張雅嫻，白麗云，王占黎，王　英，于　慧

?

活化TLR9的牛種布氏菌基因外重復(fù)回文序列篩選及活性檢測(cè)

張雅嫻1.4，白麗云2，王占黎2，王英2，于慧3

1.包頭醫(yī)學(xué)院，包頭014040;2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院, 包頭014040;3.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院, 包頭014040;4.赤峰市疾控中心, 赤峰024000

摘要：目的篩選具有活化Toll樣受體9(TLR9)的牛種布氏菌基因外重復(fù)回文序列(Repetitive Extragenic Palindrome Squence, REPs)并檢測(cè)其活性，為布氏菌病的治療提供新思路。方法基于Brucella abortus A13334基因組序列，利用生物信息學(xué)技術(shù)識(shí)別其REPs后，合成序列。將合成的天然骨架的脫氧寡核苷酸(ODNs)轉(zhuǎn)染小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7，以ELISA檢測(cè)IFN-α的分泌水平。采用TLR9-siRNA沉默RAW264.7中的TLR9，將上述誘導(dǎo)IFN-α分泌增加的陽(yáng)性O(shè)DN序列轉(zhuǎn)染RAW264.7，ELISA方法檢測(cè)IFN-α的分泌變化。結(jié)果篩選出1 857條牛種布氏菌REPs，選擇2級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)較好的5條ODNs序列進(jìn)行合成，ELISA方法檢測(cè)顯示ODNs M4、M5介導(dǎo)IFN-α分泌量顯著高于陰性對(duì)照(P<0.05)，且陽(yáng)性O(shè)DN M5所介導(dǎo)的IFN-α分泌可以被TLR9-siRNA顯著抑制。結(jié)論布氏菌基因組中存在可以活化TLR9信號(hào)通路的REPs，此結(jié)果有助于對(duì)布氏菌致病和免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

關(guān)鍵詞：牛種布氏菌；基因外重復(fù)回文序列；巨噬細(xì)胞；Toll樣受體9；α-干擾素

布氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)是由布氏菌(Brucella)引起的人畜共患傳染病，在全世界都有流行，尤其是在沒(méi)有適當(dāng)預(yù)防和控制措施的發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)，包括拉丁美洲、亞洲、非洲、地中海地區(qū)等，每年新增病例 50 余萬(wàn)人[1]。近年來(lái)，我國(guó)布病疫情持續(xù)上升。據(jù)衛(wèi)生部網(wǎng)站統(tǒng)計(jì)，2011 年共報(bào)告人間布病發(fā)病42 654例，發(fā)病率為3.18/10萬(wàn)，與2010年比較上升21.16%[2]。2013年我國(guó)布病發(fā)病人數(shù)46 089人，為歷年新高，2014年發(fā)病率達(dá)3.21/10萬(wàn)，布病的防控與治療工作刻不容緩。

布氏菌進(jìn)入機(jī)體后，感染的靶細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞[3]。免疫細(xì)胞內(nèi)的Toll樣受體 (Toll-like receptors, TLRs)對(duì)布氏菌發(fā)揮重要免疫防御作用[4]。TLRs是免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體, 參與病原相關(guān)分子模式 (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) 的識(shí)別，從而誘導(dǎo)機(jī)體免疫防御反應(yīng)。最新研究發(fā)現(xiàn)，與其他TLRs成員相比，TLR9更能有效清除感染動(dòng)物體內(nèi)的布氏菌。Oliveira等研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，TLR9基因敲除小鼠更易感染布氏菌[5]。TLR9主要通過(guò)胞內(nèi)髓樣分化因子88(Myd88)招募一系列信號(hào)分子，活化核因子NF-κB, 進(jìn)而引起IFN-α等炎性因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)。最近研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、假單胞菌屬假單胞菌和腦膜炎奈瑟氏球菌等革蘭性陰性菌來(lái)源的基因外重復(fù)回文序列(Repetitive Extragenic Palindrome Squence, REPs)可經(jīng)TLR9活化機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而產(chǎn)生大量IFN-α[6]。此外，參與REPs刺激TLR9產(chǎn)生免疫作用在用B6.129P2 - TLR9tm1Aki基因敲除的小鼠身上中也得到了證實(shí)。在大腸埃希氏菌，沙門氏菌，假單胞菌屬假單胞菌，和腦膜炎奈瑟氏球菌中，甲基化的REPs或刪除CpG基序后無(wú)刺激作用進(jìn)一步證實(shí)了對(duì)于天然細(xì)菌DNA的免疫刺激作用是依賴在未甲基化CpG基序。而REPs是包含CpG基序的DNA序列。與其他革蘭氏陰性菌相似，布氏菌基因組中也存在REPs。但是，布氏菌DNA中REPs是否引起TLR9介導(dǎo)的免疫活化效應(yīng)，目前尚不清楚。本研究旨在尋找牛種布氏菌 (Brucella abortus)DNA中能夠活化TLR9的REPs，研究結(jié)果對(duì)于探討布氏菌感染引起的免疫失衡具有重要意義。

