崔玲

比較3種不同儲(chǔ)存條件對(duì)純鈦SLA表面生物學(xué)性能的影響*

崔玲①

【摘要】目的：比較3種不同儲(chǔ)存條件對(duì)純鈦SLA表面生物學(xué)性能的影響。方法：采用噴砂加酸蝕的方法在商用二級(jí)純鈦鈦片上制備SLA表面，并將其置于3種不同環(huán)境中儲(chǔ)存不同的時(shí)間，分組如下：Ⅰ組鈦片為常溫常壓保存；Ⅱ組鈦片為真空保存；Ⅲ組鈦片NaCl溶液中保存。分別對(duì)不同組別鈦片的理化性質(zhì)、生物活性進(jìn)行比較。結(jié)果：三組之中，Ⅲ組中的純鈦SLA表面表面自由能、蛋白質(zhì)吸附率、MG63成骨細(xì)胞的黏附、增殖、ALP活性及表面礦化效果均為最佳，Ⅰ組中的純鈦SLA表面最容易受到C元素的污染，理化性能及生物活性均明顯下降。結(jié)論：不同儲(chǔ)存條件對(duì)純鈦SLA表面的理化性質(zhì)、生物活性具有明顯的影響。將處理后的鈦片置于NaCl溶液中有利于降低C污染，并促進(jìn)鈦片表面的蛋白質(zhì)吸附、細(xì)胞黏附、增殖與分化。

【關(guān)鍵詞】?jī)?chǔ)存條件； 純鈦SLA表面； 表面理化性能； 生物活性；

First-author’s address：The Eighth People’s Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510440，China

隨著人們對(duì)口腔健康重視程度的不斷提高，人工種植牙在口腔修復(fù)中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。純鈦因其良好的穩(wěn)定性、生物相容性、機(jī)械性能成為目前臨床最常使用的種植體材料［1］。但其經(jīng)生物活化后會(huì)隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)老化現(xiàn)象，選擇合適的保存方法延緩甚至組織老化的發(fā)生直接影響到種植牙修復(fù)的成功率［2］。本文通過(guò)分析不同保存方法下純鈦表面理化性能與生物活性的變化情況，探討最佳保存方法，具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取將商用二級(jí)純鈦片作為實(shí)驗(yàn)材料，并將其切割成15 mm×15 cm×1.5 mm的鈦片。經(jīng)SiC防水砂紙打磨拋光后，采用Al2O3顆粒進(jìn)行噴砂，H2SO4/HCl混合酸進(jìn)行酸蝕處理，獲得純鈦SLA表面。經(jīng)超聲清洗、干燥、紫外線消毒等一系列方法處理后，按照預(yù)定設(shè)計(jì)儲(chǔ)存于3種不同的條件下：Ⅰ組鈦片為常溫常壓密封保存；Ⅱ組鈦片為真空保存；Ⅲ組鈦片保存在NaCl溶液中。

1.2 方法

1.2.1 不同儲(chǔ)存條件下鈦片的理化性質(zhì)變化情況 將三組鈦片在不同保存方式下保存3、14、28 d后，每組隨機(jī)抽取3片進(jìn)行鈦片表明理化性能分析。在超高真空的環(huán)境下，通過(guò)掃描電鏡與X線光電子能譜儀分別對(duì)各組鈦片的表面形貌、表面元素構(gòu)成進(jìn)行觀察并分析。然后，通過(guò)表面粗糙度測(cè)量?jī)x分析不同保存方式和保存時(shí)間下鈦片的表面粗糙度，以利于鈦片表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的分析。再對(duì)不同組別鈦片在2 μL ddH2O中的表面接觸面積進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 不同儲(chǔ)存條件下鈦片的生物活性變化情況

1.2.2.1 蛋白質(zhì)吸附情況 選擇牛血清白蛋白作為模型蛋白，并將300 μL濃度為1 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到不同組別鈦片表面，在37 ℃條件下孵育1 h，棄去未吸附的蛋白液后，將其與微喹啉二甲酸繼續(xù)混合并在相同條件下孵育0.5 h。在562 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定OD值、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并據(jù)此計(jì)算蛋白質(zhì)吸附量。

