顧亞琴，楊召聰，錢知知，張良Δ

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 210023；2.江蘇省藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

ATO增強(qiáng)As2S2抗小鼠Lewis肺癌效應(yīng)的初步研究

顧亞琴1，楊召聰2，錢知知2，張良1Δ

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 210023；2.江蘇省藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

目的 觀察三氧化二砷(ATO)對(duì)硫化砷(As2S2)抗腫瘤效應(yīng)的影響。方法 選取4、2、0.5μM ATO，分別與不同濃度As2S2合用，MTT法觀察不同濃度ATO對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用；以荷Lewis肺癌小鼠為模型，隨機(jī)分為模型組，順鉑組[5 mg/(kg·d)，ip]，ATO組[1 mg/(kg·d)，ip]，As2S2高、中、低劑量組[8、2、0.4 g/(kg·d)，ig]，As2S2高、中、低劑量+ATO組，連續(xù)給藥2周。觀察小鼠體質(zhì)量、腫瘤抑制率、胸腺及脾指數(shù)、脾組織CD4+/CD8+T細(xì)胞比值；RT-PCR法檢測(cè)脾組織中穿孔素(Perforin)、顆粒酶B(Granzyme B)mRNA含量。結(jié)果 4μM ATO可顯著增強(qiáng)As2S2對(duì)Lewis細(xì)胞的增殖抑制作用(P<0.05)；As2S2中劑量+ATO組的抑瘤率顯著高于As2S2單獨(dú)給藥組(P<0.05);與As2S2單獨(dú)給藥組相比，As2S2中劑量+ATO組小鼠脾組織中CD8+T細(xì)胞數(shù)及CD4+/CD8+比值均顯著增高(P<0.05); As2S2中劑量+ATO組小鼠脾組織中Granzyme B mRNA表達(dá)顯著高于模型組(P<0.05)。結(jié)論 ATO可顯著增強(qiáng)As2S2對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，可能是通過增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)揮增效作用。

硫化砷；三氧化二砷；抗腫瘤增效；Lewis肺癌;T細(xì)胞免疫

雄黃為硫化物類礦物藥[1-2]，主要成分為硫化砷(As2S2)，同時(shí)含有少量的三氧化二砷(ATO)。入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國臨床應(yīng)用已有兩千多年歷史。雄黃在治療多種腫瘤中顯示出獨(dú)特的療效[3]，并且隨著對(duì)其抗腫瘤機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)雄黃具有發(fā)展為新型抗癌藥物的潛力，而如何使其進(jìn)一步應(yīng)用于臨床成為研究者們非常關(guān)注的問題。其所含少量的ATO為可溶性成分，毒性較大，但同時(shí)抗腫瘤作用明確，究竟應(yīng)將ATO作為有害物質(zhì)完全去除，還是應(yīng)制定限量標(biāo)準(zhǔn)予以保留，目前尚無定論。研究報(bào)道[4-5]，低劑量ATO能在不影響放、化療腫瘤治療效果的同時(shí)降低其對(duì)正常組織的毒副作用。因此，本實(shí)驗(yàn)以低劑量ATO為切入點(diǎn)，初步觀察ATO對(duì)雄黃抗腫瘤藥效的影響，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)傳統(tǒng)中藥雄黃提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與動(dòng)物：Lewis肺癌細(xì)胞由南京中醫(yī)藥大學(xué)陸茵教授饋贈(zèng)；C57BL/6雄性小鼠，SPF級(jí)，6～8周齡，18～22 g,80只，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0006]。

1.1.2 藥品：As2S2由南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心李偉東老師提供并鑒定，As2S2含量>98%，符合藥典規(guī)定；注射用ATO(北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，批號(hào)：20131002)；注射用順鉑(DDP，齊魯制藥有限公司，批號(hào)：2WA2A1402009B)。