1材料與方法

1.1主要試劑高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及減血清培養(yǎng)液(Opti-MEM) 購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，青霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，天然骨架脫氧寡核苷酸(ODNs)由上海生工生物工程股份有限公司合成，Lipofectamine 3000由Invitrogen公司提供，ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Affymetrix公司。

1.2主要儀器二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，移液器均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，電子天平購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning 公司。

1.3牛種布氏菌REPs的篩選以國(guó)內(nèi)外公開報(bào)道的BrucellaabortusA13334基因組信息為研究對(duì)象(chromosome 1: NC_016795.1, GI:363399402. chromosome 2: NC_016777.1, GI: 363401588)。采用EMBOSS Cpgplot軟件定位CpG島，利用自主研發(fā)的C++程序進(jìn)一步搜索REPs，采用軟件Primer premier 5.0分析上述REPs的回文結(jié)構(gòu)。

1.4天然骨架ODNs的合成針對(duì)上述獲得的牛種布氏菌DNA的REPs，采用DNA合成儀合成天然磷酸二酯骨架ODNs來(lái)替代天然REPs，經(jīng)HPLC純化后，260 nm紫外定量后真空干燥，-20 ℃保存?zhèn)溆?上海生工生物工程股份有限公司)。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染參照文獻(xiàn)[7]方法培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，按1.0×104個(gè)/孔接種于96孔板中。至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，密度約為80%時(shí)，采用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000 (Opti-MEM配制) 轉(zhuǎn)染ODNs，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換為10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集上清。

1.6ELISA檢測(cè)IFN-α水平收集上述96孔板細(xì)胞培養(yǎng)上清，空白孔加入等體積的樣品稀釋液，按產(chǎn)品說(shuō)明書步驟操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)IFN-α的濃度。

1.7TLR9-siRNA轉(zhuǎn)染小鼠TLR9-siRNA序列為5′-CCA ACA UCC UGG UUC UAG AUG CUA A-3′(購(gòu)自Invitrogen公司)。按照上述方法將細(xì)胞RAW264.7接種于96孔板中，至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，密度約為80%時(shí)，采用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染TLR9-siRNA，并以陰性siRNA作為對(duì)照。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換為10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照上述方法轉(zhuǎn)染ODNs，ELISA檢測(cè)IFN-α水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1牛種布氏菌基因組DNA中REPs的篩選采用生物信息學(xué)技術(shù)共搜索到1857個(gè)REPs，并從中選擇出回文結(jié)構(gòu)較好的5條序列進(jìn)行合成，見(jiàn)表1。M1-M5為合成的樣本ODNs，MC1為陽(yáng)性對(duì)照ODN 2216(A型人TLR9激動(dòng)劑)，MC2為陰性對(duì)照。

