王曉宇+陳冠儒+鄧子云+趙杰+葛金芳+李寧+陳飛虎

[收稿日期] 2013-10-17

[基金項目] 國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2009ZX0912-386）

[通信作者] *陳飛虎，Tel：（0551）65161116，E-mail：cfhchina@sohu.com；*李寧，Tel：（0551）65161115，E-mail：ln0110@sina.com

[作者簡介] 王曉宇，碩士研究生，Tel：13739250818，E-mail：wxy891017@163.com

[摘要] 對鬼針草Bidens bipinnata中的化學成分進行研究，篩選具有抗肝纖維化活性單體。采用大孔樹脂、硅膠、MCI樹脂、Sephadex LH-20等方法進行分離純化，得到15個化合物，并運用波譜技術測試，鑒定其結(jié)構(gòu)為槲皮素（1），槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷（2），紫云英苷（3），山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（4），5，3′-二羥基-3，6，4′-三甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷黃酮（5），7，8，3′，4′-四羥基二氫黃酮（6），（R/S）-異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷（7），（R/S）-異奧卡寧-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷（8），6，7，3′，4′-四羥基橙酮（9），海生菊苷（10），6，7-二羥基香豆素（11），3-咖啡酸?；?2-甲基-D-赤蘚糖酸-1，4內(nèi)酯（12），（7S，8R）苯并二氫呋喃新木脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷（13），丁香酚-O-β-D-呋喃芹糖-（1″-6′）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（14），（+）丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（15）。其中化合物8，13～15為首次從本屬植物中分離得到。在初步的活性篩選中化合物1，6有較強體外抑制肝星狀細胞增殖的能力；化合物1，2，6，7有較強體外抑制腹腔巨噬細胞分泌炎癥因子的能力。

[關鍵詞] 鬼針草；化學成分；抗肝纖維化；肝星狀細胞；巨噬細胞

鬼針草Bidens bipinnata L.是菊科鬼針草屬一年生草本植物，在我國大部分地區(qū)均有分布。民間藥用歷史悠久，具有有清熱解毒、涼血止血、散瘀、消腫等功效，主治感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、肝炎及蛇蟲咬傷等。目前，各國學者對鬼針草屬植物的化學成分進行廣泛研究，其中主要包括黃酮類，聚乙炔類等成分。此外，本課題組前期藥理學研究也表明，鬼針草具有抗肝纖維化的功效，其總黃酮提取物對于小鼠肝損傷以及大鼠肝纖維化均有保護作用^[1-3]。為了更大程度的利用鬼針草藥材，得到具有抗肝纖維化活性的具體成分，本實驗對鬼針草總黃酮提取物化學成分進行系統(tǒng)分離，并且將得到的化合物進行體外抗肝星狀細胞增殖以及抑制腹腔巨噬細胞生成腫瘤壞死因子TNF-α和 IL-1的活性研究，為進一步開發(fā)利用鬼針草提供依據(jù)。

1 材料

AM-400，DRX-500型核磁共振光譜儀（瑞士Bruker公司，四甲基硅烷作為內(nèi)標）；Agilent 1260-6224液質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；HPD 100大孔樹脂（河北寶恩公司）；Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences公司）；MCI（日本Mitsubishi Chemical公司）；柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；薄層色譜GF254硅膠板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；肝星狀細胞HSC-T6（中南大學湘雅醫(yī)學院）；小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7（中國科學院上海細胞研究所）；LPS（美國Sigma）；Elisa試劑盒（美國R&D公司）；DMEM和FBS（美國Hyclone）。鬼針草采集于安徽省績溪縣，經(jīng)安徽醫(yī)科大學藥學院中藥學教研室張群林教授鑒定，屬于菊科鬼針草屬鬼針草B. bpinnata，標本號為JX053。

