張恩溥，鄭文忠，陳劍波，張士強(qiáng)，劉　沖，李明華，李賢新

(1北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳　518036；2中山大學(xué)腫瘤防治中心泌尿外科，廣東廣州　510060；3北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東深圳　518036)

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·基礎(chǔ)研究·

TGF-β1和N-cadherin在精原細(xì)胞瘤中的表達(dá)及二者的關(guān)系

張恩溥1，鄭文忠1，陳劍波1，張士強(qiáng)2，劉沖3，李明華1，李賢新1

(1北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳518036；2中山大學(xué)腫瘤防治中心泌尿外科，廣東廣州510060；3北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東深圳518036)

摘要：目的檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)及神經(jīng)-鈣粘素(N-cadherin)在精原細(xì)胞瘤中的表達(dá)并探討二者關(guān)系。方法采用SP免疫組化法檢測(cè)34例精原細(xì)胞瘤及15例正常睪丸中TGF-β1、N-cadherin的表達(dá)水平。構(gòu)建N-cadherin 質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染NCCIT精原細(xì)胞瘤細(xì)胞系，經(jīng)外源性人重組TGF-β1干預(yù)，熒光法檢測(cè)N-cadherin的表達(dá)。結(jié)果免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常睪丸間質(zhì)細(xì)胞、生精上皮細(xì)胞、長(zhǎng)形精子及支持細(xì)胞間緊密連接處均可見TGF-β1表達(dá)，N-cadherin則表達(dá)于支持細(xì)胞間緊密連接處。精原細(xì)胞瘤中未見N-cadherin表達(dá)，但TGF-β1表達(dá)水平較正常睪丸顯著增高，且差異有顯著性(P<0.05)；TGF-β1可降低精原細(xì)胞瘤細(xì)胞株中N-cadherin的表達(dá)水平。結(jié)論精原細(xì)胞瘤中TGF-β1高表達(dá)，N-cadherin低表達(dá)，且重組TGF-β1可降低精原細(xì)胞瘤細(xì)胞系N-cadherin表達(dá)，提示 TGF-β1可能通過下調(diào)N-cadherin在精原細(xì)胞瘤癌變過程中起重要作用。

關(guān)鍵詞：TGF-β1；N-cadherin；精原細(xì)胞瘤；NCCIT精原細(xì)胞瘤細(xì)胞系

睪丸惡性腫瘤占男性全身惡性腫瘤的1%，其中精原細(xì)胞瘤占30%～40%[1]。精原細(xì)胞瘤起源于睪丸原始生殖細(xì)胞，惡性程度較低，可沿淋巴管轉(zhuǎn)移。目前就精原細(xì)胞瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍未闡明。近期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1) 在精原細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[2]。TGF-β是一種多肽類細(xì)胞因子，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)5種不同亞型，其中TGF-β1的研究最多?，F(xiàn)認(rèn)為TGF-β1在腫瘤早期起抑制作用，而在腫瘤進(jìn)展期起促進(jìn)作用[3-4]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，TGF-β1可通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial mesenchymal transition，EMT)在惡性腫瘤發(fā)展過程中起重要作用[5-6]。為探討精原細(xì)胞瘤中TGF-β1是否通過調(diào)控EMT起作用，本研究通過免疫組化方法檢測(cè)TGF-β1及N-cadherin在正常睪丸及精原細(xì)胞瘤中的表達(dá)，并驗(yàn)證TGF-β1在NCCIT細(xì)胞系中對(duì)N-cadherin的調(diào)控作用。

1材料與方法

1.1標(biāo)本收集制備收集2005年6月至2013年10月北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除的精原細(xì)胞瘤組織34例，年齡28～50(45.2±7.0)歲，病理診斷結(jié)果為睪丸精原細(xì)胞瘤。正常睪丸標(biāo)本15例，年齡在38～64(49.5±6.4)歲。標(biāo)本選自2006年9月至2013年10月我院泌尿外科收治因前列腺癌而接受睪丸去勢(shì)手術(shù)治療的患者，經(jīng)2名病理科醫(yī)師鑒定為正常睪丸組織。列腺癌患者術(shù)前未經(jīng)放、化療處理。本課題經(jīng)北京大學(xué)深圳醫(yī)院及深圳北京大學(xué)/香港科技大學(xué)大學(xué)醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，且參與實(shí)驗(yàn)研究患者均確認(rèn)填寫《患者知情同意書》。

