劉 靜

(海門市中醫(yī)院，海門　226100)

?

肺炎糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉 靜

(海門市中醫(yī)院，海門226100)

摘要：目的建立肺炎糖漿的薄層鑒別方法和含量測(cè)定方法。方法 采用薄層色譜法對(duì)處方中連翹、金銀花和玄參進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC法對(duì)君藥麻黃中的鹽酸麻黃堿進(jìn)行含量分析。結(jié)果 薄層色譜斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾；制定了麻黃中鹽酸麻黃堿含量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：肺炎糖漿；薄層色譜；高效液相色譜法

肺炎糖漿是海門市中醫(yī)院中藥制劑，由金銀花、連翹、天竺黃、玄參和麻黃等組成，具有辛涼宣泄、清肺平喘功效，臨床用于屬風(fēng)熱痰阻之證的小兒肺炎，表現(xiàn)為喘逆氣急、痰熱壅盛風(fēng)邪犯肺，臨床療效顯著。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有簡(jiǎn)單的理化鑒別項(xiàng)，為提高制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層色譜法[1]對(duì)制劑中的連翹、金銀花、玄參進(jìn)行鑒別；采用高效液相色譜法對(duì)麻黃中鹽酸麻黃堿進(jìn)行含量測(cè)定，該方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，結(jié)果滿意。

1儀器與試藥

1.1儀器CAMAG TLC VISUALIZER型薄層自動(dòng)成像儀(瑞士卡瑪公司)；BS110S萬分之一天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；Agilent1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫)； Agilent-G1311C型四元泵(美國(guó)安捷倫公司)； Agilent-G1315D型二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司)； Agilent-G1329B型真空脫氣器(美國(guó)安捷倫公司)；CHEMSTATION B.04.02版化學(xué)工作站(美國(guó)安捷倫公司)；KQ-250B型超聲清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司)；Mettler Toledo EL2401電子天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2試藥連翹苷(批號(hào)110821-200711)，金銀花對(duì)照藥材(批號(hào)121060-200805)，綠原酸對(duì)照品(批號(hào)110753-200413)，玄參對(duì)照藥材(批號(hào)121018-200503)，哈巴俄苷對(duì)照品(批號(hào)111730-200501)，鹽酸麻黃堿對(duì)照品(批號(hào)171241-201007)，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；肺炎糖漿(批號(hào)：140602，140609，140825)及陰性對(duì)照均由海門中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)；乙腈、甲醇為色譜純；水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別

2.1.1連翹的TLC鑒別 取本品20 mL，先用水飽和正丁醇溶液振搖并提取2次，每次為20 mL，合并正丁醇液，再用氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨試液，再用正丁醇飽和水洗滌2次，每次為20 mL，將正丁醇液蒸干，加入甲醇1 mL，使殘?jiān)芙?，作為供試品溶液。取連翹苷對(duì)照品適量，加甲醇制成1 mL含0.25 mg的對(duì)照品溶液[2]。取缺連翹藥材的陰性對(duì)照樣品，參照供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。參照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，分別吸取供試品2～4 μL、陰性對(duì)照品溶液2～4 μL及對(duì)照品溶液3 μL，依次點(diǎn)于硅膠G薄層板上，展開劑為三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸(12∶2.5∶2∶0.2)，展開，取出，晾干，噴100 mL·L-1的硫酸乙醇溶液再晾干，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰；置于日光下檢視。供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置可顯相同的斑點(diǎn)，陰性樣品色譜在相對(duì)應(yīng)位置沒有干擾，見圖1。

2.1.2金銀花的TLC鑒別取樣品5 mL，加稀鹽酸0.5 mL，混勻，用乙酸乙酯振搖并提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯溶液并蒸干，加1 mL甲醇使殘?jiān)芙?，作為供試品溶液[3-5]。取缺金銀花藥材的陰性對(duì)照樣品，參照供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。取綠原酸對(duì)照品適量，加入甲醇制成1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，吸取以上供試品溶液3～5 μL、陰性對(duì)照品溶液3～5 μL和對(duì)照品溶液各4 μL依次點(diǎn)于聚酰胺薄膜，展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(1∶15∶1∶1∶2)的上層；展開，取出，晾干，在紫外燈365 nm下進(jìn)行檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置可顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性樣品色譜在相對(duì)應(yīng)的位置上沒有干擾，見圖2。