2 方法

2.1 提取分離 55 kg鬼針草干燥全草，用70%乙醇提取2次，提取液蒸發(fā)至無醇味，過HPD 100大孔樹脂，分別用3倍柱體積雙蒸水和70%乙醇作為洗脫劑，收集70%乙醇洗脫部分，蒸干，得到浸膏1.8 kg。浸膏用水分散，再次過HPD 100大孔樹脂，采用10%～100%乙醇進行洗脫，共得到5個部分，B1～B5。B3（280 g）部分用硅膠柱色譜（氯仿-甲醇 10∶1～1∶1）梯度洗脫得到7個部分，B3-1～B3-7。B3-1 經(jīng)過Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脫、硅膠色譜（石油醚-乙酸乙酯 5∶1～1∶1）梯度洗脫得到化合物11（6 mg），12（10 mg）。B3-2經(jīng)過Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脫得到B3-2-1～B3-2-6；B3-2-1采用Sephadex LH-20（100%乙醇）得到化合物6（55 mg）；B3-2-6經(jīng)過MCI（30%～100%甲醇）得到化合物15（54 mg）。B3-4經(jīng)過Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脫得到B3-4-1和B3-4-8；B3-4-1采用硅膠柱色譜（氯仿-甲醇 5∶1～1∶1）分離純化，得到化合物8（10 mg），13（25 mg）；B3-4-5 采用硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯 5∶1～1∶5）進行梯度洗脫得到化合物4（8 mg）。B3-6采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脫得到B3-6-1～B3-6-7；B3-6-1采用凝膠（100%乙醇）純化得到化合物14（100 mg）；B3-6-2和B3-6-7均采用MCI（0～100%甲醇）分別得到化合物7（27 mg），9（23 mg）。B3-6-4采用MCI（0～100%甲醇）以及反復的硅膠柱色譜（氯仿-甲醇 20∶1～4∶1）純化得到化合物2（25 mg）。B3-7采用硅膠柱色譜（氯仿-甲醇 20∶1～1∶1）得到B3-7-1～B3-7-10；B3-7-1采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脫得到化合物1（45 mg）；B3-7-3先后采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）以及MCI（30%～100%甲醇）得到化合物3（20 mg），5（17 mg），10（23 mg）。endprint

2.2 四甲基偶氮唑法（MTT） HSC-T6細胞培養(yǎng)于10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的細胞（5×103細胞/孔）接種于96孔板中，待細胞貼壁加入不同濃度化合物（200，100，50，25，12.5 μmol·L^-1），每個劑量設5個復孔，培養(yǎng)48 h后棄去上清。每孔加入20 μL濃度為5 g·L^-1的MTT和180 mL無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清。加入150 mL的DMSO，震蕩后用酶標儀在波長490 nm測吸光度，重復3次。

