門昌平，高振利，吳吉濤，袁賀佳，楊典東，于勝?gòu)?qiáng)，王永強(qiáng)，魯友誼

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院泌尿外科，山東煙臺(tái)　 264000)

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·基礎(chǔ)研究·

沉默中介體復(fù)合物亞基19基因?qū)θ税螂装┘?xì)胞UM-UC3遷移能力的影響

門昌平，高振利，吳吉濤，袁賀佳，楊典東，于勝?gòu)?qiáng)，王永強(qiáng)，魯友誼

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院泌尿外科，山東煙臺(tái) 264000)

摘要：目的探討中介體復(fù)合物亞基19(Med19)對(duì)人膀胱癌UM-UC3細(xì)胞遷移能力的影響及其機(jī)制。 方法采用針對(duì)Med19的siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染人膀胱癌UM-UC3，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡方法(Western blot)檢測(cè)Med19-siRNA轉(zhuǎn)染組(siRNA)與空載組(NC)Medl9基因表達(dá)情況；采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表達(dá)；采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。 結(jié)果Medl9-siRNA慢病毒感染UM-UC3細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染組Medl9 mRNA表達(dá)與空載組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.15，P<0.01)，且轉(zhuǎn)染組Med19、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t值分別為71.36，26.34，8.627，均P<0.01)，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移能力明顯減弱。 結(jié)論沉默Med19基因可通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)降低人膀胱癌細(xì)胞UM-UC3的遷移能力。

關(guān)鍵詞：Med19； 慢病毒； RNA干擾； 膀胱癌； 遷移

Med19是中介體復(fù)合物(Mediator)的重要組成部分，對(duì)于Mediator與RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合與活化有著重要作用。在Med19表達(dá)被抑制的情況下，Mediator與RNA聚合酶Ⅱ的親和力降低。Med19作為轉(zhuǎn)錄活化基因，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用，且與胃癌、肝細(xì)胞腫瘤、乳腺癌和前列腺癌的發(fā)展關(guān)系密切[1-2]。為進(jìn)一步了解Med19對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響，我們采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法抑制人膀胱癌細(xì)胞UM-UC3中 Med19的表達(dá)，觀察細(xì)胞遷移能力的變化，并探討其分子機(jī)制。

1資料與方法

1.1材料人膀胱癌UM-UC3細(xì)胞株購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，UM-UC3細(xì)胞培養(yǎng)在含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，培養(yǎng)條件設(shè)定為5% CO2，37 ℃。qRT-PCR相關(guān)試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司。兔抗人Med19多克隆抗體、鼠抗人MMP-2單克隆抗體和鼠抗人MMP-9單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。針對(duì)Med19的siRNA慢病毒載體及qRT-PCR引物均由上海吉?jiǎng)P基因有限公司合成。

1.2方法

1.2.1慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞置于六孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到六孔板面積的20%時(shí)分別采用Med19-siRNA病毒與空載病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞用于mRNA和蛋白的檢測(cè)。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)Med19 mRNA表達(dá)水平Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，采用qRT-PCR方法檢測(cè)Med19 mRNA表達(dá)。Med19引物序列：上游5′-TGCCAGGGATGATTGATCTG-3′，下游5′-TCTTCTTGGGAGGCTGAATATG-3′。β-actin作為內(nèi)參照，上游5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′，下游5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.2.3Western blot檢驗(yàn)Med19、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)每孔上樣量為30 μg蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨(SDS-PAGE)凝膠電泳分離，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至醋酸纖維(NC)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，用化學(xué)底物發(fā)光液(Electro-Chemi-Luminescence，ECL)暗室顯影。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)將懸浮細(xì)胞接種至六孔板中，生長(zhǎng)至六孔板面積的80%時(shí)用1 mL的槍頭在培養(yǎng)皿中制造“一”字行劃痕，用含有5%胎牛血清培養(yǎng)24 h，觀察劃痕區(qū)細(xì)胞遷移。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種于上層Transwell小室，上室加入無血清RPMI 1640無血清培養(yǎng)基，下室加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后取出小室進(jìn)行細(xì)胞固定，用MTT染色，顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，并使用Image J(v2.1)計(jì)算細(xì)胞穿膜數(shù)。

2結(jié)果

2.1慢病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞后Med19 mRNA水平的表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后轉(zhuǎn)染組的Med19 mRNA表達(dá)較空載組明顯降低(t=10.15，P<0.01)。

2.2慢病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞后Med19、MMP-2、MMP-9蛋白水平的表達(dá)轉(zhuǎn)染72 h后提取細(xì)胞總蛋白，Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組Med19蛋白表達(dá)被抑制(t=71.36，P<0.01)；同樣，MMP-2(t=26.34，P<0.01)與MMP-9(t=8.627，P<0.01)蛋白表達(dá)也被抑制(圖1)。

圖1Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Med19、MMP-2、MMP-9蛋白水平變化

轉(zhuǎn)染組Med19、MMP-2、MMP-9的表達(dá)同空載組相比顯著降低。

2.3劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果空載組劃痕兩側(cè)的細(xì)胞向空白區(qū)域大量遷移，而轉(zhuǎn)染組向空白區(qū)域遷移的細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示細(xì)胞遷移能力被明顯抑制(圖2)。

圖2　劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

A、B分別為空載組0 h、24 h劃痕邊緣變化情況；C、D分別為轉(zhuǎn)染組0 h、24 h劃痕邊緣變化情況。同空載組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移能力明顯減弱。虛線處為劃痕邊緣;×200。

2.4Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小室下表面附著細(xì)胞數(shù)為(126.0±6.08)個(gè)/cm2，較轉(zhuǎn)染組(43.67±5.8)個(gè)/cm2明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖3)。