1.2主要試劑及儀器N-cadherin鼠抗人單抗(武漢博士德生物科技有限公司)；TGF-β1 兔抗單抗(武漢博士德生物科技有限公司)；UltraSensitive TM SP(鼠/兔)試劑盒(福州邁新生物科技有限公司)；山羊血清工作液(福州邁新生物科技有限公司)；DAB顯色劑(福州邁新生物科技有限公司)；重組TGF-β1細(xì)胞因子(美國Selleck公司)；引物設(shè)計(jì)(Primer Primer 5.0軟件)；引物合成(上海invitrogen 公司)；新生牛血清(杭州四季清生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco 公司)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa 公司)；人精原細(xì)胞瘤細(xì)胞株NCCIT系本實(shí)驗(yàn)室冷凍保存(源自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)。其他常規(guī)試劑由北京大學(xué)深圳醫(yī)院廣東省男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室供應(yīng)。

1.3免疫組化(SP法)石蠟標(biāo)本切片4 μm/片，室溫干燥48 h。切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化處理，0.3%過氧化氫耗竭組織內(nèi)源性過氧化物酶20 min，抗原修復(fù)方法為pH 9.0 Tris-EDTA微波修復(fù)20 min，室溫條件下自然冷卻。山羊血清工作液室溫孵育45 min降低非特異性染色，一抗4 ℃冰箱孵育過夜，二抗室溫孵育50 min，經(jīng)辣根過氧化物標(biāo)記生物素37 ℃溫箱孵育45 min，顯微鏡下觀察DAB顯色效果，復(fù)染細(xì)胞核，水化透明處理，中性樹膠封片。

1.4NCCIT-N-cadherin細(xì)胞構(gòu)建N-cadherin引物序列為：上游5′-CCGCTCGAGGCCACCCTATGTGCCGGATAGCGGGAGC-3′，下游5′-GGAATTCTTGGCAGGATCAGACAATTTTGTG-3′。酚氯仿法提取睪丸總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以上述引物擴(kuò)增出N-cadherin 的CDS區(qū)。構(gòu)建N-cadherin- pEGFP-C1真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染NCCIT細(xì)胞株，培養(yǎng)基中加入不同濃度TGF-β1(0 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/mL，15 ng/mL)，48 h后檢測(cè)N-cadherin熒光強(qiáng)度。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果正常睪丸間質(zhì)細(xì)胞、生精上皮細(xì)胞、長(zhǎng)形精子及支持細(xì)胞間緊密連接處均可見TGF-β1表達(dá)。精原細(xì)胞瘤TGF-β1表達(dá)水平較正常睪丸顯著增高，且差異有顯著性(P<0.05)。支持細(xì)胞間緊密連接處及生精上皮細(xì)胞均可見N-cadherin表達(dá)，但精原細(xì)胞瘤中未見N-cadherin表達(dá)(圖1)。

2.2NCCIT中TGF-β1對(duì)N-cadherin表達(dá)的影響IPP6.0軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度值，不同濃度TGF-β1(0、5、10、15 ng/mL)對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度值分別為0.67±0.21、1.10±0.17、1.28±0.34、1.67±0.20。其中TGF-β1為15 ng/mL培養(yǎng)基時(shí)，N-cadherin下降最明顯，且差異有顯著性(P<0.05，圖2)。

圖2　在NCCIT細(xì)胞系中TGF-β1對(duì)N-cadherin表達(dá)的調(diào)控(×200；×400)

A:未加TGF-β1的空白對(duì)照；B:空白對(duì)照與核共染；C:TGF-β1濃度為15 ng/mL時(shí)N-cadherin的表達(dá)；D:實(shí)驗(yàn)組與核共染。

