霍仕霞，高　莉*，彭曉明，閆　明，劉新民

(1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學實驗室，烏魯木齊　830049；2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，北京　100193)

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阿那其根的指紋圖譜研究

霍仕霞1，高莉1*，彭曉明1，閆明1，劉新民2

(1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學實驗室，烏魯木齊830049；2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，北京100193)

摘要：目的建立阿那其根藥材的高效液相色譜指紋圖譜，對共有色譜峰進行指認，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法采用HPLC-DAD檢測法。VP-ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液；柱溫為30 ℃；極性小的成分檢測波長為330 nm，流速為1.0 mL·min-1；極性大的成分檢測波長為254 nm，流速為0.5 mL·min-1。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件對結果進行評價。結果測定了4批不同來源的阿那其根，其中1批樣品的相似度小于0.6，其余藥材指紋圖譜相似度均大于0.9。結論該方法可靠、簡便，適用于阿那其根藥材的質(zhì)量評價。

關鍵詞：阿那其根；高效液相色譜法；指紋圖譜；共有峰

阿那其根為菊科植物羅馬除蟲菊Anacycluspyrethrum(L).DC的干燥根，春秋季采挖，洗凈，切斷，曬干。維藥名：阿克爾開爾哈，別名為阿吉而哈而哈、歐都里開日合、比合臺爾混庫依。原植物羅馬除蟲菊，多年生草本，高15～45 cm，多具長柔毛。分布于北非或歐洲南部，我國新疆亦有分布。阿那其根具有清除異常黏液質(zhì)、開滯止痛的功效，其性味為三級末四級首干熱。在維吾爾醫(yī)中，阿那其根常被用來清除異常黏液質(zhì)、開滯止痛；用于異常黏液質(zhì)所致的癱瘓、面癱、震顫、麻痹和舌重久咳等[1-2]，但是其活性成分及其作用機制還不清楚。阿那其根中含有黃酮、墻草堿、菊糖、揮發(fā)油、鞣質(zhì)及氨基酸[3]。由于其基源主要在國外，新疆所用阿那其根主要從周邊的巴基斯坦、印度等國進口，造成了其基源混亂、真?zhèn)尾磺濉①|(zhì)量不均，嚴重阻礙了其相關產(chǎn)品的質(zhì)量以及其進一步的深入開發(fā)。

目前，市場的阿那其根品種層出不窮，名稱相同，但基源不同，價格相差很大。為了進一步探究中草藥的質(zhì)量，本研究采用RT-HPLC法分別建立阿那其根極性小部分和極性大部分指紋圖譜，并比較了4種市售的阿那其根的指紋圖譜，并根據(jù)指紋圖譜色譜峰數(shù)目及大小，評價其質(zhì)量，從而為規(guī)范阿那其根的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器 LC2010高效液相色譜儀(美國waters公司)；VP-ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(日本島津公司)；BS224S分析天平(德國Sartorius)；SK8210HP超聲清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)；FJY2002-UV基因研究型超純水機(青島富勒姆科技有限公司)；高速多功能搖擺粉碎機(上海菲力博實業(yè)公司)。

1.2試藥阿那其根分別購買于巴基斯坦藥材市場、新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院、和田維吾爾醫(yī)醫(yī)院和新疆阿勒泰醫(yī)院，其中在巴基斯坦藥材市場購買的阿那其根經(jīng)巴基斯坦卡拉奇大學分子醫(yī)學和藥物研究中心默哈默得·伊哥巴爾教授鑒定為正品。甲醇(Merck公司，KGaA 1674607308)；乙腈為色譜純；水為去離子水；其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1供試品溶液的制備阿那其根藥材粉碎后過60目篩，稱取5.00 g，加入適量體積分數(shù)為70%的乙醇，超聲提取3次(3次加水量依次為藥材的8，6和6倍)，每次30 min，過濾，合并濾液，定容至100 mL量瓶中，0.45 μm濾膜過濾，即為供試品溶液。

2.2檢測波長的確定將阿那其根指紋圖譜分為2部分進行優(yōu)化，即極性大的部分(A段)和極性小的部分(B段)。通過對比不同波長下色譜峰的數(shù)目和大小，A段指紋圖譜選擇波長為330 nm，B段指紋圖譜選擇波長為254 nm，見圖1。