1.1.3 試劑：DMEM培養(yǎng)(HyClone，批號(hào)：NZM1303)；胰蛋白酶(Gibco，批號(hào)：1627654)；胎牛血清(Foundation TM，A46E00F)；二甲基亞砜(Sigma)；PBS(博士德生物工程有限公司，10B16B30)；四甲基偶氮唑藍(lán)干粉(MTT，Sigma)；Anti-Mouse CD8 FITC、Anti-Mouse CD4 PE抗體均購自美國eBioscience公司。

1.1.4 儀器：Synergy HT型酶標(biāo)儀(Bio-Tek,USA)；BH2型生物顯微鏡(日本Olympus)；Accuri C6流式細(xì)胞儀(BD,USA)；游標(biāo)卡尺(上海量具刃具有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-Rad公司)；精密分析天平(Sartorius公司)；FA1104N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；熒光定量PCR(羅氏公司 Lishtcycler96)；TSZ5-WS型離心機(jī)(上海盧湘儀器有限公司)；Allegra X-15R冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，每1～2天以0.25%的胰蛋白酶消化后，傳代，細(xì)胞貼壁3～4代，取指數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)ATO對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞增殖影響：將5×104個(gè)/mL的對(duì)數(shù)生長期Lewis細(xì)胞接種于96孔板，每孔200 μL,次日分為空白對(duì)照孔，終濃度為(0，0.1,0.5,1,2,4,8,10) μM的ATO給藥組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測(cè)(自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm波長檢測(cè)各孔吸光度A值)，計(jì)算細(xì)胞存活率及增殖抑制率，初步摸索并確定對(duì)Lewis細(xì)胞無影響的ATO劑量上限值。細(xì)胞存活率=給藥組A值/空白對(duì)照組A值×100%。

1.2.3 MTT法觀察ATO對(duì)As2S2的體外抗腫瘤效應(yīng)影響：將5×104個(gè)/mL的對(duì)數(shù)生長期Lewis細(xì)胞接種于96孔板，每孔200 μL,次日分為空白對(duì)照孔，終濃度為(2,4,8,16,32,64,128)μg/mL的As2S2給藥組以及各濃度As2S2分別與ATO(0.5,2,4)μM聯(lián)合給藥組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測(cè)(自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm波長檢測(cè)各孔吸光度A值)。增殖抑制率=(1-給藥組A值/空白對(duì)照組A值)×100%。

1.2.4 模型小鼠的建立、分組及給藥:C57BL/6小鼠，80只，除正常對(duì)照組，其余每鼠接種0.2 mL Lewis肺癌細(xì)胞懸液(106/mL)于右腋窩皮下24 h后[6-7]，隨機(jī)分為模型組、DDP組(陽性藥)、ATO組、As2S2(高、中、低)組、As2S2高、中、低劑量與ATO聯(lián)合給藥組，每組8只，順鉑組腹腔注射5 mg/(kg·d)； ATO組腹腔注射1 mg/(kg·d); As2S2給藥組按照(8、2、0.4)g/(kg·d)灌胃給藥；As2S2與ATO聯(lián)合給藥組同時(shí)灌胃As2S2[8、2、0.4 g/(kg·d)]及腹腔注射ATO[1 mg/(kg·d)]，正常對(duì)照組和模型組給予等體積0.9%NaCl，皆連續(xù)給藥2周。

1.2.5 各給藥組對(duì)荷Lewis小鼠體質(zhì)量、瘤體及免疫器官的影響：給藥期間，隔天記錄小鼠體質(zhì)量；末次給藥1 h后，處死動(dòng)物，剝?nèi)×鰤K，脾臟，胸腺，分別稱重，計(jì)算抑瘤率(IR)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)。抑瘤率(%)=[1-實(shí)驗(yàn)組瘤重(g)/模型組平均瘤重(g)]×100%；臟器指數(shù)(mg/g)=臟器重量/動(dòng)物體質(zhì)量×1000。

