范飛，柳欣林，李智海，王大寧，夏寧邵,，李少偉,Δ

(1.廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102；2. 廈門大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院/分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361102)

人乳頭瘤病毒衣殼蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進(jìn)展

范飛1，柳欣林1，李智海1，王大寧2，夏寧邵1,2，李少偉1,2Δ

(1.廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102；2. 廈門大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院/分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361102)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染會(huì)導(dǎo)致人類多種疾病，尤其是女性宮頸癌。HPV衣殼是由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2形成的T=7的正二十面體結(jié)構(gòu)，L1蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性且能在體外自組裝形成與天然病毒結(jié)構(gòu)相似的類病毒顆粒(virus like particle，VLP)，是目前HPV疫苗的理想形式。此外，L1、L2蛋白在病毒的感染中發(fā)揮著重要作用。對(duì)HPV衣殼蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究，有助于進(jìn)一步闡明HPV的顆粒組裝機(jī)制、致病機(jī)理及感染機(jī)制，為今后開(kāi)展HPV相關(guān)疾病的研究提供指導(dǎo)方向。本文就HPV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)、病毒顆粒組裝及衣殼蛋白間相互作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

人乳頭瘤病毒；衣殼蛋白；結(jié)構(gòu)生物學(xué)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一類雙鏈DNA病毒，能感染人的表皮及黏膜上皮，誘導(dǎo)上皮組織的疣狀增生乃至良惡性腫瘤。目前已分離鑒定出170多種不同的HPV型別[1]，根據(jù)HPV的致病力或致癌危險(xiǎn)性的大小，將HPV分為高危型和低危型。高危型HPV的感染會(huì)引起宮頸、陰道、陰莖、肛門和口咽的上皮內(nèi)瘤變或癌變[2]。根據(jù)2012年WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球由HPV感染導(dǎo)致的癌癥病例達(dá)到527,624例，病死率為50.3%[3]；據(jù)統(tǒng)計(jì)約86%的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，我國(guó)每年宮頸癌新發(fā)病例約6萬(wàn)人，死亡約2萬(wàn)人[4]。

天然的HPV呈現(xiàn)T=7的正二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，衣殼蛋白由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2組成，L1蛋白占病毒衣殼蛋白總量的80%～90%。L1蛋白可在體外多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)[5]，并能自組裝成與天然HPV病毒高度相似的類病毒顆粒(virus like particle，VLP)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其具有較高的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和抗體。目前已有3種疫苗上市，分別是Gardasil(HPV6/11/16/18四價(jià)疫苗)，Gardasil9(HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58九價(jià)疫苗)和Cervarix(HPV16/18二價(jià)疫苗)，這些疫苗均是基于L1 VLP研制的，對(duì)HPV的防控和人類的健康起到了重要作用[6-7]。此外，HPV L1蛋白在病毒感染細(xì)胞初期具有重要作用，參與細(xì)胞表面受體的相互作用[8-9]。L2約占衣殼蛋白總量的20%，研究發(fā)現(xiàn)L2蛋白中存在許多廣譜中和表位，具有發(fā)展為HPV廣譜疫苗的潛力[10-11]；L2蛋白在病毒感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其參與病毒感染的整個(gè)過(guò)程，包括吸附、內(nèi)吞入胞、囊泡運(yùn)輸、入核和病毒復(fù)制[12]。因此，研究HPV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)HPV病毒學(xué)的研究具有重要意義，為進(jìn)一步闡明HPV的顆粒組裝機(jī)制、致病機(jī)理及感染機(jī)制及今后研發(fā)新一代HPV疫苗和開(kāi)展HPV引起的疾病研究提供指導(dǎo)方向。本文擬就HPV衣殼蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的研究進(jìn)展作如下綜述。

1 HPV衣殼蛋白結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

近年來(lái)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)發(fā)展極為迅速，多種研究手段被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的解析，促進(jìn)了HPV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)研究。HPV L1五聚體晶體結(jié)構(gòu)，L1 VLP、假病毒以及免疫復(fù)合物低溫電鏡結(jié)構(gòu)的相繼解析，初步闡明了HPV L1蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及VLP組裝機(jī)制，對(duì)衣殼蛋白分子機(jī)制的研究及新一代HPV疫苗的設(shè)計(jì)具有重要的指導(dǎo)意義。