圖1肺炎糖漿中連翹的薄層色譜圖

1～3.供試品；4.缺連翹的陰性對(duì)照；5.連翹苷

Fig.1 TLC ofFructusforsythiaein Pneumonia Syrup; 1-3.test samples; 4.reference substance WithoutFructusforsythiae;5.Fructusforsythiaeglycosides

圖2 肺炎糖漿中金銀花的薄層色譜圖

1～3. 供試品；4. 缺金銀花的陰性對(duì)照；5. 綠原酸

Fig.2 TLC ofLonicerajaponicain Pneumonia Syrup

1-3.test samples 4.reference substance withoutLonicerajaponica5.chlorogenic acid

2.1.3玄參的TLC鑒別 取本品20 mL，用水飽和正丁醇溶液振搖并提取2次，每次30 mL，合并正丁醇溶液;用氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨試液；再用正丁醇飽和水溶液洗滌2次，每次20 mL，保留正丁醇液蒸干；殘?jiān)? mL水溶解，通過D101型大孔吸附樹脂，先用60 mL水洗滌，棄去水液，再用400 mL·L-1乙醇50 mL洗脫，棄去洗脫液，然后用700 mL·L-1乙醇60 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液[6-8]。取缺玄參藥材的陰性對(duì)照樣品，參照供試品溶液的制法，制成陰性對(duì)照溶液。再取哈巴俄苷對(duì)照品，加甲醇后制成1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。根據(jù)薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)實(shí)驗(yàn)，分別吸取供試品、陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL，依次點(diǎn)于硅膠G薄層板上，展開劑為正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)的上層液，展開，取出，晾干，噴以50 mL·L-1的香草醛硫酸溶液，吹熱至顯色清晰；日光下檢視。不同批次的樣品均檢出哈巴俄苷，且與玄參對(duì)照藥材的主斑點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，而缺玄參的陰性對(duì)照在相同位置未檢出哈巴俄苷，說明陰性對(duì)照無干擾，見圖3。

圖3肺炎糖漿中玄參的薄層色譜圖

1～3.供試品；4.缺玄參的陰性對(duì)照品；5.哈巴俄苷對(duì)照品Fig.3 TLC ofRadixscrophulariaein Pneumonia Syrup

1-3.test samples；4.reference substance withoutRadixscrophulariae;5.khabarovRussiaglycosidereference substance

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱： Megres-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相：乙腈1 mL·L-1磷酸溶液(含1 mL·L-1三乙胺)(5∶95)；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；理論板數(shù)按照鹽酸麻黃堿峰的計(jì)算不低于5 000。

2.2.2對(duì)照品溶液制備 取鹽酸麻黃堿對(duì)照品，精密稱定，加0.1 mol·L-1的鹽酸溶液制成質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1的鹽酸麻黃堿溶液[9-10]。

2.2.3供試品溶液制備 將提取方式進(jìn)行優(yōu)化，參考《中國(guó)藥典》2010年版一部“小兒清肺化痰口服液”含量測(cè)定項(xiàng)下方法，建立肺炎糖漿含量測(cè)定方法：精密量取本品20 mL，加水10 mL及濃氨試液1 mL，用乙醚振搖提取5次，分別為30，30，30，20和20 mL，合并乙醚提取溶液，加鹽酸乙醇溶液(1→20)2 mL，混勻，低溫回收溶劑至干；殘?jiān)靡掖? mL溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。精密量取10 μL，注入液相色譜儀。

2.2.4陰性對(duì)照溶液制備 按照處方，取除麻黃外的其余藥材，按照制備工藝要求，制成不含麻黃的肺炎糖漿(由海門中醫(yī)院提供)，按照供試品溶液制備項(xiàng)下的方法，制成陰性對(duì)照溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。