1.2.6 T細(xì)胞檢測(cè)：每組隨機(jī)取3只小鼠，處死置于75%乙醇中浸泡3～5 min；無菌條件下制備小鼠脾淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液；根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果染抗體：FITC-CD8，PE-CD4，4 ℃避光30 min；每孔加200 μL staining buffer洗，4 ℃、1500 r/min、離心 5 min, 吸去上清，重復(fù)2次；孔里最終剩余的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管，以500 μL 1%的多聚甲醛固定，放在暗處，2 ℃～8 ℃在24 h內(nèi)檢測(cè)。

1.2.7 小鼠脾臟組織中Perforin、Granzyme B mRNA含量檢測(cè)：選取模型組、ATO(0.001 g/kg)組、As2S2中劑量組(2.00 g/kg)、As2S2+ATO中劑量組(2.00 g/kg+0.001 g/kg)，每組隨機(jī)取3只小鼠脾組織，提取組織RNA，經(jīng)質(zhì)量鑒定后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及Real-time PCR反應(yīng)。參照說明書設(shè)定PCR程序：65 ℃ 5 min變性，65 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束儀器自動(dòng)生成CT值(threshold cycles)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)管，以2-△△Ct(Ct值代表循環(huán)閾值)表示基因的表達(dá)量。β-actin的雙向引物序列為:F:5’ GTACCACCATGTACCCAGGC3’,R:5’ AACGCAGCTCAGTAACAGTCC3’;Prf1的雙向引物序列:F:5’ TCCTATGGCACGCACTTTATC 3’,R:5’ TCAGGCAGTCTCCTACCTCATC3’;Gzmb的雙向引物序列:F:5’ TGCTCTGATTACCCATCGTCC3’,R:5’ AGCCAGTCTTTGCAGTCCTTTA3’。

2 結(jié)果

2.1 ATO對(duì)As2S2抗Lewis肺癌細(xì)胞作用的影響

2.1.1 ATO對(duì)Lewis細(xì)胞的增殖抑制作用：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ATO在10 μM時(shí)，可顯著抑制Lewis細(xì)胞的增殖(P<0.05)，在低于8 μM時(shí)，Lewis細(xì)胞活性大于95%，腫瘤抑制作用較低。見表1。

表1 不同濃度ATO對(duì)Lewis細(xì)胞的增殖抑制作用

*P<0.05,**P<0.01，與空白組比較,compared with blank group

2.1.2 ATO增加As2S2對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用：0.5、2、4 μM ATO分別與As2S2合用后，僅4 μM ATO與As2S2合用時(shí)，Lewis細(xì)胞活性顯著低于As2S2單獨(dú)用藥各劑量組(P<0.05,P<0.01)；4 μM ATO時(shí)，As2S2的IC50值(19.4±6.9 μM)顯著低于As2S2單獨(dú)給藥組(33.8±7.1)μM(P<0.05，n=3)，提示在4 μM濃度下，ATO在體外可顯著增加As2S2的抗腫瘤作用。見圖1。

2.2 ATO對(duì)As2S2抗Lewis體內(nèi)移植瘤效應(yīng)的影響

2.2.1 各給藥組對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響：與模型組相比:自給藥后第8 d,DDP組小鼠體質(zhì)量顯著性下降(P<0.05,P<0.01)；As2S2高劑量組小鼠自給藥后12 d起，體質(zhì)量顯著下降(P<0.05)；As2S2中劑量組及As2S2高劑量+ATO聯(lián)合給藥組小鼠體質(zhì)量在給藥中途即分別8～12 d、4～8 d時(shí)有顯著下降(P<0.05)，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而后期體質(zhì)量均恢復(fù)至與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

圖1 不同濃度As2S2與ATO聯(lián)合用藥后對(duì)Lewis細(xì)胞的增殖抑制作用*P<0.05,**P<0.01，與As2S2組比較Fig.1 The inhibition effect of different concentrations of As2S2 combined with ATO on Lewis cell proliferation (±s，n=6)*P<0.05,**P<0.01， compared with the As2S2 group