1.1 HPV L1結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

1.1.1 HPV L1五聚體晶體結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展及現(xiàn)狀：X-ray衍射技術(shù)廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中，在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中占有重要地位。目前已通過(guò)X-ray衍射技術(shù)解析了HPV 11，16，18和35 L1五聚體晶體結(jié)構(gòu)[13]。

2000年，陳小江等[14]首次解析了HPV16 L1 T=1 VLP的晶體結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1。2007年又獲得HPV16/18/11/35四個(gè)型別高分辨的五聚體晶體結(jié)構(gòu)[13]，見(jiàn)圖2。HPV五聚體晶體結(jié)構(gòu)的解析，初步闡明了HPV衣殼蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，是L1蛋白研究中的一個(gè)重大突破。晶體結(jié)構(gòu)解析結(jié)果顯示，HPV16 L1蛋白的核心部分是由20～382氨基酸殘基組成的類似“果凍卷”狀β折疊桶，見(jiàn)圖1。其中α螺旋用藍(lán)色表示；β折疊用紅色箭頭表示；β轉(zhuǎn)角或無(wú)規(guī)卷曲用紫色線條表示。

圖中字母B到I表示β折疊桶中的各個(gè)片段，其中C、H、E、F和B、I、D、G β-折疊片段分別形成該結(jié)構(gòu)中反向平行的2個(gè)片層，在各個(gè)β折疊片段之間存在無(wú)規(guī)則的柔性片段，其中的DE，F(xiàn)G和HI 3個(gè)loop較長(zhǎng)并具有較大的柔性，明顯突出于β折疊桶的表面。β折疊桶的N端1～20位伸出β折疊桶外，與五聚體形成相關(guān)，而C端還存在h1～h5 5個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。在HPV五聚體內(nèi)部，L1單體間存在廣泛的相互作用，5個(gè)L1蛋白分子緊密接觸，結(jié)合形成14?的中空的圓柱形五聚體，每個(gè)L1單體的β折疊桶為五聚結(jié)構(gòu)的一“角”，并通過(guò)多肽骨架與相鄰L1相互作用，這些相互作用如“搭扣”般緊密聯(lián)系形成結(jié)構(gòu)致密的五聚體。

圖1 HPV16 L1五聚體晶體結(jié)構(gòu)Fig. 1 The crystal structure of HPV16 L1 pentamer

HPV11、16、18和35四型五聚體晶體結(jié)構(gòu)解析顯示，四型HPV L1五聚體均與T=1 VLP的HPV16 L1五聚體結(jié)構(gòu)極其相似，且HPV16 L1五聚體晶體結(jié)構(gòu)的β折疊核心區(qū)和表面loop區(qū)的結(jié)構(gòu)與T=1 VLP的HPV16 L1五聚體幾乎完全重疊，但四型五聚體表面主要的loop區(qū)有著明顯的構(gòu)象差異，見(jiàn)圖2。即使是同源性較高的HPV16和HPV35五聚體，其loop區(qū)也存在一定的差異。4個(gè)型別晶體結(jié)構(gòu)顯示每個(gè)型別的BC、DE、EF、HI和FG loop區(qū)均暴露在五聚體的表面。比較不同型別HPV L1蛋白氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，L1蛋白中所有序列高變區(qū)均位于五聚體外表面的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)，且大量研究表明這5個(gè)loop區(qū)是HPV中和表位的主要區(qū)域[15]。因此，結(jié)合HPV L1晶體結(jié)構(gòu)提示loop區(qū)的差異決定著HPV型間的結(jié)構(gòu)差異，并導(dǎo)致L1中和抗體的型特異性。

圖2 HPV11、16、18和35四型五聚體loop區(qū)分析Fig.2 Loops comparison between HPV11/16/18/35 pentamers HPV16: blue (PDB: 2R5H); HPV18: violet (PDB: 2R5I); HPV11: green (PDB: 2R5K); HPV35: yellow (PDB: 2R5J)

然而，HPV11，16，18和35四型五聚體均是通過(guò)α4環(huán)缺失制備的，導(dǎo)致這些晶體結(jié)構(gòu)無(wú)法反映 L1 α4環(huán)的結(jié)構(gòu)。由于α4環(huán)的存在使五聚體容易聚集，無(wú)法獲得均一的樣品用于五聚體晶體培養(yǎng)，而解析高分辨的HPV VLP低溫電鏡結(jié)構(gòu)可解決這一問(wèn)題。