2.3 IL-1和TNF-α含量測定 RAW264.7細胞培養(yǎng)于10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。取對數(shù)生長期的細胞（1×105細胞/孔）接種于24孔板中，培育養(yǎng)2 h后用分別加入LPS（1 mg·L^-1）和不同濃度化合物（100，10，1 μmol·L^-1）繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)液的上清液于4 ℃，3 000 r·min^-1離心10 min，-20 ℃保存待測。IL-1和TNF-α含量測定按ELISA試劑盒給定的步驟進行操作。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 301.034 5[M-H]-（C15H9O7，計算值301.035 4）； 1H-NMR（CD₃COCD₃，400 MHz）δ：7.82（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.69（1H，dd，J=8.5，1.8 Hz，H-6′），6.99（1H，d，J=8.5 Hz，H-5′），6.52（1H，d，J=1.6 Hz，H-8），6.26（1H，d，J=1.6 Hz，H-6）； 13C-NMR（CD₃COCD₃，100 MHz）δ：146.9（C-2），136.7（C-3），176.5（C-4），157.8（C-5），99.2（C-6），165.1（C-7），94.5（C-8），162.3（C-9），104.1（C-10），123.7（C-1′），115.8（C-2′），145.9（C-3′），148.4（C-4′），116.3（C-5′），121.5（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道槲皮素的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物2 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 471.089 7[M+Na]+ （C21H20NaO11，計算值471.089 8）； 1H-NMR（CD₃OD，400 MHz）δ：7.33（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.30（1H，dd，J=8.3，1.9 Hz，H-6′），6.91（1H，d，J=8.3 Hz，H-5′），6.36（1H，d，J=1.9 Hz，H-8），6.19（1H，d，J=1.9 Hz，H-6），5.35（1H，br s，H-1″），4.22～3.69（4H，m，H-2″～5″），0.93（3H，d，J=6.6 Hz，H-6″）。以上數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)與文獻[5]報道槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物3 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 471.089 7[M+Na]+（C₂₁H₂₀NaO₁₁，計算值471.089 8）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.04（2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），6.88（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.43（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.20（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.46（1H，d，J=7.3 Hz，H-1″），3.57（1H，d，J=11.4 Hz，H-6″a），3.33（1H，m，H-6″b），3.41～3.09（4H，m，H-2″～5″）。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道紫云英苷的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物4 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 455.094 9[M+Na]+（C21H20NaO10，計算值471.094 9）； 1H-NMR（CD₃COCD₃，400 MHz）δ：7.86（2 H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），7.02（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.47（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.27（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.54（1H，d，J=1.2 Hz，H-1″），4.22～2.20（4H，m，rha-H），0.90（3H，d，J=5.7 Hz，6″-CH3）； 13C-NMR（CD₃COCD₃，100 MHz）δ：158.0（C-2），135.7（C-3），179.3（C-4），163.2（C-5），99.6（C-6），165.0（C-7），94.6（C-8），160.9（C-9），105.8（C-10），122.6（C-1′），131.7（C-2′，6′），116.3（C-3′，5′），158.5（C-4′），102.7（C-1″），71.5（C-2″），72.2（C-3″），73.0（C-4″），71.4（C-5″），17.8（C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物5 黃色粉末；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.55（1H，d，J=7.4，2.0 Hz，H-6′），7.54（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），7.08（1H，d，J=7.4 Hz，H-5′），6.95（1H，s，H-8），5.13（1H，d，J=7.12 Hz，H-1″），3.86（3H，s，4′-OMe），3.80（3H，s，3-OMe），3.77（3H，s，6-OMe），3.74（1H，m，H-6″a），3.51（1H，m，H-6″b），3.49（1H，m，H-5″），3.36（2H，m，H-2″，3″），3.23（1H，m，H-4″）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：178.6（C-4），156.7（C-2），156.2（C-7），152.3（C-5），151.5（C-9），150.6（C-4′），146.5（C-3′），138.2（C-3），132.4（C-6），122.4（C-1′），120.8（C-6′），115.3（C-2′），112.0（C-5′），106.5（C-10），100.3（C-1″），94.3（C-8），77.4（C-3″），76.9（C-5″），73.4（C-2″），69.8（C-4″），60.9（C-6″），60.6（4′-OMe），60.0（3-OMe），55.9（6-OMe）。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道5，3′-二羥基-3，6，4′-三甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷黃酮數(shù)據(jù)基本一致。endprint

化合物6 黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 311.052 2[M+Na]+（C₁₅H₁₂NaO₆，計算值311.052 6）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.17（1H，d，J=8.6 Hz，H-6′），6.94（1H，s，H-2′），6.80（1H，d，J=8.1 Hz，H-5′），6.75（1H，d，J=8.1 Hz，H-5），6.52（1H，d，J=8.6 Hz，H-6），5.38（1H，dd，J=11.8，2.8 Hz，H-2），3.03（1H，dd，J=16.7，2.8 Hz，H-3），2.68（1H，dd，J=16.7，2.8 Hz，H-3）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：79.2（C-2），43.5（C-3），190.7（C-4），117.4（C-5），109.7（C-6），152.5（C-7），132.9（C-8），151.2（C-9），114.5（C-10），130.2（C-1′），114.4（C-2′），145.2（C-3′），145.6（C-4′），115.3（C-5′），118.0（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道7，8，3′，4′-四羥基二氫黃酮的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物7 白色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 473.105 1[M+Na]+（C₂₁H₂₂NaO₁₁，計算值473.105 4）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.23（1H，d，J=8.8 Hz，H-5），6.92（1H，s，H-2′），6.86（1H，d，J=8.9 Hz，H-6），6.77（1H，s，H-6′），6.75（1H，s，H-5′），5.39（1H，dd，J=12.4，3.2 Hz，H-2），3.71（1H，d，J=8.0 Hz，H-6″a），3.48（1H，m，H-6″b），3.40～3.16（4H，H-2″～5″），3.11（1H，dd，J=16.7，2.8 Hz，H-3a），2.69（1H，dd，J=17.0，2.8 Hz，H-3b）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：79.3（C-2），43.5（C-3），191.2（C-4），118.0（C-5），109.0（C-6），150.5（C-7），135.2（C-8），150.8（C-9），116.6（C-10），129.9（C-1′），114.5（C-2′），145.7（C-3′），145.2（C-4′），115.3（C-5′），116.4（C-6′），101.5（C-1″），73.2（C-2″），75.7（C-3″），69.7（C-4″），77.3（C-5″），60.7（C-6″）。核磁譜圖顯示為一組同分異構(gòu)體，以上數(shù)據(jù)與文獻[10]中報道異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷的數(shù)據(jù)基本一致，且異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷僅有一個2位碳為手性中心，因此可確定該組化合物結(jié)構(gòu)為異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷（2R）（7a），異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖（2S）（7b）。