圖1不同波長下阿那其根指紋圖譜

A.254 nm；B.330 nm

Fig.1 HPLC fingerprints of RadixAnacyclipyrethriat different wavelength

A.254 nm；B.330 nm

2.3梯度洗脫程序的建立及優(yōu)化

2.3.1A段(極性大的成分)指紋圖譜條件的優(yōu)化本研究最初采用系統(tǒng)洗脫方式作為初始程序，見圖1A，即0～40 min，乙腈的體積分數(shù)由1%線性增至100%，流速為1.0 mL·min-1；分析系統(tǒng)梯度洗脫后的色譜圖，主要成分的峰集中在10～25 min之間，有15個明顯特征峰，出現(xiàn)色譜峰堆積，故調(diào)整流動相乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液的初始比例，在此基礎上進行色譜條件優(yōu)化[4-6]。最終優(yōu)選條件：檢測波長：330 nm，進樣量：5 μL，柱溫：30 ℃，流速：1.00 mL·min-1，流動相比例及梯度洗脫條件見表1，色譜圖見圖2。

表1阿那其根指紋圖譜梯度洗脫程序

Tab.1 The gradient elution program for RadixAnacyclipyrethri

時間/min乙腈/%1mL·L-1磷酸/%01090252179352377552377

圖2阿那其根A段(極性大的成分)系統(tǒng)梯度洗脫圖譜

Fig.2 HPLC fingerprints of RadixAnacyclipyrethriA(the high polarity composition)

2.3.2B段(極性小的成分)指紋圖譜條件的優(yōu)化對于極性較小的成分采取乙腈的體積分數(shù)較大[7]，在已有梯度洗脫的基礎上，優(yōu)化色譜條件，最終優(yōu)選條件為：乙腈：1 mL·L-1磷酸=85∶15等度洗脫，流速：0.5 mL·min-1，柱溫：30 ℃，時間：25 min。色譜圖見圖3。

圖3阿那其根B段(極性小的成分)系統(tǒng)梯度洗脫圖譜

Fig.3 HPLC fingerprints of RadixAnacyclipyrethriB(the low polarity composition)

2.4不同來源阿那其根指紋圖譜的相似度評價見表2～3。指紋圖譜的相似度評價指標是將供試品的色譜圖和該品種的對照指紋圖譜(共有模式圖譜)之間的相似度進行比較和計算，將相似度值高的樣品定為質(zhì)量較高的藥材。在2002年國家藥典委員會發(fā)布的《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術指南》(試行)中要求對照用指紋圖譜(共有模式)及供試品指紋圖譜之間的相似度必須在0.900以上[8-10]。本研究比較了各來源的阿那其根指紋圖譜色譜峰數(shù)目和大小，選擇圖譜中歸一化峰面積大于2%的色譜峰作為指紋峰，對于極性較大的成分最終選擇了23個指紋峰(占總峰面積的95%以上)，對于極性小的成分，選擇了8個指紋峰(占總峰面積的95%以上)，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A版)[11-12]分別對極性大和極性小的成分的指紋圖譜進行匹配，見圖4～5。

圖4不同來源的阿那其根極性大的成分指紋圖譜

(S1.巴基斯坦藥材市場樣品；S2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院樣品；S3.和田維吾爾醫(yī)醫(yī)院樣品；S4.新疆阿勒泰醫(yī)院樣品)

Fig.4 HPLC fingerprints of different RadixAnacyclipyrethriA(the high polarity composition)

(S1.Samples of medicine market of Pakistan；S2.Samples of Xinjiang Uygur medicine hospital；S3.Samples of Uygur medicine hospital of Hetian；S4.Samples of Altay hospital)

表2不同來源阿那其根極性大的成分指紋圖譜相似度評價結果

Tab.2 The similarity evaluation results of different RadixAnacyclipyrethriA(the high polarity composition)

相似度S1S2S3S4S11S20.9981S30.9950.9951S40.2210.2210.2531

注：S1.巴基斯坦藥材市場樣品；S2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院樣品；S3.和田維吾爾醫(yī)醫(yī)院樣品；S4.新疆阿勒泰醫(yī)院樣品。

圖5不同來源的阿那其根極性小的成分指紋圖譜

S1.巴基斯坦藥材市場樣品；S2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院樣品；S3.和田維吾爾醫(yī)醫(yī)院樣品；S4.新疆阿勒泰醫(yī)院樣品

Fig.5 HPLC fingerprints of different RadixAnacyclipyrethriB(the low polarity composition)

S1.Samples of medicine market of Pakistan；S2.Samples of Xinjiang Uygur medicine hospital；S3.Samples of Uygur medicine hospital of Hetian；S4.Samples of Altay hospital

表3不同來源阿那其根極性小的成分指紋圖譜相似度評價結果

Tab.3 The similarity evaluation results of different RadixAnacyclipyrethriB(the low polarity composition)

相似度S1S2S3S4S11S20.9961S30.9940.9941S40.530.530.4371

注：S1.巴基斯坦藥材市場樣品；S2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院樣品；S3.和田維吾爾醫(yī)醫(yī)院樣品；S4.新疆阿勒泰醫(yī)院樣品。