3討論

TGF-β1是一種肽類生長(zhǎng)因子，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，其分子質(zhì)量約為25 ku，由相同兩條肽鏈組成，在物種間具有高度保守性[7]。TGF-β1最初由血小板中提取，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、胞外蛋白合成，并參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力。正常睪丸有TGF-β1表達(dá)，并可通過自分泌及旁分泌的方式調(diào)節(jié)睪丸發(fā)育及精子發(fā)生[8]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1參與睪丸惡性腫瘤發(fā)病過程，而其在精原細(xì)胞瘤中作用仍未闡明[2]。多種惡性腫瘤中，TGF-β1通過誘導(dǎo)EMT，從而使腫瘤細(xì)胞獲得浸潤及轉(zhuǎn)移的能力[9]。EMT系指上皮細(xì)胞在特定程序作用下轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型，是上皮細(xì)胞源性惡性腫瘤細(xì)胞獲得侵襲及轉(zhuǎn)移能力的重要生物學(xué)過程。通過EMT，上皮細(xì)胞極性丟失，降解細(xì)胞外基質(zhì)能力增強(qiáng)，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞獲得較高的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[10]。EMT分子表型改變主要表現(xiàn)為間質(zhì)表型N-cadherin上升[11]。

N-cadherin為鈣依賴介導(dǎo)細(xì)胞間粘附的一類分子，正常生精過程密切相關(guān)。正常生精過程中，精原細(xì)胞分裂及各級(jí)生精細(xì)胞有基底部向腔內(nèi)遷移的過程需要N-cadherin[12]。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中N-cadherin上調(diào)，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲性[13-14]。為探討精原細(xì)胞瘤中TGF-β1及EMT的關(guān)系，本研究通過免疫組化分析正常睪丸及精原細(xì)胞瘤TGF-β1、N-cadherin的表達(dá)與分布。與文獻(xiàn)報(bào)道一致，我們發(fā)現(xiàn)正常睪丸間質(zhì)細(xì)胞、生精細(xì)胞及支持細(xì)胞間緊密連接處均可見TGF-β1表達(dá)。睪丸間質(zhì)主要包括萊氏細(xì)胞(Leydig cells)、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞。形態(tài)學(xué)分析表明TGF-β1主要表達(dá)于Leydig cells細(xì)胞。提示Leydig cells細(xì)胞可通過分泌TGF-β1參與睪丸免疫微環(huán)境及正常生精的調(diào)控。研究表明，TGF-β1在精子頂體后區(qū)、頸部及尾中部均有表達(dá)[15]。睪丸生精上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1，說明精子在進(jìn)入附睪成熟前已有表達(dá)。支持細(xì)胞間緊密連接可見TGF-β1表達(dá)，提示TGF-β1可能在維持精曲小管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中起重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，精原細(xì)胞瘤胞核及胞質(zhì)均有TGF-β1表達(dá)，表達(dá)水平較正常睪丸顯著升高(P<0.05)。N-cadherin主要表達(dá)于正常睪丸近基底部支持細(xì)胞間緊密連接處，提示其在維系生精小管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及各級(jí)生精細(xì)胞由基底部向腔內(nèi)遷移過程中起重要作用。精原細(xì)胞瘤未見N-cadherin表達(dá)，表明精原細(xì)胞瘤癌變過程中無典型EMT現(xiàn)象，提示精原細(xì)胞瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過程可能存在一種不同于EMT的途徑。近期研究表明，惡性卵巢腫瘤中N-cadherin表達(dá)水平下調(diào)[16]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，N-cadherin為卵巢上皮細(xì)胞存活因子，并抑制卵巢腫瘤的形成[17-18]。由此，我們推測(cè)睪丸N-cadherin作用與卵巢上皮細(xì)胞類似：即正常睪丸N-cadherin作為生精細(xì)胞及支持細(xì)胞的存活因子，并在維持睪丸支持細(xì)胞極性、精子發(fā)生及腔內(nèi)遷移等過程起重要作用；在睪丸腫瘤發(fā)生過程中N-cadherin下調(diào)，睪丸支持細(xì)胞極性平衡打破，進(jìn)而影響精曲小管穩(wěn)定性。