組別只數(shù)劑量(mg/kg)給藥前給藥后4d給藥后8d給藥后12d實(shí)驗(yàn)?zāi)┠Ｐ徒M8 —19.7±0.921.1±1.121.9±1.122.5±1.522.7±2.3DDP組8 5.020.3±1.121.4±1.617.9±3.1*15.8±1.3**16.4±2.1**ATO組8 1.019.1±1.021.9±1.021.4±1.322.2±1.422.0±1.3As2S2高劑量組88000.019.5±1.221.0±1.021.5±3.121.1±1.0*20.7±1.5*As2S2高劑量+ATO組88000.0+1.019.8±1.120.4±1.320.0±1.7*20.4±1.5*21.4±1.0As2S2中劑量組82000.019.7±1.319.7±0.5*19.9±0.7*21.31±1.121.3±1.5As2S2中劑量+ATO組82000.0+1.019.9±1.0720.4±1.621.0±1.721.1±5.821.3±2.8As2S2低劑量組8400.020.2±0.821.0±1.621.0±1.221.6±1.121.5±1.1As2S2低劑量+ATO組8400.0+1.019.5±1.021.2±2.021.5±1.522.1±1.322.0±1.3

*P<0.05，**P<0.01,與模型組比較,compared with model group

2.2.2 各給藥組對(duì)荷瘤小鼠肉瘤的影響:除ATO及As2S2低劑量組，其余各給藥組瘤重均低于模型組(P<0.05)；聯(lián)合給藥組中，As2S2中劑量+ATO組抑瘤率顯著高于相同劑量時(shí)As2S2單獨(dú)給藥組(P<0.05)。見表3。

表3 各組荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率比較Tab.3 Comparison of the tumor weight and inhibition rate in each group of mice(±s)

*P<0.05，**P<0.01,與模型組比較,compared with model group；#P<0.05,與同劑量As2S2單獨(dú)給藥組比較,compared with As2S2administered alone group of the same dose

2.2.3 各給藥組對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響：與模型組比較，DDP與As2S2高劑量組荷瘤小鼠脾指數(shù)均降低(P<0.05)，其余各組未見顯著差異；As2S2+ATO聯(lián)合給藥各劑量組脾臟指數(shù)均高于相同劑量下As2S2單獨(dú)給藥組；DDP組胸腺指數(shù)低于模型組(P<0.05)，其余各給藥組未見顯著差異。見表4。

表4 各給藥組對(duì)荷瘤小鼠脾臟及胸腺指數(shù)的影響Tab.4 Changes of the indexes of spleen and thymus of each group mice(±s)

*P<0.05，**P<0.01,與模型組比較,compared with model group；#P<0.05,與同劑量As2S2單獨(dú)給藥組比較,compared with As2S2administered alone group of the same dose

2.2.4 各給藥組對(duì)荷瘤小鼠脾臟中CD4+/CD8+T細(xì)胞的影響:流式結(jié)果顯示，與模型組比較，DDP顯著提高荷瘤小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞比例；As2S2中劑量組小鼠脾組織中CD8+及CD4+T細(xì)胞表達(dá)均低于模型組；As2S2中劑量+ATO組小鼠脾組織中CD8+及CD4+T細(xì)胞表達(dá)均顯著高于相同劑量下As2S2單獨(dú)給藥組；DDP組小鼠脾組織中CD4+/CD8+比值顯著低于模型組，而ATO+As2S2聯(lián)合給藥中劑量組中CD4+/CD8+比值顯著高于相同劑量的As2S2單獨(dú)給藥組及模型組(P<0.05)。見表5、圖2。

表5 不同給藥組對(duì)荷瘤小鼠脾臟CD4+/CD8+T細(xì)胞的影響Tab.5 Effect of different administration group on mice spleen CD4+/CD8+T cells(±s)

