劉子明，李國(guó)華

（吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林四平136001）

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HPLC法測(cè)定黑豆皮中原兒茶酸、表兒茶素的含量

劉子明，李國(guó)華*

（吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林四平136001）

摘要：建立HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定黑豆皮中原兒茶酸、表兒茶素含量的方法。固定相為shim-pack VP-ODS C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260、280 nm，柱溫35℃。原兒茶酸、表兒茶素分別在0.010 52 mg/mL～1.052 mg/mL（r=0.999 6）和0.012 24 mg/mL～1.224 mg/mL（r=0.998 9）濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為99.46%（RSD=1.08%，n=6）和99.06%（RSD=1.02%，n=6）。

關(guān)鍵詞：黑豆皮；原兒茶酸；表兒茶素；高效液相色譜法；波長(zhǎng)切換法；含量測(cè)定

黑豆種皮來(lái)源于豆科植物黑豆Glycine max（L.）Merr.的干燥成熟種皮，又稱料豆衣、烏衣等。中國(guó)自古就有“大豆數(shù)種，唯黑入藥”的記載。黑豆皮具有解毒利尿，明目益精，養(yǎng)血疏風(fēng)之功效?？芍委熽幪摕幔I汗，眩暈，頭痛，風(fēng)痹等癥［1］?，F(xiàn)代研究表明，黑豆皮提取物還具有明顯的抗氧化、抗炎、抑制誘變、抗心血管疾病等作用［2-5］。近年，對(duì)黑豆皮化學(xué)成分的研究雖有一些文獻(xiàn)報(bào)道［6］，但對(duì)其含量測(cè)定方面的研究報(bào)道較少。本研究主要是以其成分原兒茶酸和表兒茶素為研究對(duì)象，采用HPLC波長(zhǎng)切換法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1　儀器與試劑

1.1儀器

SHIMADZU 2010AHT高效液相色譜儀：日本島津。

1.2試劑

原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)：110809-200604）、表兒茶素對(duì)照品（批號(hào)：110878-200102）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；黑豆皮：市購(gòu)；甲醇為色譜純、磷酸為分析純、乙腈為色譜純：天津福晨化學(xué)試劑廠；娃哈哈純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

2　方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取干燥至恒重的原兒茶酸、表兒茶素對(duì)照品適量，75%甲醇溶解并定容，分別配成各含0.1 g/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液。再分別精密量取適量各對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別置于10 mL容量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液，備用。

2.2供試品溶液的制備［7-8］

稱取黑豆皮適量，粉碎，稱取其細(xì)粉（過(guò)5號(hào)篩）5g，精密稱定，置250 mL具塞三角瓶中，精密加入75%甲醇100 mL，超聲（250 W，50 kHz）處理35 min，放冷，用75%甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，過(guò)濾，收集濾液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)［9］

色譜柱：shim-pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，批號(hào)：3082427）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液；進(jìn)樣量：10 μL；流速1.0 mL/min；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器。各主成分與相鄰峰之間的分離度大于1.5，分離度良好，色譜條件見表1。

步驟2：按照式(12)～(14)處理流程，對(duì)不連續(xù)的虛擬陣列流型進(jìn)行內(nèi)插重構(gòu)，得到連續(xù)虛擬陣列流型響應(yīng)；

表1　色譜條件Table 1　Chromatographic condition

分別取對(duì)照品、供試品注入高效液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。

2.4線性關(guān)系考察

精密稱取原兒茶酸10.52 mg、表兒茶素12.24 mg、分別置于10 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取0.1、0.5、1、2、5、10 mL置10 mL容量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度。注入液相色譜儀分析，以峰面積對(duì)濃度做線性回歸方程，得各成分回歸方程，結(jié)果見表2。

圖1　 高效液相色譜圖Fig.1　The figure of high performance liquid chromatography

表2　回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍表（n=6）Table 2　The table of regression equation、related coefficient and linearity range（n=6）

2.5精密度試驗(yàn)

精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得原兒茶酸、表兒茶素峰面積積分值的RSD分別為1.12%、0.89%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品按照2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備6份，各取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果原兒茶酸、表兒茶素含量的RSD分別為1.09%、0.91%，表明重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備的同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定原兒茶酸、表兒茶素峰面積積分值的RSD為0.87%、1.03%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

精密取已知含量的同一批樣品適量，共6份，分別精密加入原兒茶酸、表兒茶素對(duì)照品適量，按照2.2項(xiàng)下制備，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3，表3結(jié)果表明，本法準(zhǔn)確可靠。

2.9樣品測(cè)定

取黑豆皮樣品3份，每份做3個(gè)平行，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表3　加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 3　The result of recovery rate test（n=6）

表4　樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 4　The result of sample test（n=3）

3　結(jié)論

本研究以75%甲醇作為提取溶劑對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理，以shim-packVP-ODSC18（250mm×4.6mm，5μm）為色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為260、280nm，流速為1.0mL/min進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定。并以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果，原兒茶酸、表兒茶素分別在0.010 52 mg/mL～ 1.052mg/mL（r=0.9996）和0.01224 mg/mL～1.224 mg/mL （r=0.998 9）濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為99.46%（RSD=1.08%，n=6）和99.06%（RSD=1.02%，n=6）。結(jié)果表明，采用HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定黑豆皮中原兒茶酸、表兒茶素的含量，該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，可作為黑豆皮中原兒茶酸、表兒茶素的含量測(cè)定方法。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.035

作者簡(jiǎn)介：劉子明（1979—），男（漢），講師，主要從事食品藥品分析及質(zhì)量控制研究。

*通信作者：李國(guó)華，副教授，主要從事生物技術(shù)的研究。

收稿日期：2015-06-03

Determination of Protocatechuic Acid and Epicatechin in Black Soybean Coat by HPLC

LIU Zi-ming，LI Guo-hua*

（Jilin Engineering Vocational College，Siping 136001，Jilin，China）

Abstract：To establish an HPLC method of switching-wavelength simultaneous determination of the content for protocatechuic acid and epicatechin in Black soybean coat.The solid phase was shim-pack VP-DOS C18（250 mm 4.6 mm，5 μm）.The mobile phase was composed of acetonitrile-0.1%Phosphoric acid，The flow rate was1.0 mL/min.The detection wavelength was260 nm and 280 nm，and the temperature of column was 35℃. Good linear relationships were found within the range of 0.010 52 mg/mL-1.052 mg/mL（r=0.999 6）for protocatechuic acid and 0.012 24 mg/mL-1.224 mg/mL（r=0.998 9）for epicatechin.The average recovery was 99.46%（RSD=1.08%，n=6）and 99.06%（RSD=1.02%，n=6）.

Key words：black soybean coat；protocatechuic acid；epicatechin；HPLC；switching-wavelength；content determination