1.2.2.2 MG63成骨細(xì)胞的黏附與增殖情況 MG63成骨細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)、傳代、接種并沖洗、消化、離心、重懸等處理后，通過(guò)對(duì)MG63成骨細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照操作要求調(diào)整細(xì)胞濃度，然后接種于不同組別鈦片表面，于37 ℃、5%二氧化碳濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)、換液，至實(shí)驗(yàn)時(shí)點(diǎn)后經(jīng)漂洗、多聚甲醛處理、常溫固定、緩沖液再次漂洗、通透細(xì)胞、熒光劑染色、漂洗、干燥等一系列處理后，在專業(yè)的顯微鏡成像系統(tǒng)中隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行圖像采集，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)鈦片上吸附細(xì)胞的數(shù)目。同時(shí)，選擇MTS試劑盒對(duì)MG63成骨細(xì)胞在不同組別鈦片上的增殖情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2.3 不同鈦片表面的堿性磷酸酶活性 通過(guò)堿性磷酸酶（ALP）試劑盒對(duì)不同組別鈦片上的MG63成骨細(xì)胞ALP活性進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)使用酶標(biāo)儀，檢測(cè)波長(zhǎng)為405 nm，讀取吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)ALP活性分析成骨細(xì)胞在不同鈦片上的早期分化活性［3］。

1.2.2.4 不同鈦片表面MG63成骨細(xì)胞的礦化情況測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)的第14天，在不同鈦片表面的培養(yǎng)細(xì)胞層上實(shí)施茜素紅染色，并行陽(yáng)性礦化結(jié)節(jié)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為620 nm，通過(guò)礦化能力的測(cè)定分析成骨細(xì)胞在不同鈦片上的晚期分化活性［4］。

蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均采用儲(chǔ)存了28 d的鈦片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，對(duì)存在交互效應(yīng)的組別可以通過(guò)單因素方差分析及Levene’s test檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別鈦片表面理化性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 不同組別鈦片表面元素構(gòu)成比較 經(jīng)掃描電鏡觀察，不同組別鈦片在保存不同時(shí)間后，其鈦片表面的形貌基本相似，均為多孔狀結(jié)構(gòu)，且分布均勻、結(jié)構(gòu)規(guī)則。但在表面元素構(gòu)成上，Ⅰ組的C元素隨保存時(shí)間延長(zhǎng)不斷構(gòu)成比例不斷升高，而O元素、Ti元素、N元素不斷降低，與Ⅱ、Ⅲ組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同組別鈦片表面元素構(gòu)成比較（±s） %

表1 不同組別鈦片表面元素構(gòu)成比較（±s） %

組別 時(shí)間 C O Ti NⅠ組（n=3）保存3 d 37.3±1.8 47.0±2.3 16.8±1.6 1.5±0.4保存14 d 42.9±2.1 41.1±1.8 16.2±1.4 1.0±0.3保存28 d 48.5±2.6 37.5±2.0 14.7±1.2 0.8±0.2Ⅱ組（n=3）保存3 d 27.4±1.5 52.0±2.7 18.9±1.5 1.7±0.3保存14 d 27.8±2.3 51.6±2.0 18.6±1.2 2.0±0.2保存28 d 28.1±1.9 51.2±1.9 19.2±1.0 0.9±0.5Ⅲ組（n=3）保存3 d 25.7±1.6 55.2±2.5 19.8±2.0 0.8±0.4保存14 d 29.3±2.0 52.0±2.1 18.9±1.6 0.8±0.5保存28 d 31.4±2.0 50.5±2.3 18.1±1.4 1.0±0.3

2.1.2 不同組別鈦片表面ddH2O接觸面積比較 不同組別鈦片的粗糙程度參數(shù)a、St、Sdr比較無(wú)明顯差異，處于同一水平。而其親水性比較存在明顯的變化，Ⅰ組的純鈦SLA表面，則均勻的隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，鈦片與ddH2O表面接觸面積不斷下降，而Ⅲ組下降程度最低，Ⅰ組與Ⅱ、Ⅲ組ddH2O表面接觸面積比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同組別鈦片表面ddH20接觸面積比較（±s） %