表1合成的ODNs序列Tab.1Synthetic ODN sequences

名稱序列(5'—3')長(zhǎng)度/bpNameSequence(5'—3')length(bp)M1GTAGATTTGACGGCAAAT18M2GTAGCGCCCGGACTTCAC-CGGGCG24M3GTAGCGGAAGTTTTCCG17M4GTAGGTTTCGATGAAAC17M5GTAGCCGCCCCAAGGGCG18MC1GGGGGACGATCGTCGGGGGG20MC2GGGGGAGCATGCTAGGGGGG20

2.2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染前后RAW264.7的細(xì)胞狀態(tài)培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞鋪板，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染合成的ODNs，轉(zhuǎn)染6 h后細(xì)胞狀態(tài)，見(jiàn)圖1。

(A) Before transfection; (B) Transfection of ODNs for 6 h

圖1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染前后RAW264.7的細(xì)胞狀態(tài)。(A) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染前；(B) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染6h后

Fig.1Morphology of RAW264.7 cells before and after transfection of ODNs with Lipofectamine

2.3牛種布氏菌REPs對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IFN-α的影響ELISA結(jié)果顯示，M1、M2、M3、M4、M5共5個(gè)序列的IFN-α分泌濃度大于陰性序列MC2(圖2)。采用t檢驗(yàn)分別比較上述序列與陰性對(duì)照組之間IFN-α濃度的差異，結(jié)果顯示，M4、M5序列與陰性對(duì)照序列相比，IFN-α濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.649，P=0.010；t=16.572，P=0.000)，提示上述序列可引起炎性因子IFN-α分泌的增加。

注：數(shù)字代表不同序列分泌IFN-α含量，*代表與MC2對(duì)照序列相比，IFN-α含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

The numbers represent the IFN-α production induced by REP sequences, *P<0.05 as compared with control sequence MC2.

圖2不同REPs轉(zhuǎn)染細(xì)胞后誘導(dǎo)IFN-α的分泌

Fig.2Induction of IFN-αproduction by REP sequences fromBrucellaabortus

2.4TLR9-siRNA對(duì)牛種布氏菌REPs所介導(dǎo)的IFN-α分泌的影響陽(yáng)性O(shè)DN序列M5+TLR9-siRNA組與陰性對(duì)照MC2組相比所介導(dǎo)的IFN-α分泌無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.975，P=0.385)，與M5+陰性siRNA組比較，M5+TLR9-siRNA組IFN-α分泌顯著降低(t=16.525，P=0.000)。提示IFN-α分泌可以被TLR9-siRNA顯著抑制。與M5序列相比，M5+陰性siRNA組所介導(dǎo)的IFN-α分泌沒(méi)有明顯影響(t=2.034，P=1.112)，與陰性對(duì)照MC2相比，M5+陰性siRNA組IFN-α分泌有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.835，P=0.000)(圖3)。這些結(jié)果提示，牛種布氏菌REPs在巨噬細(xì)胞中是經(jīng)TLR9信號(hào)通路影響IFN-α的分泌，進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

注：與M5+陰性siRNA組相比，IFN-α分泌含量P<0.05；與MC2相比，IFN-α分泌含量P<0.05。

*P<0.05 as compared with M5+ negative siRNA; #P<0.05 as compared with control sequence MC2.

圖3TLR9-siRNA對(duì)牛種布氏菌REPs所介導(dǎo)的IFN-α分泌的影響

Fig.3Effects of TLR9-siRNA on the levels of IFN-α mediated by REPs fromBrucellaabortusDNA

3討論

布氏菌是革蘭氏染色陰性胞內(nèi)寄生菌，進(jìn)入機(jī)體后主要以巨噬細(xì)胞與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞為宿主細(xì)胞。在布氏菌細(xì)胞免疫機(jī)制的研究中，過(guò)去大多針對(duì)脂多糖和外膜蛋白等引起免疫應(yīng)答的抗原進(jìn)行探討。Magnusson等發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性細(xì)菌的REPs序列具有免疫活化功能[6]。研究還發(fā)現(xiàn)，含GTAG基序的REPs對(duì)人和大部分家畜的免疫細(xì)胞刺激作用較強(qiáng)[8]。然而，布氏菌基因組DNA中是否存在具有免疫活性的REPs，目前未見(jiàn)報(bào)道。本文采用生物信息學(xué)方法識(shí)別牛種布氏菌DNA中的含有GTAG基序的REPs，通過(guò)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，發(fā)現(xiàn)2個(gè)REPs序列(M4、M5)能夠誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌IFN-α，提示其具有免疫活化功能。