1.1.2 HPV L1 VLP低溫電鏡結(jié)構(gòu)研究：低溫電鏡技術(shù)是對(duì)含水生物大分子進(jìn)行快速低溫到液氮或液氦溫度(降溫速率>104 ℃/s)，并在低溫條件下采用低電子劑量成像，從而解析出高分辨的生物大分子三維結(jié)構(gòu)。目前，低溫電鏡技術(shù)已廣泛應(yīng)用于HPV衣殼蛋白結(jié)構(gòu)研究。早在1991年，Baker等[16]首次利用低溫電鏡和三維重構(gòu)技術(shù)解析出HPV1和BPV1的低溫電鏡三維結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)顯示HPV1和BPV1均為T=7約60 nm的內(nèi)部含有核酸組蛋白核心的二十面體結(jié)構(gòu)，2個(gè)病毒結(jié)構(gòu)形態(tài)極其相似。三維結(jié)構(gòu)顯示，HPV病毒是由72個(gè)五聚體形成的T=7的二十面體結(jié)構(gòu)，每個(gè)五聚體都是由5個(gè)L1單體聚合形成，不同五聚體之間是以五鄰體或者六鄰體的形式與其他殼粒相連。五鄰體和六鄰體的形態(tài)具有明顯的差異，六鄰體的亞單位之間聯(lián)系緊密，五聚體之間的中心距離較短；五鄰體的亞單位之間聯(lián)系松弛，明顯的相互分離，五聚體之間的中心距離較長(zhǎng)。每個(gè)五鄰體均和周圍的六鄰體相互作用。1997年，Trus等[17]解析出分辨率為9?的BPV1低溫電鏡結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)進(jìn)一步揭示了BPV VLP中五鄰體和六鄰體的差異。Harrison等[18]在2010年解析了3.6?的BPV1低溫電鏡三維結(jié)構(gòu)，該高分辨率的結(jié)構(gòu)已達(dá)到原子水平，顯示出VLP內(nèi)的部分組裝信息。該結(jié)構(gòu)揭示了L1的N端和C端如何和相鄰的五聚體相互連接形成緊致的VLP：在T=7顆粒結(jié)構(gòu)中，一個(gè)五聚體是通過(guò)β核心折疊區(qū)伸出一長(zhǎng)段C端(氨基酸404～495)延伸至鄰近的五聚體形成一個(gè)橋接結(jié)構(gòu)，11個(gè)殘基構(gòu)成橋鏈。C端的氨基酸401～437從五聚體中延伸出并“侵入”相鄰五聚體，其中426位保守的Cys與鄰近五聚體EF環(huán)上保守的171位Cys形成二硫鍵，而氨基酸438～495又重新折回到原來(lái)β折疊核心區(qū)的位置，形成“侵入”和“折返”結(jié)構(gòu)。HPV與BPV序列同源性較高、結(jié)構(gòu)高度相似，因此，高分辨率BPV低溫電鏡結(jié)構(gòu)所提供的組裝信息對(duì)闡明HPV顆粒的組裝機(jī)制具有重要參考意義。

1.1.3 HPV L1免疫復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析：低溫電鏡三維重構(gòu)技術(shù)在研究生物大分子相互作用、生物大分子功能復(fù)合體和抗原抗體免疫復(fù)合物中具有重要的地位。1998年Booy等[19]首次利用低溫電鏡三維結(jié)構(gòu)解析了13?的BPV病毒與mAb#9和mAb 5B6的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示2個(gè)抗體與BPV的結(jié)合方式完全不同，而結(jié)合方式的差異合理的解釋了2者中和機(jī)制的差異。2014年Lee等[20]解析出10? H16.V5 Fab復(fù)合物低溫電鏡三維結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示H16.V5 Fab與HPV16 VLPs上五鄰體和六鄰體的結(jié)合有明顯差異，五鄰體上H16.V5 Fab的電子密度較弱，這一原因可能是五鄰體周圍L1上的V5 Fab產(chǎn)生較大位阻，影響V5 Fab與五鄰體的L1結(jié)合，導(dǎo)致在三維重構(gòu)過(guò)程中這一區(qū)域的密度被弱化。Day等[21]研究發(fā)現(xiàn)抗體V5通過(guò)抑制HPV假病毒與細(xì)胞外基質(zhì)中受體結(jié)合的方式阻礙病毒感染，然而V5抗體不阻礙假病毒與細(xì)胞膜表面的受體如硫酸乙酰肝素結(jié)合，這可能是因?yàn)閂5抗體結(jié)合后殘留的五鄰體上一些氨基酸與硫酸乙酰肝素糖鏈結(jié)合造成的。Lee等在解析H16.V5 Fab復(fù)合物低溫電鏡三維結(jié)構(gòu)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，V5 Fab的結(jié)合引起HPV16 VLP構(gòu)象變化，同時(shí)L1 C端充當(dāng)“侵入臂”的結(jié)構(gòu)更加牢固，并使五聚體之間更加緊湊，但構(gòu)象變化的機(jī)制還需更高分辨力的結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行闡述。