*P<0.05，**P<0.01,與模型組比較,compared with model group；#P<0.05,與同劑量As2S2單獨(dú)給藥組比較,compared with As2S2administered alone group of the same dose

圖2 不同給藥組對(duì)荷Lewis肺癌小鼠脾臟CD4+/CD8+T細(xì)胞的影響Fig.2 Effects of different administration group on mice spleen CD4+/CD8+T cells

2.2.5 不同給藥組對(duì)荷瘤小鼠脾臟中Perforin、Granzyme B mRNA表達(dá)的影響:RT-PCR結(jié)果顯示ATO+As2S2聯(lián)合給藥后小鼠脾組織中Granzyme B mRNA水平顯著增加(P<0.01)。見表6。

表6 各給藥組對(duì)荷瘤小鼠脾臟中T淋巴效應(yīng)分子Perforin、Granzyme B mRNA表達(dá)的影響

**P<0.01,與模型組比較,compared with model group

3 討論

尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是腫瘤研究的重要內(nèi)容。中藥雄黃(As2S2)為傳統(tǒng)中藥砷劑的一種，研究顯示[8-10]其具有拮抗急性早幼粒細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、膠質(zhì)瘤等多種血液和實(shí)體腫瘤的效應(yīng)。

雄黃所含的少量可溶性成分ATO抗腫瘤藥效明確。有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)推測(cè)[11]：雄黃中As2S2既不被人體吸收，也無任何藥理活性，認(rèn)為可溶性As是雄黃的活性成分；又有實(shí)驗(yàn)報(bào)道[12]As2S2為難溶性組分，在體內(nèi)難以吸收，應(yīng)是雄黃中可溶性組分ATO在發(fā)揮藥物效應(yīng)。且早在上世紀(jì)70年代，張亭棟等[13]就采用現(xiàn)代科學(xué)的給藥方式，以ATO為主要成分制成“癌靈”注射液，治療APL；上海血研所研究報(bào)道了ATO誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡和部分分化的重要機(jī)制；2000年美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)ATO注射液作為復(fù)發(fā)性APL治療藥物。

雄黃所含的少量可溶性成分ATO毒性較大。高雙榮等[14]通過文獻(xiàn)整理分析，歸納匯總認(rèn)為砷在體內(nèi)主要以無機(jī)砷和有機(jī)砷等不同形態(tài)存在，且形態(tài)不同毒性不同，一般認(rèn)為三價(jià)砷As(Ⅲ)毒性最大，可引起肝細(xì)胞的凋亡和灶狀壞死，在體內(nèi)長期蓄積可對(duì)肝臟、腎臟、膀胱、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、胎兒發(fā)育等造成不同程度的毒性損傷；而有機(jī)砷毒性較小。顧晶晶等[15]通過比較雄黃中可溶性As與小鼠急性毒性的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：雄黃的毒性存在于其可溶性部分，LD50值與可溶性As呈負(fù)相關(guān)。國內(nèi)大多學(xué)者[15-17]，主張從炮制學(xué)的角度去除雄黃中所含ATO。但在炮制學(xué)的角度去除ATO的同時(shí)，雄黃抗腫瘤藥效及在治療劑量內(nèi)的毒性如何變化？

本實(shí)驗(yàn)首先通過MTT結(jié)果顯示：低劑量的ATO(<8 μM)處理24 h后，Lewis肺癌細(xì)胞活性大于85%，ATO對(duì)Lewis細(xì)胞活性影響較低。0.5、2、4 μM ATO分別與As2S2聯(lián)合用藥后，發(fā)現(xiàn)在與4 μM ATO聯(lián)合給藥時(shí)，Lewis細(xì)胞活性顯著低于As2S2單獨(dú)作用各劑量(P<0.05,P<0.01)。因此，初步認(rèn)為4 μM ATO可增強(qiáng)As2S2對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用。有研究報(bào)道[4-5]，低劑量的ATO(100 nM)，可通過調(diào)節(jié)正常組織發(fā)生代謝轉(zhuǎn)換，進(jìn)行糖酵解，從而抵抗化療藥物的毒性作用。同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[10]，低劑量的ATO(0.4 mg/kg)，在作用12個(gè)月后，并沒有產(chǎn)生致癌毒性。這些研究為ATO這種毒性組分的臨床應(yīng)用又提供了一個(gè)新的視角。