TLRs是天然免疫中重要的模式識(shí)別受體，其中，TLR9是TLRs家族成員之一，存在于全身各組織中。TLR9主要通過(guò)識(shí)別未甲基化的CpG 基序來(lái)激活免疫細(xì)胞[9]。其識(shí)別病原菌DNA后胞內(nèi)髓樣分化因子88(Myd88)c一端與TIR區(qū)發(fā)生同源性相互作用，DD端募集含有“死亡”功能域的相關(guān)激酶(IRAKs)家族，導(dǎo)致IRAKs磷酸化進(jìn)入胞漿，激活NF-κB，激酶抑制物(IKKs)，使得核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制成分IKB磷酸化而降解并與NF-κB分離，使核因子NF-κB激活而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中，誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，分泌炎癥因子(如IFN-α，IL．6，IL．8)，化學(xué)趨化因子等，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。REPs含有豐富的非甲基化CpG基序，并且是回文結(jié)構(gòu)(即莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu))，在DNA生理學(xué)和基因組可塑性中起著重要作用[10]。因此，我們猜測(cè)，牛種布氏菌DNA來(lái)源的REPs序列可能通過(guò)TLR9誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IFN-α的分泌。為了證實(shí)上述猜測(cè)，我們使用TLR9-siRNA沉默小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)TLR9表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)M5介導(dǎo)的IFN-α分泌被顯著抑制，提示TLR9信號(hào)通路介導(dǎo)了REPs誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IFN-α的分泌。

目前，化學(xué)合成的寡核苷酸作為TLR9激動(dòng)劑已廣泛應(yīng)用于腫瘤、感染性疾病、哮喘等疾病的治療[11]。從牛種布氏菌DNA發(fā)現(xiàn)具有活化TLR9活性的REPs序列，不僅有助于深入探討布氏菌致病機(jī)制與細(xì)胞免疫機(jī)制，還有助于發(fā)現(xiàn)新的TLR9激動(dòng)劑先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，為布魯士菌病的防治提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] Galińska EM, Zagórski J. Brucellosis in humans—etiology, diagnostics, clinical forms[J]. Ann Agric Environ Med, 2013, 20(2): 233-238.

[2] Li TF,Liu FQ,Wang Y,et al.Surveillance results analysis of human brucellosis in 2011[J]. Chin J Ctrl Endem Dis，2013,28(1),46-47.(in Chinese)

李鐵鋒,劉鳳岐,王贏等.2011 年全國(guó)布魯桿菌病監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J].中國(guó)地方病防治雜志,2013,28(1),46-47.

[3] Celli J. Surviving inside a macrophage: the many ways ofBrucella[J]. Res Microbiol, 2006, 157(2): 93-98. DOI:10.1016/j.resmic.2005.10.002

[4] Gomes MT, Campos PC, de Almeida LA, et al. The role of innate immune signals in immunity toBrucellaabortus[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2012, 2: 130. DOI: 10.3389/fcimb.2012.00130

[5] Oliveira SC, de Almeida LA, Carvalho NB, et al. Update on the role of innate immune receptors duringBrucellaabortusinfection[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2012, 148(1/2): 129-135. DOI: 10.1016/j.vetimm.2011.05.036

[6] Magnusson M, Tobes R, Sancho J, et al. Cutting edge: natural DNA repetitive extragenic sequences from gram-negative pathogens strongly stimulate TLR9[J]. J Immunol, 2007, 179(1): 31-35. DOI:10.4049/jimmunol.179.1.31

[7]Zhu J,Hu D,Liu LN,et al.Research on the role of capsular sialic acid inStreptococcussuisactivate macrophage TLR2-AKT-NF-κB signaling pathway[J].Microbiol China，2013, 40(6): 1058-1067. (in Chinese)

朱靜,胡丹,劉麗娜等.莢膜唾液酸對(duì)豬鏈球菌激活巨噬細(xì)胞TLR2-AKT-NF-κB 信號(hào)通路影響的研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2013,40(6):1058-1067.