圖3　Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

A、B分別為空載組、轉(zhuǎn)染組24后細(xì)胞遷移情況，同空載組相比，轉(zhuǎn)染組穿過小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少;×200。

3討論

中國(guó)屬于膀胱癌死亡水平較低的國(guó)家之一，但近5年間的死亡率呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[3]，其發(fā)生發(fā)展呈多因素、多步驟的復(fù)雜變化過程，可能與吸煙、職業(yè)暴露、免疫因素等相關(guān)[4-5]，但發(fā)病機(jī)制尚待明確。Mediator在基因轉(zhuǎn)錄過程中處于核心位置，含有不同激酶組件的Mediator復(fù)合物可對(duì)多種類型的基因起到調(diào)節(jié)作用。Mediator復(fù)合物能刺激基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄，維持激活的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)刺激RNA聚合酶Ⅱ末端結(jié)構(gòu)域(CTD)的磷酸化，磷酸化的RNA聚合酶II末端結(jié)構(gòu)域參與染色質(zhì)重組，并作為一個(gè)支架蛋白招募組蛋白修飾的酶至基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域[6]。

Med19作為Mediator家族的重要成員，在基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要功能，與細(xì)胞的生長(zhǎng)和周期調(diào)控關(guān)系緊密，可通過介導(dǎo)多種信號(hào)途徑影響細(xì)胞生長(zhǎng)。單純?nèi)サ鬗ed19亞基使Mediator復(fù)合物的穩(wěn)定性降低，并削弱Mediator同RNA聚合酶II的結(jié)合能力，因而阻礙RNA聚合酶II的CTD磷酸化，導(dǎo)致基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄降低。Med19作為腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，在許多惡性腫瘤組織髙表達(dá)，而在正常組織或良性病變低表達(dá)或不表達(dá)[1]。CUI等[7]發(fā)現(xiàn)，沉默前列腺癌細(xì)胞中Med19的表達(dá)可以使前列腺癌細(xì)胞停留在細(xì)胞周期S期，并且轉(zhuǎn)染后的前列腺癌細(xì)胞凋亡的水平明顯增加；CHEN等[8]研究表明其Med19在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)升髙，并與臨床分期正相關(guān)；DING和SUN等[9-10]在研究Med-19與胃癌的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用慢病毒沉默胃癌細(xì)胞中Med19的表達(dá)可以顯著削弱胃癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞停留在細(xì)胞周期G1期。LI等[11]發(fā)現(xiàn)Med19在乳腺癌中也起到了類似作用[12]。

本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法沉默人膀胱癌細(xì)胞UM-UC3細(xì)胞Med19的表達(dá)，探究Med19對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響及及機(jī)制。結(jié)果顯示，采用Med19-siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染UM-UC3細(xì)胞后成功抑制了Med19 mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)也受到削弱。MMP-2和MMP-9與細(xì)胞的遷移與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可通過降解細(xì)胞外機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移，因此，我們進(jìn)一步用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UM-UC3細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞的遷移能力被明顯抑制，提示Med19可能是膀胱癌的一個(gè)新的抑癌基因，可能通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)抑制膀胱癌的遷移和轉(zhuǎn)移。

在膀胱癌治療中，以Medl9基因?yàn)榘悬c(diǎn)，利用慢病毒轉(zhuǎn)染靶向RNA干擾技術(shù)進(jìn)行基因治療有可能成為一種新的有前景的方法，為膀胱癌的分子生物治療提供新的思路。

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(編輯何宏靈)

前沿·動(dòng)態(tài)·熱點(diǎn)

收稿日期：2015-12-03修回日期：2016-01-14

基金項(xiàng)目:山東省自然科學(xué)基金英才基金資助項(xiàng)目(No.ZR2015 HM021)

通訊作者:高振利，教授.E-mail: gzlurology @163.com

作者簡(jiǎn)介:門昌平(1976-)，男(漢族)，在讀碩士，主治，研究方向?yàn)槊谀蛏诚到y(tǒng)腫瘤.E-mail：mchp001@163.com

中圖分類號(hào):R34

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.02.019

Lentivirus-mediated inhibition of Med19 suppresses migration of bladder cancer UM-UC3 cells

MEN Chang-ping, GAO Zhen-li, WU Ji-tao, YUAN He-jia, YANG Dian-dong, YU Sheng-qiang, WANG Yong-qiang, LU You-yi

(Department of Urology, Yantai Yuhuangding Hospital Affiliated to Medical College of Qingdao University, Yantai 264000, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo study the effect of lentivirus-mediated inhibition of Med19 on the migration of human bladder cancer UM-UC3 cells, and to explore its potential mechanism.MethodsThe lentivirus vectors containing small interfering RNA(siRNA) targeting Medl9 gene were constructed and transfected to human bladder cancer UM-UC3 cells.Quantitative real-time PCR(qRT-PCR) and Western blot analysis were used to detect the Medl9 expression in the siRNA group(Lv-Med19siRNA cells) and the NC group(Lv-NC-infected cells) 72 h after the transfection.Western blot was used to examine the changes of expression in matrix metalloproteinase 2(MMP-2) and MMP-9.The influence of Medl9 on the migration of bladder cancer cell was assessed with wound healing assay and transwell assay.Results The expressions of MMP-2 and MMP-9 were greatly reduced 72 h after Med19 inhibition(t value was 26.34 and 8.627,P<0.01), and the migration ability was remarkably inhibited in the siRNA group.ConclusionMed19 inhibition reduces migration ability of human bladder cancer UM-UC3 cells via down-regulating MMP-2 and MMP-9 expressions.

KEY WORDS:Med19; bladder cancer; migration