汪　怡

(江蘇省昆山市中醫(yī)醫(yī)院臨床藥理科，江蘇　昆山　215300)

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制劑與質(zhì)量控制

高效液相色譜法測定生化湯協(xié)定方代煎液中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量

汪怡

(江蘇省昆山市中醫(yī)醫(yī)院臨床藥理科，江蘇昆山215300)

【摘要】目的建立高效液相色譜法(HPLC法)測定生化湯協(xié)定方代煎液中游離阿魏酸和總阿魏酸含量的方法。方法應用HPLC法測定游離阿魏酸和總阿魏酸的含量，以Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱，甲醇-1%醋酸溶液(30∶70)為流動相，檢測波長為321 nm。結(jié)果游離阿魏酸在進樣量0.212～1.060 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關系，回歸方程為Y=4.685 5×106X-2.109 0×104(r=0.999 9)，游離阿魏酸平均加樣回收率100.60%，相對標準偏差(RSD)=2.33%，總阿魏酸平均加樣回收率99.43%，RSD=2.65%。結(jié)論本方法操作簡單，方法可靠，結(jié)果準確，靈敏度高，重現(xiàn)性好。

【關鍵詞】色譜法，高壓液相；生化湯；阿魏酸

生化湯出自《傅青主女科》，是治療婦產(chǎn)科疾病特別是產(chǎn)后疾病的名方。全方由當歸、川芎、桃仁、炮姜、炙甘草組成。我院根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，在此基礎上添加益母草組成生化湯協(xié)定方應用于臨床，效果顯著。為方便住院患者服用，多以煎藥機代煎形式服務于臨床。本試驗采用高效液相色譜法(HPLC法)測定生化湯協(xié)定方代煎液(以下簡稱代煎液)中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量，為進一步研究質(zhì)量控制方法提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器LC-2000高效液相色譜儀(上海天美科學儀器有效公司)，LC-2030 紫外可見分光光度計(上海天美科學儀器有效公司)；FA2004N電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；YFY-20型中藥煎藥機(北京東華原醫(yī)療設備有限責任公司)；YBS-150型中藥湯劑包裝機(北京東華原醫(yī)療設備有限責任公司)。

1.1.2藥品及試劑阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110773-200611)；川芎、當歸、桃仁、炮姜、甘草、益母草藥材來自我院藥房；甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)，三氯甲烷(分析純，上海申翔化學試劑有限公司)，氫氧化鈉(分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1色譜條件色譜柱：Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-1%醋酸溶液(30∶70)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：321 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在選定的條件下，代煎液樣品中阿魏酸色譜峰與代煎液樣品中其他組分色譜峰基線分離，按阿魏酸峰計算，理論板數(shù)(N)為4 000以上。同時取陰性對照品溶液進樣，結(jié)果表明陰性對照品溶液在阿魏酸色譜峰位置處無相應峰出現(xiàn)。陰性對照品溶液、對照品溶液、代煎液樣品溶液HPLC圖見圖1～3。

圖1　陰性對照品溶液HPLC圖

圖2 　對照品溶液HPLC圖

圖3　代煎液樣品溶液HPLC圖

1.2.2溶液制備

1.2.2.1對照品溶液制備取阿魏酸對照品約5 mg，精密稱定，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得(每1 mL含阿魏酸對照品0.212 mg)。

1.2.2.2供試品溶液制備①代煎液制備：按處方量稱取藥材，加適量水，浸泡30 min，于中藥煎藥機中煎煮40 min，濾出藥汁，用中藥湯劑包裝機打包，每劑2袋，每袋150 mL，備用。②游離阿魏酸供試品溶液制備：量取代煎液100 mL，用三氯甲烷200 mL振搖提取4次，每次50 mL，合并三氯甲烷液200 mL，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻靜置。用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。③總阿魏酸供試品溶液制備：量取代煎液100 mL，加入氫氧化鈉1 g，超聲提取1 h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，再用三氯甲烷200 mL振搖提取4次，每次50 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻靜置。用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2.3陰性對照品溶液制備按處方量制成缺川芎、益母草的陰性模擬制劑，按1.2.2.2項下方法制成陰性對照品溶液。

1.3線性關系考察精密吸取上述對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，精密吸取10 μL，分別注入高效液相色譜儀測定，記錄峰面積，以進樣量對峰面積值進行回歸分析，以進樣量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4精密度試驗精密吸取同一對照品溶液，重復進樣5次，測定阿魏酸峰面積，計算相對標準偏差(RSD)。

1.5穩(wěn)定性試驗取同一代煎液溶液，按1.2.2.2項下方法分別制備游離阿魏酸和總阿魏酸供試品溶液，并分別于0、2、4、6、8 h進樣，測定樣品中阿魏酸峰面積，計算RSD。

1.6重復性試驗取相同批號藥材煎煮5份代煎液溶液，按1.2.2.2項下方法分別制備游離阿魏酸和總阿魏酸供試品溶液各5份，測定樣品中阿魏酸峰面積，計算RSD。

1.7回收率試驗

1.7.1游離阿魏酸回收率試驗取已知含量代煎液50 mL，各5份，根據(jù)加樣回收率試驗1∶1加入方法，精密加入已配置好的阿魏酸對照品溶液各1 mL，加蒸餾水定容至100 mL，按1.2.2.2項下游離阿魏酸供試品溶液制備方法制備供試品溶液，計算游離阿魏酸的回收率。