[8] Di Nocera PP, De Gregorio E, Rocco F. GTAG- and CGTC-tagged palindromic DNA repeats in prokaryotes[J]. BMC Genomics, 2013, 14: 522. DOI: 10.1186/1471-2164-14-522

[9] Manuja A, Manuja BK, Kaushik J, et al. Immunotherapeutic potential of CpG oligodeoxynucleotides in veterinary species[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2013, 35(5): 535-544. DOI: 10.3109/08923973.2013.828743

[10] Jaroslav N, Tereza H, Irena L. Identification and characterization of repetitive extragenic palindromes (REP)-associated tyrosine transposases: implications for REP evolution and dynamics in bacterial genomes[J]. BMC Genomics, 2010, 11: 44. DOI: 10.1186/1471-2164-11-44

[11] Gosu V, Basith S, Kwon OP, et al. Therapeutic applications of nucleic acids and their analogues in Toll-like receptor signaling[J]. Molecules, 2012, 17(11): 13503-13529. DOI: 10.3390/molecules171113503

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.006

通訊作者：于慧，Email：huiyu2008@hotmail.com

中圖分類號(hào)：R183.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)05-447-04

Corresponding author:Yu Hui, Email: huiyu2008@hotmail.com

收稿日期：2015-08-04修回日期：2016-02-22

Screening and detection of repetitive extragenic palindromic sequences with TLR9 agonistic activity fromBrucellaabortusDNA

ZHANG Ya-xian1.2, BAI Li-yun2, WANG Zhan-li2, WANG Ying2, YU Hui3

(1.BaotouMedicalCollege,Baotou014040,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China;3.TheSecondAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China;4.ChifengCityforDiseaseControlandPrevention,Chifeng024000,China)

Abstract:The aim of this study was to screen natural DNA sequences named repetitive extragenic palindromic sequences (REPs) with TLR9 agonistic activity from Brucella abortus DNA. Complete genome sequence of Brucella abortus A13334 was available in GenBank. A total of 1 857 REP sequences in Brucella abortus was identified. Bioinformatics technology was used to identify Brucella abortus REPs. Five REP sequences were synthesized for further detecting the TLR9 agonistic activity. Phosphodiester ODNs representing the selected ODNs were then synthesized. Murine macrophage RAW264.7 were cultured and transfected with ODNs mediated by lipofectamine 3000. The content of IFN-α in the supernatant was then measured by ELISA. We found that IFN-α expression was significantly increased in RAW264.7 treated with M4 and M5. In addition, TLR9-siRNA was used to down regulate TLR9 expression. IFN-α levels were examined in RAW264.7 transfected with TLR9-siRNA upon ODN stimulation. Results showed TLR9-siRNA could significantly reduce the levels of IFN-α in RAW264.7 treated with M5. This work demonstrated that REP sequences present in Brucella abortus DNA were able to produce macrophages stimulation through TLR9.

Key words:Brucella abortus; repetitive extragenic palindrome sequence; macrophages; toll-like receptor 9; IFN-α Supported by the the Natural Science Foundation of China(No.81360242) and China National Funds for Distinguished Young Scientists(No.2014JQ04) and the Natural Science Foundation of Inner Mongolia(Nos.2014MS0808,2015 MS0810)

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81360242)；內(nèi)蒙古杰出青年培育基金(No.2014JQ04)和內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金(No.2014MS0808，No.2015MS0810)聯(lián)合資助