結(jié)果顯示，在供試品溶液色譜峰中，與鹽酸麻黃堿對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間有明顯的吸收峰，陰性對(duì)照在與鹽酸麻黃堿對(duì)照品相同的保留時(shí)間處，無色譜峰干擾。見圖4。

圖4 肺炎糖漿的 HPLC圖

A.鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液；B. 肺炎糖漿供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液

Fig.4 HPLC chromatograms of Pneumonia SyrupA.reference substance solution of ephedrine hydrochloride；B.product solution of Pneumonia Syrup；C.negative control solution

2.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與線性范圍考察 精密吸取質(zhì)量濃度為20.90 μg·mL-1的鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液0.5，1，2，4，8和10 μL，注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定，縱坐標(biāo)為峰面積的積分值，而鹽酸麻黃堿的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程：Y=1 917.263 1X+3.553 6，r=0.999 7，結(jié)果顯示，線性關(guān)系良好。

2.2.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，顯示峰面積測(cè)定值的RSD為0.80%，說明儀器的精密度良好。2.2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取相同批號(hào)(140825)的肺炎糖漿6份，按照本文含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定供試品中鹽酸麻黃堿[11]的含量，計(jì)算平均含量和RSD。

2.2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，每隔一定的時(shí)間測(cè)定1次峰面積，直至16 h。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿在16 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品6份(批號(hào)140825，質(zhì)量濃度為13.15 μg·mL-1)，每份取10 mL，分別精密加入鹽酸麻黃堿對(duì)照品適量，按照正文供試品溶液制法制成加樣回收供試品溶液，按照實(shí)驗(yàn)含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果見表1。結(jié)果表明，本方法的加樣回收率實(shí)驗(yàn)良好。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test

實(shí)驗(yàn)號(hào)取樣量/mL樣品中量/mg加入量/mg測(cè)得總量/mg·mL-1回收率/%平均回收率/%RSD/%1100.13150.16720.2995100.47102.392.792100.13150.16720.3044103.423100.13150.16720.3077105.394100.13150.16720.3024102.245100.13150.16720.295197.866100.13150.16720.3070104.94

2.2.10樣品測(cè)定及含量限度的確定 按照本實(shí)驗(yàn)含量測(cè)定項(xiàng)下的方法，測(cè)得5批(批號(hào)：140116，140602，140609，140813和140825)不同樣品中的鹽酸麻黃堿含量分別為10.13，10.90，7.48，13.08和13.28 μg·mL-1。

根據(jù)上述5批樣品的含量測(cè)定結(jié)果，在其平均含量的基礎(chǔ)上再下浮30%，因此暫訂為本品1 mL含麻黃以鹽酸麻黃堿(C23H23O11)計(jì)，不得少于7 μg。

3討論

肺炎糖漿是由多味中藥飲片經(jīng)現(xiàn)代工藝加工制成，根據(jù)江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局有關(guān)醫(yī)院制劑要求，需要提高制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本制劑中連翹的定性鑒別曾參照2010年版《中國(guó)藥典》“連翹”藥材項(xiàng)下連翹苷鑒別，結(jié)果斑點(diǎn)分離不清晰，后經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，調(diào)整展開劑的比例，以三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸(12∶2.5∶2∶0.2)為展開劑，結(jié)果斑點(diǎn)分離完全、清晰，表明此方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，且陰性無干擾。

本制劑中金銀花的定性鑒別中，曾參照2010年版《中國(guó)藥典》“金銀花”藥材項(xiàng)下綠原酸的鑒別，結(jié)果斑點(diǎn)分離不清晰，陰性有干擾，后經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，改變樣品的前處理，薄層板應(yīng)用聚酰胺薄膜，展開劑調(diào)整為甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(1∶15∶1∶1∶2)的上層液；在紫外燈365 nm下檢視，結(jié)果斑點(diǎn)分離完全，表明此方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，且陰性無干擾。

