，但總體趨勢(shì)為破骨作用大于成骨作用，造成骨量丟失，與婦女絕經(jīng)后引起骨質(zhì)疏松癥有相似性[6]。但吳子祥[7]等人研究認(rèn)為這種去勢(shì)模型存在一定的局限性：卵巢切除模型能引起體內(nèi)雌激素水平下降，但與臨床實(shí)際不符，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者雖然卵巢功能低下，但其卵巢間質(zhì)細(xì)胞在絕經(jīng)后仍有一定的內(nèi)分泌功能。此外，Peng[8]等人研究認(rèn)為造模過(guò)程中，動(dòng)物體質(zhì)量因卵巢切除會(huì)有所增加，這對(duì)骨量減少有部分保護(hù)作用。

一般來(lái)說(shuō)，大鼠壽命2.5-3.0年，1.7年左右才進(jìn)入老年期，而大鼠6月齡以后，股骨骨密度的變化已極小，到12月齡時(shí)，各項(xiàng)骨參數(shù)均已達(dá)平臺(tái)水平，人類的骨質(zhì)疏松多發(fā)生在中年后期，故采用中老年大鼠可以復(fù)制出較為符合臨床特征的動(dòng)物模型[9]。目前，構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型時(shí)對(duì)造模持續(xù)時(shí)間尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)多使用3～6月齡未孕雌性大鼠，研究持續(xù)時(shí)間多為2～3月[10]。唐存貴[11]等人研究發(fā)現(xiàn)3月齡和6月齡大鼠去卵巢6個(gè)月,均可發(fā)生骨質(zhì)疏松癥。郭峰[12]等人通過(guò)切除6月齡大鼠卵巢，研究發(fā)現(xiàn)建模后2至3個(gè)月去卵巢組骨礦密度顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)。不難發(fā)現(xiàn)對(duì)不同月齡的大鼠進(jìn)行去勢(shì)實(shí)驗(yàn)，其造模持續(xù)時(shí)間也不相同，所以關(guān)于造模持續(xù)時(shí)間仍然存在爭(zhēng)議，這也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素之一。需要對(duì)不同月齡大鼠進(jìn)行去勢(shì)實(shí)驗(yàn)，并定期檢測(cè)骨質(zhì)疏松相關(guān)參數(shù)，才能確定合適的造模持續(xù)時(shí)間。當(dāng)然這并不是唯一的影響因素，大鼠的喂養(yǎng)及飼養(yǎng)環(huán)境等因素也會(huì)影響造模持續(xù)時(shí)間。

文獻(xiàn)中關(guān)于造模后測(cè)量骨密度所選擇的部位的討論不多，在動(dòng)物研究中，Wang[13]等人建議用第四節(jié)腰椎和股骨頸作為研究部位。有研究認(rèn)為手術(shù)后雌性大鼠在骨質(zhì)疏松性骨折和骨量減少部位上也表現(xiàn)出與人類很大的相似性[14]。骨質(zhì)疏松骨折常見(jiàn)部位是脊柱、髖部、橈骨遠(yuǎn)端和肱骨近端。目前國(guó)內(nèi)外均以 DXA 骨密度儀檢查的中軸骨骨密度值，即腰椎L1-L4，股骨頸，全髖 BMD 作為骨質(zhì)疏松診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究選取了實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組大鼠的第3腰椎和左側(cè)股骨進(jìn)行Micro-CT檢測(cè)，以了解其骨密度、骨小梁相關(guān)情況。Micro-CT是一種分辨率更高的掃描技術(shù)，可以如實(shí)反映骨骼內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)，得到較精確的結(jié)構(gòu)參數(shù)。

本研究顯示，實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組對(duì)比，腰3椎體、左側(cè)股骨以及骨小梁BMD有所下降，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。故對(duì)12月齡雌性大鼠切除雙側(cè)卵巢法并造模持續(xù)時(shí)間只為1個(gè)月難以制造出骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。通過(guò)切除雌性大鼠雙側(cè)卵巢法而制造骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型雖然并不復(fù)雜,但選擇適合月齡的大鼠、掌握好恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間及對(duì)不同部位骨密度的測(cè)定對(duì)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型制作的成功極為重要,可最大限度的提高效率。有研究認(rèn)為，手術(shù)作為一種創(chuàng)傷，引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，從而影響相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)量，下一步的研究勢(shì)必要檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo)，這將對(duì)探討治療骨質(zhì)疏松的機(jī)理具有重要意義。