化合物8 白色粉末；1H-NMR（CD₃COCD₃，300 MHz）δ：7.58（1H，d，J=8.8 Hz，H-5），7.28（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.1（1H，dd，J=8.1，1.9 Hz，H-6′），6.89（1H，d，J=4.4 Hz，H-5′），6.62（1H，d，J=8.7 Hz，H-6），5.55（1H，dd，J=12.9，2.9 Hz，H-2），4.78（1H，dd，J=7.3 Hz，H-1″），3.91（1H，d，J=3.0 Hz，H-OMe），3.58（1H，m，H-6″a），3.46（1H，m，H-6″b），3.34～3.14（4H，H-2″～ 5″），3.05（1H，m，H-3a），2.77（1H，m，H-3b）； 13C-NMR（CD₃COCD₃，100 MHz）δ：81.1（C-2），44.7（C-3），190.7（C-4），124.6（C-5），111.1（C-6），156.5（C-7），134.0（C-8），157.9（C-9），115.8（C-10），131.5（C-1′），111.3（C-2′），147.8（C-3′），148.5（C-4′），116.1（C-5′），120.2（C-6′），107.0（C-1″），75.0（C-2″），77.4（C-3″），71.0（C-4″），78.1（C-5″），62.4（C-6″），56.5（3′-OCH3）。核磁譜圖顯示為一組同分異構(gòu)體，以上數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)與文獻[11]報道異奧卡寧-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷的數(shù)據(jù)基本一致，且異奧卡寧-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷只有一個2位碳為手性中心，因此可確定此組化合物結(jié)構(gòu)為異奧卡寧-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷（2R）（8a），異奧卡寧-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷（2R）（8b）。

化合物9 橘紅色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 301.037 4[M-H]-（C15H9O7，計算值301.035 4）；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.45（1H，s，H-2′），7.37（1H，d，J=8.2 Hz，H-6′），7.11（1H，d，J=8.1 Hz，H-4），6.85（1H，d，J=8.2 Hz，H-5′），6.73（1H，d，J=8.3 Hz，H-5），6.61（1H，s，H-10）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：145.9（C-2），182.0（C-3），116.0（C-4），111.8（C-5），155.0（C-6），130.2（C-7），154.4（C-8），114.5（C-9），112.7（C-10），123.6（C-1′），118.4（C-2′），145.5（C-3′），148.0（C-4′），115.2（C-5′），124.6（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道6，7，3′，4′-四羥基橙酮的數(shù)據(jù)基本一致。endprint