Guan等[22]在2015年成功解析了HPV16 L1抗體U4復(fù)合物的低溫電鏡三維結(jié)構(gòu)，雖然分辨率較低，但三維結(jié)構(gòu)可清晰的顯示U4抗體與HPV16 VLP的結(jié)合方式：U4抗體只結(jié)合在五倍軸的頂點(diǎn)，每個(gè)VLP中含有60個(gè)U4，但U4抗體表位在L1的C端，理論上可與360個(gè)U4結(jié)合；該結(jié)構(gòu)提示L1組裝過(guò)程中C端可能發(fā)生構(gòu)象變化，五鄰體和六鄰體周圍L1的C端構(gòu)象不同，或者是六鄰體周圍五聚體之間的空隙較小，不能容納U4的結(jié)合，具體原因還需高分辨率的U4復(fù)合物低溫電鏡結(jié)構(gòu)來(lái)解釋。由于U4抗體的中和機(jī)制是阻礙假病毒與細(xì)胞膜結(jié)合，不阻礙假病毒與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合[21]，細(xì)胞膜上硫酸乙酰肝素與L1上BC、FG、HI loop和C端發(fā)生相互作用，而U4結(jié)合VLP后還剩余大量硫酸乙酰肝素和層黏連蛋白結(jié)合位點(diǎn)，因此U4抗體的表位與功能的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

另外上述V5和U4免疫復(fù)合物的低溫電鏡三維結(jié)構(gòu)分辨率較低，無(wú)法闡述V5和U4中和表位細(xì)節(jié)，因此需要解析高分辨的晶體結(jié)構(gòu)或進(jìn)一步提高免疫復(fù)合物的低溫電鏡三維結(jié)構(gòu)分辨率，詳細(xì)的闡明HPV L1中和抗體抗體的表位與功能的關(guān)系。

1.2 HPV L2結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展 L2蛋白與L1蛋白一樣，均作為結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒顆粒的形成[23]。雖然L2并不是VLP形成的關(guān)鍵蛋白，但在病毒感染、包裹基因組等環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。由于HPV L2蛋白的特殊性，L2在體外表達(dá)時(shí)構(gòu)象折疊錯(cuò)誤，致使蛋白可溶性較差，導(dǎo)致L2蛋白的晶體結(jié)構(gòu)至今還未被解析。目前，關(guān)于HPV L2結(jié)構(gòu)的報(bào)道只有2008年Buck解析的分辨率為20?的HPV16假病毒結(jié)構(gòu)[24]，該結(jié)構(gòu)顯示L2分布在L1形成的五聚體的背面，呈五星狀排布，L1與L2的化學(xué)計(jì)量比為5:1；但由于分辨率較低，仍無(wú)法分辨L2的結(jié)構(gòu)；但根據(jù)結(jié)構(gòu)提示，L1與L2至少存在2個(gè)相互作用結(jié)構(gòu)域，且L2分子間的相互作用很有可能與L2的疏水性相關(guān)；通過(guò)氨基酸突變分析獲知L2蛋白上的一些功能區(qū)域如DNA結(jié)合區(qū)、NLS位點(diǎn)、弗林蛋白位點(diǎn)、細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)、動(dòng)力蛋白結(jié)合位點(diǎn)等[24-26]。另外，大量研究表明L2蛋白N端含有廣譜中和表位，該表位融合免疫后能誘導(dǎo)交叉中和抗體。因此解析HPV L2蛋白晶體結(jié)構(gòu)或高分辨低溫電鏡三維結(jié)構(gòu)對(duì)HPV病毒學(xué)研究和L2廣譜疫苗研發(fā)具有重要意義。