表2 不同組別鈦片表面ddH20接觸面積比較（±s） %

組別 保存3 d 保存14 d 保存28 dⅡ組（n=3） 2.87±0.31 2.29±0.25 2.01±0.15Ⅱ組（n=3） 98.93±5.98 52.95±3.55 42.72±2.46Ⅲ組（n=3） 109.81±6.01 59.31±3.18 44.16±1.97

2.2 不同組別鈦片表面的生物活性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 不同組別鈦片表面蛋白吸附率比較 Ⅰ組鈦片隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)顯著下降，而Ⅱ、Ⅲ組波動(dòng)相對(duì)較小，均比Ⅰ組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.2.2 不同組別鈦片表面MG63成骨細(xì)胞黏附數(shù)目比較 隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，鈦片表面MG63成骨細(xì)胞黏附數(shù)目均不斷增長(zhǎng)，但Ⅰ組鈦片的黏附數(shù)目最低，在不同培養(yǎng)時(shí)間下的比較均顯著低于其他組別，Ⅲ組鈦片的黏附數(shù)目最高，顯著高于Ⅰ、Ⅱ組鈦片，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表3 不同組別鈦片表面蛋白質(zhì)吸附率比較（±s） %

表3 不同組別鈦片表面蛋白質(zhì)吸附率比較（±s） %

組別 保存3 d 保存14 d 保存28 dⅠ組（n=3） 10.16±0.43 6.21±0.23 4.87±0.15Ⅱ組（n=3） 10.03±0.57 8.93±0.51 8.81±0.34Ⅲ組（n=3） 9.97±0.56 9.23±0.45 9.01±0.41

表4 不同組別鈦片表面MG63成骨細(xì)胞黏附數(shù)目比較（±s） ×103

表4 不同組別鈦片表面MG63成骨細(xì)胞黏附數(shù)目比較（±s） ×103

組別 培養(yǎng)0.5 h 培養(yǎng)1 h 培養(yǎng)2 h 培養(yǎng)4 hⅠ組（n=3） 0.63±0.23 1.52±1.04 4.67±1.98 10.65±2.97Ⅱ組（n=3） 10.25±3.20 11.55±3.07 13.98±4.59 16.09±5.76Ⅲ組（n=3） 11.23±3.83 12.21±4.42 14.57±4.35 17.72±5.62

2.2.3 不同組別鈦片表面MG63成骨細(xì)胞增殖后吸光度比較 在細(xì)胞培養(yǎng)的第1、3天均有Ⅲ組＞Ⅱ組＞Ⅰ組的情況，Ⅱ與Ⅲ組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均比Ⅰ組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 不同組別鈦片表面MG63成骨細(xì)胞增殖后吸光度比較（±s）×102

表5 不同組別鈦片表面MG63成骨細(xì)胞增殖后吸光度比較（±s）×102

組別 培養(yǎng)1 d 培養(yǎng)3 dⅠ組（n=3） 35.0±1.0 100.9±4.7Ⅱ組（n=3） 41.1±1.6 124.7±5.1Ⅲ組（n=3） 42.2±1.2 133.6±5.2

2.2.4 不同組別鈦片表面MG63成骨細(xì)胞ALP吸光度比較 培養(yǎng)7 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組鈦片表面MG63成骨細(xì)胞ALP吸光度值分別為（25.0±0.6）、（25.1±0.8）、（24.8±0.7）×102，三組大致相近，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.5 不同組別鈦片表面礦化溶解后的吸光度比較 培養(yǎng)14 d，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組鈦片表面礦化溶解后的吸光度值分別為（3.5±0.3）、（3.7±0.3）、（4.1±0.5）×102，Ⅲ組＞Ⅱ組＞Ⅰ組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