1.7.2總阿魏酸回收率試驗取已知含量代煎液50 mL，各5份，根據(jù)加樣回收率實驗1∶1加入方法，精密加入已配置好的阿魏酸對照品溶液各1 mL，加蒸餾水定容至100 mL，按1.2.2.2項下總阿魏酸供試品溶液制備方法制備供試品溶液，計算總阿魏酸的回收率。

1.8樣品含量測定取3批代煎液，按1.2.2.2項下方法分別制備游離阿魏酸和總阿魏酸供試品溶液，分別進樣，測定峰面積，計算樣品中游離阿魏酸和總阿魏酸含量。

2結(jié)果

2.1線性關系考察回歸方程為Y=4.685 5×106X-2.109 0×104，r=0.999 9。說明阿魏酸在進樣量0.212～1.060 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.2精密度試驗RSD=1.00%，說明精密度良好。

2.3穩(wěn)定性試驗 RSD分別為2.70%和2.41%。說明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4重復性試驗游離阿魏酸平均含量2.45 μg/mL，RSD=1.15%；總阿魏酸平均含量4.23 μg/mL，RSD=2.06%。說明方法的重復性較好。

2.5回收率試驗

2.5.1游離阿魏酸回收率試驗平均回收率=100.60%，RSD=2.33%。說明該方法具有良好的回收率。見表1。

表1　游離阿魏酸回收率試驗

2.5.2總阿魏酸回收率試驗平均回收率=99.43%，RSD=2.65%。說明該方法具有良好的回收率。見表2。

表2　總阿魏酸回收率試驗

2.6樣品含量測定見表3。

表3　樣品含量測定

3討論

川芎是生化湯中主要藥物，其有效成分為阿魏酸，同時還存在阿魏酸松柏酯，其中阿魏酸松柏酯在中性、強酸或堿性條件下，可以水解生成阿魏酸，即使水浴加熱都可能不同程度的發(fā)生，Lu GH等[2]提出了游離阿魏酸和總阿魏酸的概念，認為游離阿魏酸是指在植物體中本來就含有的那部分阿魏酸，總阿魏酸是游離阿魏酸和其他途徑分解生成的阿魏酸之和，并認為在用化學分析方法評價中藥質(zhì)量時，應優(yōu)先采用總阿魏酸的含量作為評價指標，故本試驗對代煎液中游離阿魏酸和總阿魏酸[3-5]的含量進行測定，從而為代煎質(zhì)控研究提供科學依據(jù)。在陰性對照品溶液的制備中，由于單純?nèi)コㄜ旱年幮匀芤涸诎⑽核岱逄幋嬖诟蓴_，后查閱文獻，發(fā)現(xiàn)益母草藥材中也存在少量阿魏酸[6]，故去除川芎和益母草來制備陰性對照品溶液。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版：一部[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010：38.

[2]Lu GH，Chan K，Leung K，et al.Assay of free ferulic acid and total ferulic acid for quality assessment of Angelica sinensis [J]．J Chromatogr A，2005，1068(2)：209-219.

[3]夏荃，文惠玲，李土光，等.高效液相色譜法測定川芎不同炮制品中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量[J].廣州中醫(yī)藥大學學報，2009，26(4):384-387.

[4]呂光華，程世瓊，陳金泉，等.HPLC測定川芎藥材和飲片中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量及其質(zhì)量評價指標[J].中國中藥雜志，2010，35(2)：194-198.

[5]徐自升，蔡寶昌，張弦，等.中藥川芎中阿魏酸穩(wěn)定性的研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2004，18(2)：25-27.

[6]羅毅，羅云，周本宏，等.益母草中阿魏酸的分離和色譜鑒定[J].廣東藥學院學報，2004，20(5):462-463.

(本文編輯：習沙)

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.02.033

作者簡介：汪怡(1981—)，女，主管中藥師，碩士。從事中藥制劑工作。

【中圖分類號】R284.1；R286.0

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2016)02-0265-04

(收稿日期：2014-06-03)

Determination of free and total ferulic acid in decoction of Shenghua prescription by HPLC

WANGYi.

DepartmentofClinicalPharmacology,KunshanCityHospitalofTraditionalChineseMedicineinJiangsuProvince,Kunshan,Jiangsu215300

【Abstract】ObjectiveTo establish a method for determination of free and total ferulic acid in decoction of Shenghua prescription by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods On Diamonsil C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm); with methyl alcohol (containing 1 % acetic acid) = 30∶ 70 as mobile phase and UV determination at 321 nm. Results A good linearity was obtained over the range of 0.212～1.060 μg for free ferulic acid, regression equation was Y=4.685 5×106X-2.109 0×104(r=0.999 9). The average recoveries of free and total ferulic acid components were 100.60% with relative standard deviation (RSD) = 2.33% and 99.43% with RSD = 2.65%, respectively. Conclusion This method is simple, reliable, accuracy, with high sensitivity and better repeatability.

【Key words】Chromatography; High pressure liquid; Shenghua decoction; Ferulic acid