化合物10 紅色粉末；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.46（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），7.34（1H，dd，J=8.3，1.9 Hz，H-6′），7.18（1H，d，J=8.5 Hz，H-4），7.07（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），6.87（1H，d，J=8.3 Hz，H-5′），6.71（1H，s，H-10），4.94（1H，d，J=7.6 Hz，H-1″），3.72（1H，dd，J=10.7，4.3 Hz，H-6″a），3.49（1H，dt，J=11.8，5.9 Hz，H-6″b），3.40（1H，m，H-2″），3.40（1H，m，H-3″），3.32（1H，m，H-5″），3.21（1H，m，H-4″）。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道海生菊苷的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物11 黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 201.015 4[M+Na]+（C9H6NaO4，計算值201.015 8）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.84（1H，d，J=9.4 Hz，H-4），6.95（1H，s，H-5），6.68（1H，s，H-8），6.12（1H，d，J=9.4 Hz，H-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道6，7-二羥基香豆素的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物12 白色粉末；1H-NMR（CD₃COCD₃，400 MHz）δ：7.63（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.16（1H，d，J=1.9 Hz，H-2），7.04（1H，dd，J=8.2，1.9 Hz，H-6），6.87（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），6.32（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），5.34（1H，dd，J=4.2，0.8 Hz，H-3′），4.65（1H，dd，J=11.1，4.2 Hz，H-4a），4.32（1H，dd，J=11.1，0.8 Hz，H-4b），1.52（3H，s，5′-CH3）； 13C-NMR（CD₃COCD₃，100 MHz）δ：127.4（C-1），116.4（C-2），146.3（C-3），149.0（C-4），115.2（C-5），122.8（C-6），146.9（C-7），114.8（C-8），177.5（C-1′），73.1（C-2′），75.4（C-3′），70.2（C-4′），22.4（C-5′），166.5（CO）。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道3-咖啡酸?；?2-甲基-D-赤蘚糖酸-1，4內(nèi)酯的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物 13 黃色粉末；[α]20D -16（c 0.05，MeOH）； HR-ESI-TOF-MS m/z 541.167 7[M+Na]+（C₂₆H₃₀NaO₁₁，計算值541.168 0）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：9.60（1H，d，J=7.8 Hz， H-9′），7.65（1H，d，J=15.7 Hz，H-7′），7.32（1H，s，H-2′），7.31（1H，s，H-6′），7.11（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），6.98（1H，d，J=1.8 Hz，H-2），6.86（1H，dd，J=8.5，1.8 Hz，H-6），6.72（1H，dd，J=15.7，7.8 Hz，H-8′），5.62（1H，d，J=6.0 Hz，H-7），4.89（1H，d，J=7.4 Hz，H-1″），3.85（3H，s，3′-OMe），3.85～3.76（2H，m，H-9），3.75（3H，s，3-OCH3），3.68（1H，m，H-6″a），3.52（1H，d，J=6.0 Hz，H-8），3.43（1H，m，H-6″b），3.30～3.17（4H，m，H-2″～5″）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：134.7（C-1），110.5（C-2），149.0（C-3），146.4（C-4），115.4（C-5），118.20（C-6），87.8（C-7），52.7（C-8），62.7（C-9），127.9（C-1′），112.7（C-2′），144.2（C-3′），150.7（C-4′），130.0（C-5′），119.0（C-6′），154.0（C-7′），126.2（C-8′），194.1（C-9′），100.0（C-1″），73.2（C-2″），76.9（C-3″），69.7（C-4″），77.0（C-5″），60.7（C-6″），55.8（5-OCH3），55.9（5′-OCH3）。并利用1H-1H COSY，HSQC和HMBC進行碳氫信號歸屬。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道（7S，8R）苯并二氫呋喃新木脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷的數(shù)據(jù)基本一致。

化合物14 黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 481.168 0[M+Na]+（C₂₁H₂₀NaO₁₁，計算值471.089 8）；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.00（1H，d，J=8.3 Hz，H-6），6.79（1H，d，J=1.6 Hz，H-3），6.69（1H，dd，J=8.3，1.6 Hz，H-5），5.94（1H，ddt，J=16.3，9.5，6.5 Hz，H-8），5.09（1H，d，J=1.6 Hz，H-9a），5.04（1H，d，J=1.6 Hz，H-9b），4.81（1H，d，J=3.0 Hz，H-1″），4.79（1H，d，J=7.4 Hz，H-1′），3.87（1H，d，J=9.4 Hz，H-4″a），3.85（1H，d，J=11.2，H-6′a），3.74（3H，s，2-OCH3），3.73（1H，m，H-2″），3.58（1H，d，J=9.4 Hz，H-4″b），3.45（1H，m，H-5′），3.41（1H，d，J=11.2 Hz，H-6′b），3.34（1H，m，H-5″），3.31（2H，m，H-7），3.25（1H，m，H-3′），3.24（1H，m，H-2′），3.08（1H，s，H-4′）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：145.0（C-1），149.0（C-2），115.7（C-3），133.5（C-4），120.5（C-5），113.0（C-6），39.2（C-7），137.9（C-8），115.5（C-9），100.5（C-1′），73.2（C-2′），76.8（C-3′），70.0（C-4′），75.5（C-5′），67.7（C-6′），109.3（C-1″），75.9（C-2″），78.7（C-3″），73.3（C-4″），63.1（C-5″），55.7（2-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道丁香酚-O-β-D-呋喃芹糖（1″-6′）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的數(shù)據(jù)基本一致。endprint