體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：ATO聯(lián)合給藥后，可減輕As2S2高劑量給藥時(shí)對(duì)荷瘤小鼠的體質(zhì)量減輕作用；ATO聯(lián)合給藥后，可增強(qiáng)As2S2中劑量給藥時(shí)對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤率(P<0.05)。免疫系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果顯示：ATO聯(lián)合給藥后，可增加As2S2高、中、低劑量給藥時(shí)荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)(P<0.05)，但對(duì)胸腺指數(shù)無顯著影響；ATO聯(lián)合給藥后，顯著增加As2S2低劑量給藥時(shí)小鼠脾臟CD4+/CD8+比值(P<0.05)，可見其可能是通過增強(qiáng)荷瘤小鼠機(jī)體免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤增效作用。穿孔素及顆粒酶B均為細(xì)胞毒性T細(xì)胞的效應(yīng)分子，穿孔素可在靶細(xì)胞細(xì)胞膜上形成不同直徑的小孔，使大分子物質(zhì)流出而小分子如水分子、離子等物質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞，誘導(dǎo)靶細(xì)胞滲透性壞死，而同時(shí)，顆粒酶B在穿孔素的條件下，入核，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果也表明，聯(lián)合給藥后，脾組織中顆粒酶B mRNA表達(dá)顯著性增高(P<0.05)，進(jìn)一步提示：聯(lián)合給藥增效的可能機(jī)制為免疫增強(qiáng)作用。

綜上，低劑量ATO可增加As2S2的抗Lewis肺癌作用，其抗腫瘤增效作用可能與增強(qiáng)荷瘤小鼠機(jī)體免疫功能相關(guān)，但兩者的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)及其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。因此，在傳統(tǒng)中藥雄黃的炮制過程中，可考慮限量保留ATO，但具體的劑量范圍還需要進(jìn)一步的研究探討，以更好地推進(jìn)中藥雄黃應(yīng)用于臨床。

[1] 陳朋,李紅玉.雄黃的臨床應(yīng)用與炮制方法研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2014,32(7):1663-1666.

[2] 中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:316.

[3] 張春敏,孟雙榮,齊元富,等.雄黃抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)雜志,2010,29(8):579-581.

[4] Baj G,Arnulfo A,Deaglio S,et al.Arsenic trioxide and breast cancer:analysis of the apoptotic,differentiative and immunomodulatory effects[J]. Breast Cancer Res Treat,2002,73(1):61-73.

[5] Thomas-Schoemann A,Batteux F,Mongaret C,et al.Arsenic trioxide exerts antitumor activity cancer[J].J Immunol,2012,189(11):5171-5177.

[6] 劉自軍,馬茜. 賀蘭山紫蘑多糖聯(lián)合5-Fu對(duì)H22荷瘤小鼠體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的影響[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志,2015,37(3):193-196.

[7] 于明薇,孫桂芝,張培彤,等.不同類型活血藥及其與益氣藥配伍對(duì)小鼠Lewis肺癌生長轉(zhuǎn)移的干預(yù)作用[J].北京中醫(yī)藥,2011(11):859-862.

[8] Zheng X,Rumie Vittar NB,Gai X,et al.The transcription factor GLI1 mediates TGF-β1 driven EMT in hepatocellular carcinoma via a SNAI1-dependent mechanism[J].Plos One,2012,7(11):e49581-e49581.