人工種植體在口腔修復(fù)治療中應(yīng)用廣泛，但種植成功率受多種因素的影響，一方面，種植體植入后需要較長(zhǎng)的愈合時(shí)間（6～12周），此間容易受多種風(fēng)險(xiǎn)因素的干擾，另一方面，受限于材料的生物相容性，種植體和骨結(jié)合率總體上較低（50%～65%），在實(shí)際應(yīng)用中受到較大的限制［5］。如何使種植體更快更好與骨結(jié)合是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)［6-7］。

種植牙的植入與骨結(jié)合的過(guò)程實(shí)際上是生物組織與生物活性材料化學(xué)鍵的結(jié)合過(guò)程，而作為影響骨結(jié)合速度、強(qiáng)度的主要因素，種植體表面的生物活性高低、理化性能好壞至關(guān)重要，純鈦表面的理化性能與生物活性之間也息息相關(guān)。緊密相連［8-9］。鈦金屬是一種生物惰性材料，從本身的性質(zhì)來(lái)說(shuō)，其與骨組織之間存在較大的差異，一旦純鈦表面形成鈍態(tài)氧化膜之后，則其與骨組織的化學(xué)鍵性結(jié)合更加困難［10-13］。因而，臨床應(yīng)用中通常采用表面活化的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)種植體與生物組織直接鍵性結(jié)合的目的。無(wú)論是何種純鈦表面生物活化處理方法，均存在時(shí)效性。往往通過(guò)一段時(shí)間的保存后，純鈦表面經(jīng)處理后得到的高表面能及高生物活性效應(yīng)會(huì)逐漸消失，生物活性也會(huì)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)明顯降低的情況，也即鈦表面生物活性的老化［14-16］。

通過(guò)蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)、成骨細(xì)胞在材料表面的黏附、增殖、分化、礦化情況的分析，則可以對(duì)材料的生物活性進(jìn)行反映。本文對(duì)比較了3種不同儲(chǔ)存條件對(duì)純鈦SLA表面生物學(xué)性能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常溫常壓下密封保存的鈦片保存過(guò)程中容易受到C污染，導(dǎo)致其C元素構(gòu)成比例增加，導(dǎo)致其表面親水性下降，影響其蛋白吸附能力和細(xì)胞黏附、增殖及分化的能力。而將鈦片真空保存及液體保存可以降低C元素污染，并能保持超級(jí)親水性，有利于鈦片的蛋白吸附及細(xì)胞的黏附、增殖及分化。其中，NaCl液體保存的效果最佳。盧海賓等［17］的研究比較了經(jīng)酸蝕處理的鈦片分別保存于常溫常壓條件、ddH2O、NaCl和CaCl2溶液四種條件下的表面C元素含量、靜態(tài)水接觸角、MG63成骨細(xì)胞在接種不同時(shí)間后的黏附數(shù)目、細(xì)胞增殖能力，結(jié)果大致與本文相似。由此可見(jiàn)，這種趨勢(shì)在不同的純鈦表面類型具有一致性。

不同儲(chǔ)存條件對(duì)純鈦SLA表面的理化理化性質(zhì)、生物活性具有明顯的影響。將處理后的鈦片置于NaCl溶液中有利于降低C污染，并促進(jìn)鈦片表面的蛋白質(zhì)吸附、細(xì)胞黏附、增殖與分化。

參考文獻(xiàn)

［1］盧海賓.不同保存方法對(duì)純鈦表面理化性能以及生物活性的影響［D］.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

［2］張燕，王星，齊魯，等.分根術(shù)聯(lián)合純鈦樁核冠保存治療下頜磨牙殘冠殘根的臨床觀察［J］.新疆醫(yī)學(xué)，2015，45（1）：64-66.

［3］ Gomathisankar P，Yamamoto D，Katsumata H，et al.Photocatalytic hydrogen production with aid of simultaneous metal deposition using titanium dioxide from aqueous glucose solution［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2013，38（14）：5517-5524.

［4］丁婧文.紫外線處理微弧氧化純鈦種植體早期成骨作用的組織學(xué)探討［D］.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

［5］ Rajesh P，Muraleedharan C V，Komath M，et al.Pulsed laser deposition of hydroxyapatite on titanium substrate with titania interlayer［J］.Journal of Materials Science，Materials in Medicine，2011，22（3）：497-505.