玄參的定性鑒別曾參照2010年版《中國(guó)藥典》“玄參”藥材項(xiàng)下哈巴俄苷鑒別，結(jié)果斑點(diǎn)分離不清晰，陰性有干擾，后經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，改變樣品的前處理，用水飽和正丁醇振搖提取，用氨試液洗滌，再用正丁醇飽和水溶液洗滌，通過D101型大孔吸附樹脂，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)的上層液為展開劑，結(jié)果表明，此方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好。

本品是由生麻黃、連翹、金銀花等10味中藥組成的復(fù)方制劑，麻黃作為君藥，其主要化學(xué)成分為鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿等，肺炎糖漿樣品中幾乎未檢出鹽酸偽麻黃堿的色譜峰，因此建議暫不測(cè)定鹽酸偽麻黃堿的含量，僅測(cè)定樣品中鹽酸麻黃堿的含量。將提取方式進(jìn)行優(yōu)化，參考《中國(guó)藥典》2010年版一部“小兒清肺化痰口服液”含量測(cè)定項(xiàng)下的方法，建立了肺炎糖漿的含量測(cè)定方法，以鹽酸麻黃堿為對(duì)照品，根據(jù)含量測(cè)定結(jié)果，在其平均含量的基礎(chǔ)上再下浮30%，鑒于麻黃的特殊性，其上限將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步研究，因此暫訂為本品1 mL含麻黃以鹽酸麻黃堿(C23H23O11)計(jì)，下限為不低于7 μg。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)．中國(guó)藥典2010年版 [S]．一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010: 159，205，108，300.

[2]李雙，王東強(qiáng)， 李志軍.連翹主要有效成分的提取與藥理作用 [J]. 黑龍江中醫(yī)藥， 2011，12(2):46-47.

[3]梁萱，趙建軍，梁永鋒. 人工種植金銀花中綠原酸含量測(cè)定和提取工藝研究[J].西北藥學(xué)雜志，2013，28(3)：228-229.

[4]張雪原，林曉輝，嚴(yán)曉明，等. 清金丸的質(zhì)量研究[J]. 今日藥學(xué)，2014，24(11):784-787.

[5]吳飛燕，馮宋崗，曾建國(guó). 金銀花與山銀花的鑒別與歸屬研究[J]. 中草藥，2014，45(8):1150-1151.

[6]呼梅， 安小梅， 盧云. 麻桔喘咳口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 中藥與臨床， 2014，5(2):57-59.

[7]謝麗華，王建華，劉洪宇，等. 中藥玄參薄層色譜鑒別法的建立[J]. 中國(guó)中藥雜志，2000，25(11):655-656.

[8]張雪梅，王瑞，安睿，等. HPLC同時(shí)測(cè)定玄參中5種成分的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36(3):709-710.

[9]馬毅，晉玲，王振恒，等. HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地麻黃中麻黃堿和偽麻黃堿的含量[J]. 西部中醫(yī)藥，2012，25(7):14-16.

[10]韓杰，李東輝，王鑫. HPLC同時(shí)測(cè)定感冒軟膠囊中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿及葛根素和黃芩苷的含量[J]. 中成藥，2010，32(6):963-964.

[11]李倩，廖予菲，楊洋，等.HPLC-ESI-TOF-MS法優(yōu)選麻黃中麻黃堿的提取工藝[J]. 西北藥學(xué)雜志，2013，28(1)：4-7.

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.011

中圖分類號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)04-0364-04

(收稿日期：2015-09-13)

Study on the quality standard of Pneumonia Syrup

LIU Jing

(Haimen Hospital of Traditional Chinese Medicine，Haimen 226100，China)

Abstract:ObjectiveIn order to establish a TLC identification method and content determination method for Pneumonia Syrup.Method Fractus forsythiae, Lonicera japonica and Radix scrophulariae were identified by TLC. High performance liquid chromatography was adopted to analyze the content of ephedrine hydrochloride in the medicine. ResultsTLC spots were clear without negative interference.Standards for ephedrine hydrochloride were set up.Conclusion The method is easy, fast， and reliable, and could be used to control the quality of Pneumonia Syrup.

Key words:Pneumonia Syrup; TLC;HPLC