[9] Han JB,Sang F,Chang JJ,et al.Arsenic trioxide inhibits viability of pancreatic cancer stem cells in culture and in a xenograft model via binding to SHH-Gli[J].OncoTargets & Therapy,2013,6(8):1129-1138.

[10] Yuan ZM,Ganapathy S,Xiao S,et al.Low-dose arsenic induces chemotherapy protection via p53/NF-κB-mediated metabolic regulation[J].Oncogene,2013,33(11):1359-1366.

[11] 王曉波,襲榮剛,張治然,等.納米級(jí)雄黃粉體藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 18(6)： 324.

[12] 梁國剛,張啟偉. 朱砂、雄黃中各成分的溶解度對(duì)其藥效、毒副作用的影響[J].中國中藥雜志, 2002, 27(5)： 392.

[13] 張亭棟,張鵬飛,王守仁,等.“癌靈注射液”治療6例白血病初步臨床觀察[J].黑龍江醫(yī)學(xué),1973 (3):66-67

[14] 高雙榮,梁愛華,易艷,等.雄黃中砷的不同形態(tài)及其毒性研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011, 17(24):243-247.

[15] 顧晶晶, 黃珍禎, 谷穎敏,等. 雄黃可溶性砷和價(jià)態(tài)砷與小鼠急性毒性關(guān)系的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011, 17(8):230-233.

[16] 張偉,余伯陽,寇俊萍,等. 雄黃活性物質(zhì)的毒效相關(guān)性初步研究[J].中國天然藥物,2004,2(2):62-64.

[17] 梁愛華,李春英,王金華,等.雄黃的毒性研究[J].中國中藥雜志,2011,36(14):1889-1894.

(編校：王儼儼)

ATO enhanced anti-Lewis lung carcinoma effect of As2S2in mouse

GU Ya-qin1, YANG Zhao-cong2, Qian Zhi-zhi2, ZHANG Liang1Δ

(1. School of Pharmacy, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, China； 2.Jiangsu Key Laboratory for Pharmocology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica, Nanjing 210023, China)

ObjectiveTo investigate the synergistic anti-tumor effect of arsenic trioxide (ATO) on realgar(As2S2). MethodsThe inhibition effect of different concentrations of ATO on proliferation of Lewis lung carcinoma were observed by MTT method with 4,2,0.5μM ATO combined with different concentrations of As2S2. The Lewis lung carcinoma mice model was established and randomly divided into model group, cisplatin group[5 mg/(kg·d)，ip],ATO group[1 mg/(kg·d)，ip], As2S2high-, middle-, low-dose group[8,2,0.4 g/(kg·d)，ig], As2S2high-, middle-, low-dose combined with ATO group, with consecutive treatment of 14 days. The body mass, tumor inhibition rate, index of thymus and spleen, CD4+/CD8+T in spleen were observed, and the levels of Perforin and Granzyme B mRNA in spleen were detected by RT-PCR method. Results4μM ATO significantly increased the inhibition effect of As2S2on proliferation of Lewis cell(P<0.05); the inhibition rate of As2S2middle-dose+ATO group was higher than As2S2middle-dose group(P<0.05); compared with As2S2middle-dose group, the CD8+T and CD4+/CD8+levels in spleen of As2S2middle-dose+ATO group were higher (P<0.05); the expression of GranzymeB mRNA in spleen of As2S2middle-dose+ATO group was higher than model group (P<0.05). ConclusionATO could significantly increase the proliferation inhibition of As2S2on Lewis, probably by enhancing the immune response.

As2S2; ATO; synergies; Lewis lung carcinoma; T-cells immunity

顧亞琴，女，碩士，研究方向:中藥毒理學(xué)，E-mail:guyaqin1991@126.com；張良，通信作者，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥毒理學(xué)，E-mail:zhangl_1999@163.com。

R734.2；R73-3

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.09