楊炳臣

地黃煎煮過程中不同時間及煎煮液中梓醇的動態(tài)變化規(guī)律及對其止血作用的影響對比研究

楊炳臣

【摘要】目的 對比分析地黃煎煮液中不同煎煮時間里梓醇含量的變化情況以及隨煎煮時間的不同其止血作用的變化情況。方法 不同煎煮時間里梓醇含量的測定采用高效液相（HPLC）來測定，并采用剪尾法以及毛細(xì)玻管法探究不同的煎煮時間及其對小鼠的止血作用變化情況。將隨機(jī)選取的96只小鼠分為8個空白對照組，并將地黃的煎煮時間分別設(shè)定為15 min，30 min，45 min，60 min，90 min，120 min以及180 min。對小鼠連續(xù)給藥1周，在第8 d早上對小鼠給藥40 min后，分別測定各給藥組小鼠的出血時間以及凝血時間。并對比分析各組結(jié)果。結(jié)果 地黃煎煮液中梓醇含量的變化隨煎煮時間的不同而不同，剛開始梓醇含量隨煎煮時間的加長而升高，煎煮時間為60 min時含量達(dá)到最高；之后梓醇含量隨煎煮時間的繼續(xù)加長而降低。在小鼠的出血以及凝血方面上，除煎煮時間為180 min組之外，其他各給藥組與空白組相對比小鼠的出、凝血時間均縮短，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)價值。180 min組與空白組的對比，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 地黃煎煮液中梓醇的含量及其止血作用的變化情況隨煎煮時間的長短變化而變化，并且影響很大。

【關(guān)鍵詞】地黃；煎煮時間；梓醇含量變化；止血作用；對比研究

Objective To compare and analyze the dihuang decoction in different decocting time the content of catalpol changes and changes with thedecocting time of different hemostatic effect. Methods Different decocting time the content of catalpol was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）was used to determine，and by cutting tail method and glass capillary tube method exploring different decocting time and their changes in hemostatic effect in mice. Will randomly selected 96 mice divided into 8 blank control group and radix rehmanniae decoction time were set for 15 min，30 min，45 min，60 min，90 min and 120 min and 180 min. After 1 weeks of continuous administration of mice，the bleeding time and clotting time of mice were measured by 40 min in eighth days. And comparative analysis of the results of each group. Results The changes of the contents of catalpol in rehmannia decoction with different decocting time and different，at the beginning of the catalpol content increased with the extension of the decocting time，decocting time for 60 min content reached the highest after catalpol content with the decocting time continues to lengthen decreased. In mice bleeding and coagulation aspects，in addition to decocting time 180 min group for each other to medicine group and blank group phase contrast to mice out，coagulation time were significantly shortened，P＜0.01，the difference has statistical value. The difference between the 180 min group and the blank group was not significant. Conclusion Dihuang decoction catalpol content and haemostatic effect changes with the decocting time and length of the changes，and has a great influence.

【Key words】 Rehmannia decoction，Time change，Catalpol content，Hemostasis，Comparative study

地黃為玄參科地黃屬多年生草本植物，由于其塊根顏色為黃白色而得名。其入藥部位為根部。由于其炮制方法的不同，常分為鮮地黃以及干地黃和熟地黃三種［1］。梓醇具有抗炎止血功效。由于梓醇具有十分廣泛的藥理活性，因此對梓醇以及梓醇衍生物的研究成為廣大研究者們的重點(diǎn)課題，研究的方向主要包括梓醇及其梓醇衍生物之間的化學(xué)轉(zhuǎn)化，兩者之間的藥效學(xué)關(guān)系等［2］。為探究其在加工炮制過程中藥理活性發(fā)生改變的內(nèi)在機(jī)制，我們更應(yīng)該將研究的重點(diǎn)放在梓醇以及梓醇降解后的生成物活性方面。梓醇更是地黃的主要藥理活性成分，我們常常用梓醇含量的高低來判斷地黃的質(zhì)量及其藥效，這是十分具有指導(dǎo)意義的。本研究旨在通過對比分析地黃煎煮液中不同煎煮時間里梓醇含量的變化情況，以及隨煎煮時間的不同其止血作用的變化。研究其動態(tài)變化的同時，找到煎煮地黃的最佳時間，并探討各因素之間的內(nèi)在聯(lián)系。以下是詳細(xì)報道。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，超聲波清洗器，電子天平。

1.2 試藥

本次研究所用梓醇對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，云南白藥由云南白藥集團(tuán)股份有限公司提供，產(chǎn)品批號為20070801。本次研究所用試劑除乙腈為色譜純外，其他均為分析純。本次研究所用藥材于陜西省萬壽路藥材市場購買，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定專家王繼濤教授鑒定，為正品。

