劉新玉，劉昱磊，羅頌平

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院 中醫(yī)科，廣東 深圳 518038；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510405)

菟絲子提取物含藥血清對(duì)人早孕滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖及凋亡的影響

劉新玉1Δ，劉昱磊1，羅頌平2

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院 中醫(yī)科，廣東 深圳 518038；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510405)

目的 探討菟絲子提取物的含藥血清對(duì)正常人早孕細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(cytotrophoblast,CTB)增殖及凋亡的調(diào)節(jié)作用。方法 雌性SD大鼠隨機(jī)分為8組，每組5只，包括空白血清對(duì)照組，減味壽胎丸組，菟絲子總提物高、低劑量組，菟絲子總黃酮高、低劑量組，菟絲子總多糖高、低劑量組，各組灌胃予對(duì)應(yīng)藥物，2次/天，連續(xù)3 d后腹主動(dòng)脈采血分離血清。上述空白血清或各提取物血清以不同體積(5%、10%、20%)分別培養(yǎng)CTB細(xì)胞，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，各提取物高、低濃度含藥血清培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，吸光度值均一定程度增加，除5%菟絲子總提物高劑量組及5%菟絲子總多糖低劑量組外，余各組5%、10%、20%含藥血清與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。細(xì)胞增殖活性隨含藥血清濃度升高而增加，呈明顯劑量依賴(lài)性。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，與空白血清組比較，各組S期細(xì)胞百分比均顯著增加(P<0.05，P<0.01)；而G2/M期細(xì)胞百分比顯著減少(P<0.05，P<0.01)。干預(yù)48 h后，細(xì)胞周期分布變化趨勢(shì)與24 h一致，而且變化更明顯。結(jié)論 菟絲子各提取物高、低劑量含藥血清均可增加CTB細(xì)胞的增殖活性，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生。藥效最佳劑量分別為：菟絲子總提物低劑量、總黃酮高劑量及總多糖高劑量。

菟絲子；細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞；總提物；總黃酮；總多糖

壽胎丸是治療先兆流產(chǎn)的基礎(chǔ)方，大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究均已證實(shí)其補(bǔ)腎安胎的藥效[1-2]。作為該復(fù)方的組成君藥，菟絲子具有補(bǔ)肝腎、益精明目、固精縮尿、止瀉安胎的功效。用于陽(yáng)痿遺精，遺尿尿頻，腰膝酸軟，腎虛胎漏，胎動(dòng)不安等癥。前期研究表明在降低腎虛流產(chǎn)模型大鼠的流產(chǎn)率，提高大鼠血清孕酮(P)及雌二醇(E2)水平、增加子宮蛻膜孕酮受體(PR)mRNA表達(dá)方面，壽胎丸復(fù)方中各單味藥的貢獻(xiàn)度依次為：菟絲子>桑寄生=續(xù)斷>阿膠[3-4]，充分體現(xiàn)了菟絲子在該復(fù)方中的君藥地位。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)菟絲子總提物及其有效部位提取物菟絲子總黃酮及總多糖均可降低流產(chǎn)模型大鼠的流產(chǎn)率，具有補(bǔ)腎安胎的作用[5]。細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞是孕早期胚胎著床及正常發(fā)育最重要的細(xì)胞之一，其增值及凋亡活性直接影響到胚胎能否正常發(fā)育或發(fā)生自然流產(chǎn)，因此本研究擬運(yùn)用中藥血清藥理學(xué)研究方法，以人早孕細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(CTB)模型為研究載體，研究壽胎丸君藥菟絲子總提物、菟絲子總黃酮提取物及菟絲子總多糖提取物含藥血清對(duì)CTB細(xì)胞增殖、分化潛能及凋亡的影響，以期初步研究菟絲子補(bǔ)腎安胎的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雌性SD大鼠40只，7～9周齡，體質(zhì)量200～250 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：0088328)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：減味壽胎丸復(fù)方成分菟絲子、桑寄生及續(xù)斷三味藥材，按原方比例藥材購(gòu)自廣州中醫(yī)藥學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)鑒定并按前期實(shí)驗(yàn)方法[5]提取鑒定后備用。結(jié)合動(dòng)物藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果及中藥血清藥理學(xué)研究方法，確定提取物的劑量。以下藥物均以無(wú)菌0.9%NaCl溶液溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配，用前搖勻。具體劑量及濃度見(jiàn)表1。