2 HPV VLP組裝研究進(jìn)展

現(xiàn)有的HPV疫苗都是基于HPV L1 VLP研制的，VLP三維結(jié)構(gòu)的解析有助于理解病毒顆粒的組裝機(jī)制，但影響HPV VLP組裝的因素眾多，研究HPV VLP組裝機(jī)制及影響VLP組裝因素對(duì)HPV VLP疫苗研制具有重要意義。

HPV L1蛋白具有較強(qiáng)的自組裝能力，研究表明，多種表達(dá)系統(tǒng)來(lái)源的L1蛋白在特定的條件下能自組裝成VLP。研究發(fā)現(xiàn)，VLP的組裝與多種因素有關(guān)，主要包括以下4個(gè)因素：①半胱氨酸和二硫鍵：二硫鍵在五聚體形成及72個(gè)五聚體形成正二十面體的過(guò)程中至關(guān)重要，Sapp等[28]于1995年首次證實(shí)經(jīng)二硫蘇糖醇(DTT)處理過(guò)的L1 VLPs可解聚成殼粒；另外研究進(jìn)一步表明，在體外利用氧化劑促進(jìn)半胱氨酸之間二硫鍵的形成將會(huì)促進(jìn)五聚體組裝成顆粒[29]。通過(guò)多個(gè)型別HPV L1蛋白序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，HPV L1中含有大量半胱氨酸(Cys)，部分半胱氨酸具有高度的保守性且對(duì)VLP組裝影響較大，通過(guò)對(duì)HPV16 L1蛋白上的Cys進(jìn)行突變研究發(fā)現(xiàn)其中C175、C185和C428突變后影響HPV16 VLP組裝，表明這些半胱氨基酸是VLP組裝的關(guān)鍵氨基酸；Wolf等[18, 30]解析的T=7的BPV顆粒中C175和C428形成的二硫鍵能穩(wěn)定VLP結(jié)構(gòu)。因此，L1蛋白自組裝的一個(gè)重要條件是局部氧化環(huán)境的形成。利用去除溶液中還原劑，添加適當(dāng)?shù)难趸瘎┑确椒ǘ伎梢源龠M(jìn)L1蛋白的組裝。②pH和離子強(qiáng)度：有研究表明較低的pH值(6～7)，與較高的離子強(qiáng)度也有助于VLP的形成[31]。③L1蛋白N端和C端長(zhǎng)度：研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)N端截?cái)嗌儆?0個(gè)氨基酸時(shí)，不影響顆粒的組裝，當(dāng)N端截?cái)嘀?0個(gè)氨基酸時(shí)，只能形成T=1的“小”VLP，當(dāng)N端截?cái)嘀?5個(gè)氨基酸時(shí)，則不能形成VLP；C端截?cái)嗖怀^(guò)30個(gè)氨基酸時(shí)對(duì)組裝幾乎沒(méi)有影響，超過(guò)46個(gè)氨基酸則不能形成VLP；另外，L1 C端的h4環(huán)對(duì)VLP的形成至關(guān)重要，缺失后，L1只能形成五聚體，無(wú)法形成任何大小的VLPs[3,12,31]。④L2輔助組裝：L1和L2蛋白共同組成HPV衣殼蛋白，L1在沒(méi)有L2的情況下可自組裝成與真病毒結(jié)構(gòu)相似的VLPs，而單獨(dú)的L2無(wú)自組裝能力，但研究表明，L2不但可以結(jié)合DNA和L1，還具有輔助L1五聚體組裝成VLP的功能，L2蛋白能促使不能形成VLP的L1突變蛋白形成VLP[34-35]。