2 方法

2.1 梓醇的含量隨煎煮時間不同的變化情況

2.1.1 樣品制備 取7份地黃粗粉，每份各50 g，每份中加入8倍量的水，在浸泡30 min至浸泡透心后，分別煎煮15 min，30 min，45 min，60 min，90 min，120 min以及180 min。煎煮結(jié)束后，趁熱將其過濾并收集濾液，之后將其濃縮后于100 ml量瓶中定容，并依次進(jìn)行標(biāo)記，得到樣品。

2.1.2 梓醇含量的測定 （1）色譜條件：色譜柱：kromasil C18柱；流動相：乙腈-磷酸（1：99）；流速設(shè)定為1 ml/min；210 nm波長為檢測波長；柱溫為室溫。（2）制備對照品溶液：取梓醇對照品適量，并進(jìn)行精密稱取，加入流動相，制成10.8 μg/ml的對照品溶液。（3）制備供試品溶液：取1 ml 2.1.1項(xiàng)下的樣品，并將其分別至于蒸發(fā)皿中，蒸干后用甲醇溶液將殘渣進(jìn)行超聲溶解，于25 ml量瓶中進(jìn)行定容，搖勻后過濾，取續(xù)濾液即得。（4）測定：精密吸取10 μl對照品及供試品溶液，在高效液相色譜儀中進(jìn)樣，并記錄峰面積。

2.2 止血作用的變化隨煎煮時間不同的影響情況

稀釋2.1.1項(xiàng)下的樣品，制成符合該研究所用的濃度備用（1 ml相當(dāng)于0.125 g原藥材）。取96只昆明種小鼠，雌雄各一半，體重為（20±2）g，并將其科學(xué)的分為8組，每組含12只小鼠，空白組每天給予等體積的生理鹽水，其余組每天按6.25 g/kg標(biāo)準(zhǔn)給藥，連續(xù)給藥1周，在第8 d早上對小鼠給藥40 min后，分別測定各給藥組小鼠的出血時間以及凝血時間。

2.2.1 測定凝血時間 從小鼠的左眼球后靜脈叢處用玻璃毛細(xì)管取血，待血液注滿后將其取出，平放在桌面上，在毛細(xì)管兩端各折斷0.5 cm，觀察是否有凝絲出現(xiàn)，每30 s折一次。從血液流出毛細(xì)管時計時直至凝絲出現(xiàn)計時結(jié)束。此段時間為小鼠的凝血時間，取平均值并記錄。

2.2.2 測定出血時間 將小鼠尾尖1 cm處用解剖剪橫斷，當(dāng)血液溢出時，立即用濾紙吸血每30 s一次，直至血液自然停止流出，記錄時間。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

樣品結(jié)果采用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）的方式表示，t檢驗(yàn)用于數(shù)據(jù)分析比較，以P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 梓醇的含量隨煎煮時間不同的變化情況

地黃煎煮液中梓醇含量的變化隨煎煮時間的不同而不同，剛開始梓醇含量隨煎煮時間的加長而升高，煎煮時間為60 min時含量達(dá)到最高；之后梓醇含量隨煎煮時間的繼續(xù)加長而降低。詳情見表1。

3.2 止血作用的變化隨煎煮時間不同的影響情況

表1 梓醇的含量隨煎煮時間不同的變化情況

在小鼠的出血以及凝血方面的比較上，除煎煮時間為180 min組之外，其他各給藥組與空白組相對比小鼠的出、凝血時間均有一定程度的縮短，P＜0.01，各組差異之間有統(tǒng)計學(xué)價值。180 min組與空白組的對比，差異不顯著。詳情見表2。

表2 止血作用的變化隨煎煮時間不同的影響情況 （，n=12）

表2 止血作用的變化隨煎煮時間不同的影響情況 （，n=12）

煎煮時間/min劑量/6.25 g/kg　凝血時間/s　出血時間/min空白15 30 45 60 90 120 180 -6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 6.25 82.2±5.67 56.7±6.32 52.2±5.27 48.9±4.98 45.2±4.67 47.2±3.95 56.2±5.26 76.8±6.93 7.22±0.67 5.67±0.49 5.12±0.53 4.59±0.62 4.37±0.43 4.97±0.56 5.45±0.49 6.69±0.78

4 討論

地黃為玄參科地黃屬多年生草本植物，由于其塊根顏色為黃白色而得名。其藥用部位主要為根部。由于其炮制方法的不同，常將地黃分為鮮地黃以及干地黃和熟地黃三種。梓醇是地黃的主要藥理活性成分，具有抗炎、抗癌、止血以及利尿等功效。梓醇的含量在鮮地黃中最高，經(jīng)過一定的炮制過程后，梓醇含量往往會降低甚至消失。在我國，含有梓醇成分的植物種類非常多，在地黃中尤為突出，這為梓醇的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了堅實(shí)的資源保障。由于梓醇具有十分廣泛的藥理活性，因此對梓醇以及梓醇衍生物的研究成為廣大研究者們的重點(diǎn)課題，研究的方向主要包括梓醇及其梓醇衍生物之間的化學(xué)轉(zhuǎn)化，兩者之間的藥效學(xué)關(guān)系等。為探究在加工炮制地黃的過程中其藥理活性改變的內(nèi)在機(jī)制，我們更應(yīng)該將研究的重點(diǎn)放在梓醇以及梓醇降解后的生成物活性方面，從而為臨床開發(fā)新的有效地治療藥物提供一定的指導(dǎo)作用［2-4］。