化合物15 白色粉末；[α]20D -38.5（c 0.1，MeOH）； HR-ESI-TOF-MS m/z 603.204 8[M+Na]+（C₂₈H₃₆NaO₁₃，計算值603.204 8）； 1H-NMR（CD₃OD，400 MHz）δ：6.72（ 2H，s，H-2，6 ），6.66（2H，s，H-2′，6′ ），4.85（1H，d，J=7.2 Hz，H-1″），4.77（1H，d，J=4.0 Hz，H-7），4.71（1H，d，J=4.0 Hz，H-7′），4.27（2H，m，H-9a，9′a），4.10（1H，d，J=7.1 Hz，H-1″），3.91（2H，d，J=9.4 Hz，H-9b，9′b），3.86（6H，s，3，3′-OCH₃），3.85（6H，s，5，5′-OCH₃），3.13（2H，m，H-8，8′）； 13C-NMR（CD₃OD，100 MHz）δ：136.9（C-1），106.8（C-2，6），155.9（C-3，5），140.9（C-4），89.1（C-7），57.2（C-8），74.4（C-9，9′），135.0（C-1′），106.3（C-2′，6′），150.9（C-3′，5′），137.2（C-4′），88.7（C-7′），57.0（C-8′），106.0（C-1″），77.2（C-2″），79.3（C-3″），72.8（C-4″），79.9（C-5″），64.1（C-6″），58.6（-OCH3），58.3（-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道（+）-丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的數(shù)據(jù)基本一致。

4 藥理活性篩選

4.1 化合物對HSC-T6增殖的影響 利用MTT法測試分離得到的10個黃酮類化合物抑制HSC-T6細胞增殖的能力，比較各黃酮化合物的IC50，其中表沒食子兒茶素兒茶酸脂（EGCG）為陽性藥。結(jié)果顯示化合物1～4，6，7有一定的抑制HSC-T6細胞增殖的能力（表1）。其中槲皮素（1）和7，8，3′，4′-四羥基二氫黃酮（6）的抑制活性與陽性藥EGCG（43.52 μmol·L^-1）相當。

4.2 黃酮類化合物對腹腔巨噬細胞分泌細胞因子含量的影響 對黃酮類化合物進行了抗炎免疫活性篩選。采用Elisa法測定LPS刺激的RAW264.7細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1的含量。結(jié)果顯示，10個化合物體外給藥均不同程度的降低細胞TNF-α和IL-1的產(chǎn)生，并隨濃度增高抑制率增強。其中化合物1，2，6，7抑制IL-1產(chǎn)生的效果最為明顯（表2）。

5 討論

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，鬼針草總黃酮提取物對各種原因誘導的肝纖維化均有治療作用。但目前鬼針草總黃酮中的化學組成仍不清楚，起到治療肝纖維化作用的成分尚不明確。本文從傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物分離方法入手，分離得到15個化合物，其中有10個為黃酮類化合物，含量較高。在這15個化合物中8，13～15為首次在該屬植物中分離得到的化合物。

肝星狀細胞（HSC）的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，肝臟損傷時，HSC 受到各種致病因子的刺激，從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞并產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)（ECM）在肝臟沉積，最終導致肝纖維化的發(fā)生^[18]。巨噬細胞在肝纖維化的過程中也很重要，其合成和釋放的細胞因子如TNF-α和白介素1，6，8等促肝纖維化細胞因子，參與調(diào)節(jié)肝星狀細胞的激活、增殖和膠原合成。本文在分離得到的化合物基礎上，著重研究含量較高的黃酮類化合物在體外對HSC-T6細胞增殖以及對巨噬細胞RAW264.7釋放的炎癥因子的作用。

結(jié)果顯示，3′，4′鄰二羥基取代的黃酮和二氫黃酮類化合物1，2，6，7有較強的抑制HSC-T6增殖的活性，因此推測3′，4′鄰二羥基為抑制肝星狀細胞增殖的重要基團；化合物2和7的活性又相對弱于1和6，因此推測，黃酮類化合物3，7位的羥基可能為抑制肝星狀細胞增殖的重要基團。同樣，化合物1和6有較強的抑制RAW264.7細胞分泌腫瘤壞死因子TNF-α和IL-1的能力，推測其活性可能也與3′，4′鄰二羥基有關。

本實驗從鬼針草總黃酮第Ⅲ部分中分離得到15個化合物，經(jīng)過體外篩選得到2個活性較強的抗肝纖維化化合物。然而鬼針草總黃酮其余部分組分仍然未知，因此，還需要進一步的分離以及篩選抗肝纖維化的化合物，得到更多活性更強的化合物。

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