由相似度評價結果可以得出，從巴基斯坦藥材市場、新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院與和田維吾爾醫(yī)醫(yī)院購買的阿那其根藥材指紋圖譜相似度較高，均大于0.9；而新疆阿勒泰醫(yī)院的阿那其根藥材指紋圖譜與其他三者相似度較低，小于0.6。

3討論

簡單的測定1個或幾個有效成分含量為主的傳統(tǒng)的質(zhì)量分析方法不能真正地反映中藥材的質(zhì)量，中藥指紋圖譜是控制天然藥物質(zhì)量的有效方式之一，建立全面、系統(tǒng)而又特征地反映中草藥的化學成分的指紋圖譜，能為中草藥的質(zhì)量評價和控制提供一個有效的參考方法[8]。

梯度洗脫分離條件的優(yōu)化是指紋圖譜建立的關鍵[13-14]。阿那其根中含有黃酮、墻草堿、菊糖、揮發(fā)油、鞣質(zhì)及氨基酸，具有一定的極性和酸性，易解離出質(zhì)子，在流動相中添加適當比例的磷酸可抑制解離以獲得穩(wěn)定的色譜峰。本研究比較了甲醇(A)-2 mL·L-1甲酸水溶液(B)、乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B)等流動相的分離效果，結果表明，同一條件下采用乙腈體系作為流動相，較甲醇的分離效果好，可以縮短保留時間，最終選擇乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液作為基本的流動相單元。

研究中阿那其根系統(tǒng)洗脫指紋圖譜主要集中在10～30 min和45～60 min兩段，且色譜峰較集中，很難在短時間內(nèi)分離達到滿意效果，因此考慮分成兩段(極性大的部分和極性小的部分)進行分離。作者在阿那其根的提取溶劑、流動相的選擇、梯度洗脫等方面進行了大量的優(yōu)化，所建立的方法在精密度、重復性和穩(wěn)定性方面符合指紋圖譜研究的技術要求，也為阿那其根的質(zhì)量控制提供部分的科學依據(jù)。通過指紋圖譜相似度評價后，我們比較了從巴基斯坦藥材市場、新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院、和田維吾爾醫(yī)醫(yī)院和新疆阿勒泰醫(yī)院購買的阿那其根，通過指紋圖譜及相似度評價，結果顯示，巴基斯坦藥材市場、新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院與和田維吾爾醫(yī)醫(yī)院購買的阿那其根藥材指紋圖譜相似度較高，均大于0.9，其中從巴基斯坦市場購買的藥材經(jīng)專家鑒定確定為正品，表明新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院與和田維吾爾醫(yī)醫(yī)院的阿那其根與巴基斯坦市場的阿那其根質(zhì)量相當；而新疆阿勒泰醫(yī)院的阿那其根藥材指紋圖譜與其他三者比較相似度較低，小于0.6，色譜峰數(shù)目明顯較少，質(zhì)量差異較大，品質(zhì)較次。當然，由于阿那其根藥材資源的多樣性、采集時間的差異性、存放時間引起的化學成分變化和溫度等復雜因素對指紋圖譜的影響，還不能做出明確結論，只能給出一個初步的質(zhì)量評價。

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基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)國際科技支疆項目(編號：201491174)

作者簡介：霍仕霞，女，碩士研究生，副研究員

*通信作者：高莉，女，博士，副研究員

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.004

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)04-0341-04

(收稿日期：2015-09-22)

Study on the HPLC fingerprint of the Radix Anacycli pyrethri

HUOShixia1，GAOLi1*，PENGXiaoming1，YANMing1，LIUXinmin2

(1.Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine；Xinjiang Laboratory of Uighur Medical Prescription，Urmuqi 830049，China；2.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing，100193，China)

Abstract:Objective To optimize the separation conditions of fingerprint for Radix Anacycli pyrethri by high performance liquid chromatography.Methods HPLC-DAD analysis was performed, and VP-ODS column(250 mm×4.6 mm，5 μm) was used with acetonitrile-1 mL·L-1phosphoric acid solution as the mobile phase.The low polarity components were detected at UV 330 nm in a flow rate of 1.0 mL·min-1，while the high polarity components were detected at UV 254 nm in a flow rate of 0.5 mL·min-1.The column temperature was maintained at 30 ℃.The result was evaluated by similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicines.Results Four batches of Radix Anacycli pyrethri were tested，the similarity of Radix Anacycli pyrethri from Altay Hospital was less than 0.6，but the others were over 0.9.Conclusion The method is reliable，simple and suitable for the quality evaluation of Radix Anacycli pyrethri.

Key words：Radix Anacycli pyrethri；HPLC；fingerprint；common chromatographic peaks