3 HPV L1/L2相互作用研究進(jìn)展

HPV病毒顆粒由L1和L2 2種蛋白組成，L2通過(guò)與L1相互作用嵌合在五聚體孔洞中，闡述L1和L2蛋白相互作用將促進(jìn)HPV感染研究，深化人們HPV病毒學(xué)的認(rèn)識(shí)。2008年Buck等[24]解析的分辨率為20?的HPV16假病毒低溫電鏡結(jié)構(gòu)，首次基本明確了HPV中L2蛋白的含量和分布，提示L1和L2間存在相互作用，但由于分辨率的限制，該結(jié)構(gòu)無(wú)法解釋L2如何巧妙的插入五聚體的內(nèi)腔與L1相互協(xié)調(diào)組成完美的顆粒。后續(xù)進(jìn)一步研究揭示L2的N端通過(guò)疏水相互作用與L1接觸，L2的C端也與L1存在相互作用[36-37]。陳小江等[14]解析的HPV L1五聚體結(jié)構(gòu)提示DE loop可能與L2蛋白存在相互作用，為了分析L1、L2相互作用關(guān)系及相互作用關(guān)鍵位點(diǎn)，Lowe等[38]通過(guò)模擬HPV L2結(jié)構(gòu)，利用結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件分析L1/L2相互作用區(qū)域，結(jié)果顯示L1的DE、FG loop和C端與L2發(fā)生相互作用。Faust和Dillner在對(duì)中和抗體表位的研究中發(fā)現(xiàn)，位于BC、DE、FG和HI loop上的一些位點(diǎn)突變后會(huì)影響L2蛋白的結(jié)合和DNA的包裹，推測(cè)這些位點(diǎn)突變可能影響L1、L2的相互作用[39]。

綜上所述，目前對(duì)于HPVL1/L2相互作用的研究比較片面，只有獲得較高分辨率的HPV假病毒結(jié)構(gòu)或L1/L2五聚體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，才能更清楚的展開(kāi)L1、L2相互作用的研究。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的快速發(fā)展使得人們對(duì)HPV衣殼蛋白結(jié)構(gòu)與功能有了新的認(rèn)識(shí)。HPV L1 T=1 VLP及五聚體晶體結(jié)構(gòu)的解析闡明了HPV衣殼蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，并揭示HPV L1 loop區(qū)很可能是HPV血清型或組織特異性的分子基礎(chǔ)，對(duì)HPV L1結(jié)構(gòu)差異的研究及后續(xù)開(kāi)發(fā)廣譜疫苗具有重要的意義；HPV/BPV VLP及HPV假病毒低溫電鏡三維結(jié)構(gòu)的解析對(duì)闡明HPV顆粒的組裝機(jī)制具有重要的參考意義；免疫復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析對(duì)闡明HPV病毒感染及抗體功能差異的研究提供了重要的參考依據(jù)。然而，至今仍有許多重要的問(wèn)題沒(méi)有解決，如L2蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、L1/L2蛋白相互作用關(guān)系、HPV顆粒的內(nèi)部組裝機(jī)制及HPV病毒的感染與致病機(jī)制等。這些問(wèn)題的解決還需對(duì)HPV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究，如解析高分辨HPV L1免疫復(fù)合物結(jié)構(gòu)晶體結(jié)構(gòu)、L2蛋白的結(jié)構(gòu)、L1/L2復(fù)合物結(jié)構(gòu)、HPV假病毒及真病毒高分辨率低溫電鏡結(jié)構(gòu)等。

[1] de Villiers E-M. Cross-roads in the classification of papillomaviruses[J]. Virology, 2013, 445(1): 2-10.

[2] Cubie HA. Diseases associated with human papillomavirus infection[J]. Virology, 2013, 445(1): 21-34.

[3] Bruni L, Barrionuevo-Rosas L, Albero G, et al. ICO Information Centre on HPV and Cancer (HPV Information Center)[R]. Human Papillomavirus and Related Diseases in the World. 2015.

[4] Li J, Kang LN, Qiao YL. Review of the cervical cancer disease burden in mainland China[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2011, 12(5): 1149-1153.

[5] Kushnir N, Streatfield SJ,Yusibov V. Virus-like particles as a highly efficient vaccine platform: diversity of targets and production systems and advances in clinical development[J]. Vaccine, 2012, 31(1): 58-83.

[6] Schiller JT, Castellsagué X,Garland SM. A review of clinical trials of human papillomavirus prophylactic vaccines[J]. Vaccine, 2012(30): F123-F138.