在過表達(dá)N-cadherin的NCCIT精原細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，TGF-β1顯著下調(diào)N-cadherin，且TGF-β1濃度為15 μg/mL時(shí)N-cadherin下降最明顯。提示TGF-β1可能過調(diào)節(jié)N-cadherin在精原細(xì)胞瘤癌變過程中發(fā)揮作用。在乳腺癌及其他常見惡性腫瘤中，TGF-β1通過誘導(dǎo)EMT使細(xì)胞極性散失，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移[19]。

我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常睪丸處于EMT狀態(tài)，說明EMT現(xiàn)象對(duì)正常生精具有重要意義。TGF-β1及N-cadherin均表達(dá)于正常睪丸支持細(xì)胞間緊密連接處，提示二者平衡對(duì)維系精曲小管正常結(jié)構(gòu)具有重要作用。在精原細(xì)胞瘤發(fā)生時(shí)EMT現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)，精曲小管結(jié)構(gòu)破壞、生精細(xì)胞極性消失，腫瘤細(xì)胞向管腔及間質(zhì)浸潤。

綜上所述，通過分析正常睪丸及精原細(xì)胞瘤中TGF-β1及N-cadherin的表達(dá)與分布，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞瘤TGF-β1表達(dá)水平顯著上調(diào)， 而N-cadherin顯著下調(diào)，且在過表達(dá)的NCCIT細(xì)胞系中TGF-β1可降低N-cadherin表達(dá)。提示TGF-β1可通過下調(diào)N-cadherin參與精原細(xì)胞瘤癌變過程。此外，精原細(xì)胞瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過程可能存在一種不同于EMT的途徑。本研究描述了TGF-β1及N-cadherin在精原細(xì)胞瘤中表達(dá)與分布，并初步證實(shí)TGF-β1對(duì)N-cadherin的調(diào)控作用，此對(duì)進(jìn)一步深入理解TGF-β1、EMT在正常生精過程及精原細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，并為生精功能障礙及精原細(xì)胞瘤患者個(gè)性化治療提供理論基礎(chǔ)。

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(編輯何宏靈)

收稿日期：2015-05-26修回日期：2015-10-26

作者簡(jiǎn)介:張恩溥(1988-)，男(漢族)，碩士研究生在讀.研究方向:泌尿生殖系腫瘤.E-mail：zepfill116218@163.com

中圖分類號(hào):R691.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.02.017

The expression and correlation of TGF-β1 and N-cadherin in seminoma

ZHANG En-pu1,ZHENG Wen-zhong1, CHEN Jian-bo1, ZHANG Shi-qiang2, LIU Chong3, LI Ming-hua1, LI Xian-xin1

(1.Department of Urology,Shenzhen Hospital of Peking University, Shenzhen 518036, China; 2.Department of Urology, Cancer Center of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510060, China; 3.Department of Gynaecology and Obstetrics, Shenzhen Hospital of Peking University, Shenzhen 518036, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the expression and correlation of transforming growth factor-β1(TGF-β1) and N-cadherin in seminomas.MethodsThe expressions of TGF-β1 and N-cadherin in 34 seminoma tissues and 15 normal testicular specimens were detected with immunohistochemical staining.Plasmid vector of N-cadherin was constructed, and NCCIT cells were transfected.The NCCIT cells were cultured for 2 days with TGF-β1 nutrient medium and the expression of N-cadherin was detected with fluorescence technique.ResultsTGF-β1 was detected in Leydig cells, seminiferous epithelial cells, sperms and sertoli cells of testis tissues.N-cadherin was detected in tight junctions(TJs) and adherin junctions(AJs) between sertoli cells.Immunohistochemical staining did not detect N-cadherin in seminomas.Immunohistochemical staining results showed that the expression of TGF-β1 was significantly increased in seminoma compared with that in normal testis tissues(P<0.05).Immunofluorescence staining results showed that TGF-β1 could significantly down-regulate the expression of N-cadherin in NCCIT.ConclusionsUP-regulated TGF-β1 and down-regulated of N-cadherin are detected in seminomas, which indicates that TGF-β1 plays an important role in tumorigenesis of seminomas by regulating the expression of N-cadherin.

KEY WORDS:transforming growth factor-β1; N-cadherin; seminomas; NCCIT seminomas cell line