［6］童興野，芶立.射頻等離子體對(duì)純鈦表面的氨基化改性［J］.真空科學(xué)與技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，34（6）：640-644.

［7］賈曉瑞，辛海濤，張強(qiáng)，等.超細(xì)晶純鈦種植體表面微弧氧化處理的實(shí)驗(yàn)研究［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2015，12 （3）：158-161，172.

［8］霍芳軍，謝利，童興野，等.陽(yáng)極氧化制備的鈦表面不同微觀形貌膜層耐腐蝕性研究［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2015，33 （6）：646-650.

［9］ Zhang W N，Lu J L，Zhu J W，et al.Studies on the preparation and thermal stability of SiO2aerogels doped with fibrous bructite and TiO2opacifier［J］.Asian Journal of Chemistry：An International Quarterly Research Journal of Chemistry，2013，25（2）：877-879.

［10］沈彬，劉向輝，孫衛(wèi)革，等.純鈦表面不同處理方法對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，14 （6）：775-778.

［11］賈曉瑞.超細(xì)晶純鈦材料表面微弧氧化處理及其生物安全性研究［D］.西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2015.

［12］商亞微，張偉，何晶，等.純鈦表面涂層（Ca+Zn）/P比值與成骨細(xì)胞生物活性的關(guān)系［J］.上?？谇会t(yī)學(xué)，2015，24 （1）：46-51.

［13］ Carreno-Morelli E，Bidaux J E， Rodriguez-Arbaizar M，et al.Production of titanium grade 4 components by powder injection moulding of titanium hydride［J］.Powder Metallurgy，2014，57 （2）：89-92.

［14］邵文儉，曹歡，繆羽，等.二氧化鋯全瓷冠與純鈦PFM全冠修復(fù)前牙的臨床對(duì)比研究［J］.包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，31 （11）：80-81.

［15］陳赟.純鈦種植體表面摻鍶納米二氧化鈦層的制備和生物學(xué)評(píng)價(jià)［D］.杭州：浙江大學(xué)，2015.

［16］ Patnaik A K，Poondla N，Menzemer C C，et al. Understanding the mechanical response of built-up welded beams made from commercially pure titanium and a titanium alloy［J］.Materials Science & Engineering A，2014，590（2）：390-400.

［17］盧海賓，萬(wàn)蕾，張雪洋，等.純鈦表面在不同儲(chǔ)存條件下理化性能及生物活性的變化［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2016，23（6）：9-13.

（WSTJJ20140114441781198501014116）

①?gòu)V州市第八人民醫(yī)院 廣東 廣州 510440

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.003

收稿日期：（2016-06-02） （本文編輯：蔡元元）

*基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)項(xiàng)目

Comparison of the Influence of Three Different Storage Conditions on the Biological Properties of Titanium SLA Surface

CUI Ling.//Medical Innovation of China，2016，13（20）：009-012

【Abstract】Objective：To compare the effect of three different storage conditions on the biological properties of pure titanium SLA surface.Method：SLA surface were produced with commercial pure titanium disk by treated with the method of sand blasting and acid-etch，and store in three different environments of different time，group Ⅰ：atmospheric pressure preservation；group Ⅱ：vacuum preservation；group Ⅲ：NaCl solution.Physical and chemical properties， biological activity were compared.Result：Among the three groups，the pure titanium SLA surface in group Ⅲ showed the best effect in the surface free energy，protein adsorption rate，MG63 osteoblast adhesion， proliferation and ALP activity and mineralization.Physical and chemical properties and biological activity of surface group Ⅰ decreased obviously because of C element pollution.Conclusion：The difference of storage conditions have significant impacts on physical and chemical properties，biological activity of pure titanium SLA surface.Storing titanium plate in NaCl solution is helpful to reduce the pollution of the C，and increase protein adsorption，cell adhesion， proliferation and differentiation on the pure titanium SLA surface.

【Key words】Storage conditions； Pure titanium surface of SLA； Surface physical and chemical properties； Biological activity