[7] Joura EA, Giuliano AR, Iversen OE, et al. A 9-valent HPV vaccine against infection and intraepithelial neoplasia in women[J]. New Engl J Med, 2015, 372(8): 711-723.

[8] Richards KF, Bienkowska-Haba M,Dasgupta J,et al.Multiple heparan sulfate binding site engagements are required for the infectious entry of human papillomavirus type 16[J]. J Virol, 2013, 87(21): 11426-11437.

[9] Buck CB, Day PM, Trus BL. The papillomavirus major capsid protein L1[J]. Virology, 2013, 445(1): 169-174.

[10] Karanam B, Jagu S, Huh WK, et al. Developing vaccines against minor capsid antigen L2 to prevent papillomavirus infection[J]. Immunol Cell Biol, 2009, 87(4): 287-299.

[11] Dochez C, Bogers JJ, Verhelst R, et al. HPV vaccines to prevent cervical cancer and genital warts: an update[J]. Vaccine, 2014, 32(14): 1595-1601.

[12] Letian T, Tianyu Z. Cellular receptor binding and entry of human papillomavirus[J]. Virol J, 2010, 7: 2.

[13] Bishop B, Dasgupta J, Klein M, et al. Crystal structures of four types of Human Papillomavirus L1 Capsid Proteins understanding the specificity of neutralizing monoclonal antibodies[J].J Biol Chem,2007,282(43): 31803-31811.

[14] Chen XS, Garcea RL,Goldberg I,et al. Structure of small virus-like particles assembled from the L1 protein of human papillomavirus 16[J]. Mol Cell, 2000, 5(3): 557-567.

[15] Fleury MJ, Touzé A,Maurel MC,et al. Identification of neutralizing conformational epitopes on the human papillomavirus type 31 major capsid protein and functional implications[J]. Protein Sci, 2009, 18(7): 1425-1438.

[16] Baker T, Newcomb W, Olson N, et al. Structures of bovine and human papillomaviruses. Analysis by cryoelectron microscopy and three-dimensional image reconstruction[J].Biophys J, 1991, 60(6): 1445-1456.

[17] Trus BL,Roden RB,Greenstone HL,et al. Novel structural features of bovine papillomavirus capsid revealed by a three-dimensional reconstruction to 9? resolution[J]. Nat Struct Mol Biol, 1997, 4(5): 413-420.

[18] Wolf M, Garcea RL,Grigorieff N, et al. Subunit interactions in bovine papillomavirus[J]. Proc Nati Acad Sci USA, 2010, 107(14): 6298-6303.

[19] Booy FP, Roden RB, Greenstone HL, et al. Two antibodies that neutralize papillomavirus by different mechanisms show distinct binding patterns at 13? resolution[J]. J Mol Biol, 1998, 281(1): 95-106.

[20] Lee H, Brendle SA, Bywaters SM, et al. A cryo-electron microscopy study identifies the complete H16. V5 epitope and reveals global conformational changes initiated by binding of the neutralizing antibody fragment[J]. J Virol, 2015, 89(2): 1428-1438.

[21] Day PM, Thompson CD, Buck CB, et al. Neutralization of human papillomavirus with monoclonal antibodies reveals different mechanisms of inhibition[J]. J Virol, 2007, 81(16): 8784-8792.

[22] Guan J,Bywaters SM,Brendle SA,et al. The U4 Antibody Epitope on Human Papillomavirus 16 Identified by Cryo-electron Microscopy[J]. J Virol, 2015, 89(23): 12108-12117.

[23] Mohiuddin K, Otomo K, Ogawa Y, et al. Seasonal and spatial distribution of trace elements in the water and sediments of the Tsurumi River in Japan[J]. Environ Monit Assess, 2012, 184(1): 265-279.

[24] Buck CB, Cheng N, Thompson CD, et al. Arrangement of L2 within the papillomavirus capsid[J]. J Virol, 2008, 82(11): 5190-5197.

[25] Richards RM, Lowy DR, Schiller JT, et al. Cleavage of the papillomavirus minor capsid protein, L2, at a furin consensus site is necessary for infection[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(5): 1522-1527.

[26] Florin L, Becker KA, Lambert C, et al. Identification of a dynein interacting domain in the papillomavirus minor capsid protein L2[J]. J Virol, 2006, 80(13): 6691-6696.