在本研究中，我們通過對比分析了地黃煎煮液中不同煎煮時間里梓醇含量的變化情況，以及隨煎煮時間的不同其對小鼠的止血作用的變化情況。在研究其動態(tài)變化的同時，找到煎煮地黃的最佳時間，并探討了各因素之間的內(nèi)在聯(lián)系。研究結(jié)果表明，地黃煎煮液中梓醇含量的變化隨煎煮時間的不同而不同，剛開始梓醇含量隨煎煮時間的加長而升高，煎煮時間為60 min時含量達(dá)到最高；之后梓醇含量隨煎煮時間的繼續(xù)加長而呈逐漸降低狀態(tài)。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是由于梓醇為環(huán)烯醚萜苷類化合物，其熱穩(wěn)定性并不高。在地黃煎煮的過程中，隨著煎煮時間的逐漸變長，使得梓醇成分慢慢揮發(fā)，從而導(dǎo)致含量越來越低。這一理論也為梓醇進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供了可靠地理論基礎(chǔ)［5-6］。另外，在小鼠的出血時間以及凝血時間方面的比較上，除煎煮時間為180 min組之外，其他各給藥組與空白組相對比小鼠的出、凝血時間均有縮短，各給藥組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01。但180 min組與空白組的對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這一研究結(jié)果表明，地黃的煎煮液具有一定程度的止血功效，并且其止血功效會隨著地黃煎煮時間長短的不同而表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。該規(guī)律可總結(jié)為：在一定的煎煮時間范圍內(nèi)，煎煮液的止血功效會隨著煎煮時間的加長而增強(qiáng)；超過該煎煮時間范圍后，煎煮液的止血功效反而會隨著煎煮時間的加長而降低［7］。研究結(jié)果表明，當(dāng)煎煮時間在45～90 min時，其煎煮液的止血效果最好。而在此煎煮時間內(nèi)，煎煮液中的梓醇含量也是相對較高的。換句話說，即當(dāng)煎煮液中梓醇的含量相對較高時其具有較好的止血作用，這也進(jìn)一步說明了地黃的止血功效與其中所含的藥理活性物質(zhì)梓醇有關(guān)［8-9］。

綜上所述，我們通過對比分析找到了煎煮地黃的最佳時間，并探討了各因素之間的內(nèi)在聯(lián)系。本次研究的結(jié)果也表明，地黃煎煮液中梓醇含量的變化隨煎煮時間的不同而不同，剛開始梓醇含量隨煎煮時間的加長而升高，之后梓醇含量隨煎煮時間的繼續(xù)加長而呈逐漸降低狀態(tài)。另外，在小鼠的出血時間以及凝血時間方面的比較上，其他各給藥組也與空白組相對比小鼠的出、凝血時間也有十分顯著的差異。由研究結(jié)果可知，在一定的煎煮時間范圍內(nèi)，煎煮液的止血功效會隨著煎煮時間的加長而增強(qiáng)；超過該煎煮時間范圍后，煎煮液的止血功效反而會隨著煎煮時間的加長而降低。因此，當(dāng)煎煮液中梓醇的含量相對較高時其具有較好的止血作用，這就說明了地黃的止血功效與其中所含的藥理活性物質(zhì)梓醇有關(guān)。我們通過探討煎煮時間對煎煮液中梓醇含量的變化影響，對比分析不同煎煮時間下煎煮液對小鼠的止血功效可知，不僅梓醇含量的高低受到煎煮時間很大的影響，止血作用的強(qiáng)度也受煎煮時間很大的影響［10-11］。該變化規(guī)律有利于對地黃的研究，更為闡述地黃具有涼血作用的藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制提供了很大的指導(dǎo)作用，為其在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

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【中圖分類號】R242

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）10-0134-03

doi:10.3969/j.issn.1674-9316.2016.10.095

作者單位：濱州市無棣縣人民醫(yī)院藥劑科，山東 濱州 251900

The Comparative Study of Dynamic Change Regularity of Catalpol in Different Time and Decoction of Rehmannia Decoction Process and Its Hemostatic Effect

YANG Bingchen Pharmacy Department，People's Hospital Wuli Country，Binzhou Shandong 251900，China

【Abstract】