[27] Raff AB, Woodham AW, Raff LM, et al. The evolving field of human papillomavirus receptor research: a review of binding and entry[J]. J Virol, 2013, 87(11): 6062-6072.

[28] Sapp M, Volpers C, Müller M, et al. Organization of the major and minor capsid proteins in human papillomavirus type 33 virus-like particles[J]. J Gen Virol,1995,76(9): 2407-2412.

[29] Chen XS, Casini G, Harrison SC, et al. Papillomavirus capsid protein expression in Escherichia coli: purification and assembly of HPV11 and HPV16 L1[J]. J Mol Biol, 2001, 307(1): 173-182.

[30] Cardone G, Moyer AL, Cheng N, et al. Maturation of the human papillomavirus 16 capsid[J]. MBio, 2014, 5(4): e01104-eo1114.

[31] Hanslip SJ, Zaccai NR, Middelberg AP, et al. Assembly of Human Papillomavirus Type‐16 Virus‐Like Particles: Multifactorial Study of Assembly and Competing Aggregation[J]. Biotechnol Prog, 2006, 22(2): 554-560.

[32] Correnti M, Medina F, Cavazza ME, et al. Human papillomavirus (HPV) type distribution in cervical carcinoma, low-grade, and high-grade squamous intraepithelial lesions in Venezuelan women[J]. Gynecol Oncol, 2011, 121(3): 527-531.

[33] Popadiuk C, Stankiewicz A, Dickinson J, et al. Invasive Cervical Cancer Incidence and Mortality Among Canadian WomenAged 15 to 29 and the Impact of Screening[J]. J Obstet Gynaecol Can, 2012, 34(12): 1167-1176.

[34] Ishii Y, Ozaki S, Tanaka K, et al. Human papillomavirus 16 minor capsid protein L2 helps capsomeres assemble independently of intercapsomeric disulfide bonding[J]. Virus Genes, 2005, 31(3): 321-328.

[35] Buck CB, Trus BL.The papillomavirus virion: a machine built to hide molecular Achilles’ heels[J]. Adv Exp Med Biol,2012(726): 403-422.

[36] Finnen RL, Erickson KD, Chen XS, et al. Interactions between papillomavirus L1 and L2 capsid proteins[J]. J Virol, 2003, 77(8): 4818-4826.

[37] Wang JW, Roden RB. L2, the minor capsid protein of papillomavirus[J]. Virology, 2013, 445(1): 175-186.

[38] Lowe J,Panda D,Rose S, et al. Evolutionary and structural analyses of alpha-papillomavirus capsid proteins yields novel insights into L2 structure and interaction with L1[J]. Virol J, 2008, 5(1): 1.

[39] Faust H,Dillner J. Mutations in human papillomavirus type 16 L1 hypervariable surface-exposed loops affect L2 binding and DNA encapsidation[J]. J Gen Virol, 2013, 94(8): 1841-1849.

(編校：王冬梅)

Advances in structural biology of human papillomavirus capsid proteins

FAN Fei1, LIU Xin-lin1, LI Zhi-hai1, WANG Da-ning2, XIA Ning-shao1,2, LI Shao-wei1,2Δ

(1.National Institute of Diagnostics and Vaccine Development of Infectious Diseases, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China; 2.State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, School of Public Health, Xiamen University, Xiamen 361102, China)

Human papillomavirus (HPV) infection can induce several epithelial cancers, especially cervical cancer. HPV has a T=7 icosahedral capsid which is composed of L1 major capsid protein and L2 minor capsid protein. L1 protein has strong immunogenicity and can self-assemble into virus like particles (VLPs) which are structurally and immunologically similar to the native virions and have been considered as the ideal form of the current vaccine. In addition, both L1 and L2 proteins play an important role in viral infection. Therefore, study of the structures and the functions of the capsid proteins will help to elucidate the mechanisms of particle assembly, virus infection and pathogenesis, and provide insights for the research of HPV related diseases in the future. This review focuses on the research progress in structure, assembly conditions and the interaction of HPV capsid proteins.

human papillomavirus; capsid protein; structural biology

范飛，女，碩士在讀，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：514412496@qq.com；李少偉，通信作者，男，博士，教授，研究方向：分子病毒學(xué)，E-mail: shaowei@xmu.edu.cn。

R373

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.06