表1 菟絲子總提物及其有效部位化合物提取物不同組別劑量及濃度

1.1.3 試劑：DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA、Collagenase I、雙抗(青霉素、鏈霉素)均為美國(guó)Gibico公司產(chǎn)品；MTT試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器與設(shè)備：1X70倒置系統(tǒng)顯微鏡帶INFINITY全自動(dòng)顯微攝像頭(OLIMPUS)；BIORAD550型酶標(biāo)儀(Thermo SCIENTIFIC MULTISCAN MK3)；ALTRA EPICS型流式細(xì)胞儀(美國(guó) BECKMAN COULTER 公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物含藥血清的制備方法及步驟：大鼠隨機(jī)分為8組，每組5只，包括：空白血清對(duì)照組(等量0.9%NaCl溶液灌胃)；減味壽胎丸組(1 g/kg劑量灌胃)；菟絲子總提物高、低劑量組(分別按臨床成人等效劑量的5倍、1倍劑量灌胃，下同)；菟絲子總黃酮高、低劑量組；菟絲子總多糖高、低劑量組。每天灌胃給藥2次，上下午各1次，連續(xù)3 d，末次給藥前禁食不禁水12 h。所有大鼠于末次給藥1 h后用10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血約5 mL，靜置4 h以上，1500 r/min離心10 min分離血清，56 ℃水浴鍋中水浴30 min滅活，無(wú)菌超凈臺(tái)中經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，離心管分裝并標(biāo)記，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力：將原代培養(yǎng)的CTB細(xì)胞以1.5×104/mL的密度接種于96孔板，100 μL/孔，置37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；去除培養(yǎng)液，加入無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組方案，將細(xì)胞分成8組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別加入5%、10%、20%的空白對(duì)照組、減味壽胎丸組、菟絲子總提物高低劑量組、菟絲子總黃酮高低劑量組及菟絲子總多糖高低劑量組含藥血清；再于對(duì)應(yīng)孔中分別加入95、90、80 μL培養(yǎng)液，使每孔總體積100 μL；孵育48 h；每孔加入50 μL 1×MTT，孵育4 h；吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，培養(yǎng)板置于平板搖床震蕩10 min使結(jié)晶物完全溶解；酶聯(lián)免疫分析儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度值(A值)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 細(xì)胞周期分析

① 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：將生長(zhǎng)同步化的細(xì)胞加入不同組別含藥血清分別培養(yǎng)24、48 h；收集培養(yǎng)液至離心管內(nèi)，0.25%胰蛋白酶消化，至細(xì)胞可被移液管吹打下來(lái)時(shí)，加入前面收集的培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞，再次收集到離心管內(nèi)；1000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞；吸出上清，加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，再次離心沉淀細(xì)胞；吸出上清，輕彈離心管底以免細(xì)胞成團(tuán)。

② 細(xì)胞固定：加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃過(guò)夜固定24 h； 1000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞；吸出上清，加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到離心管，再次離心沉淀細(xì)胞并小心吸出上清，避免細(xì)胞成團(tuán)。

③ 染色及流式檢測(cè)和分析：每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，充分重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min。流式細(xì)胞儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。流式細(xì)胞儀Muhicycle分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。以DNA含量為橫坐標(biāo)，受檢細(xì)胞為縱坐標(biāo)作圖，用累積曲線(xiàn)分割法計(jì)算各期細(xì)胞所占比例。

2 結(jié)果

2.1 不同組別含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖活性情況的影響 與空白對(duì)照組血清相比，不同組別不同濃度含藥血清培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，吸光度值均有一定程度增加，與5%空白血清組比較，除菟絲子總提物高劑量組及菟絲子總多糖低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，余各組5%含藥血清均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與10%空白血清組比較，各組10%含藥血清差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；與20%空白血清組比較，各組20%含藥血清差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。提示不同濃度的含藥血清均可增加細(xì)胞的增殖活性。

各組不同濃度含藥血清吸光度值比較，5%、10%、20%濃度的含藥血清分別培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，吸光度值均逐漸增加，顯示細(xì)胞增殖活性隨含藥血清濃度升高而增加，呈明顯劑量依賴(lài)性。其中空白對(duì)照組、減味壽胎丸組不同濃度間吸光度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；菟絲子總提物高、低劑量組、菟絲子總黃酮低劑量組及菟絲子總多糖高劑量組5%含藥血清與20%含藥血清吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；菟絲子總黃酮高劑量組及菟絲子總多糖低劑量組5%含藥血清與10%含藥血清和20%含藥血清吸光度值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；各組20%含藥血清吸光度值較10%含藥血清均有一定程度增加，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

菟絲子各提取物組間比較，增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性效果最好的組別分別為：總提物低劑量組、總黃酮高劑量組及總多糖高劑量組。

表2 不同組別不同濃度含藥血清干預(yù)48 h后細(xì)胞吸光度值比較Tab.2 Comparison of the absorbance value of the cells after interfered with different groups of serum extraction at different concentrations(±s，n=5)

*P<0.05，**P<0.01，與空白對(duì)照組比，compared with blank control group；#P<0.05，##P<0.01，與5%含藥血清比，compared with 5%serum of extract

2.2 10%含藥血清對(duì)細(xì)胞周期影響的分析 空白對(duì)照血清培養(yǎng)細(xì)胞24 h后, S期細(xì)胞數(shù)量較少，而不同組別提取物10%含藥血清干預(yù)細(xì)胞24 h后，S期細(xì)胞百分比顯著增加。與空白血清組比較，各組10%含藥血清S期細(xì)胞百分比均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；而不同組別提取物10%含藥血清干預(yù)細(xì)胞24 h后， G2/M期細(xì)胞百分比較空白對(duì)照組顯著減少(P<0.05，P<0.01)；與空白血清組比較，各組10%含藥血清G1/G0期細(xì)胞百分比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別用空白對(duì)照血清及10%不同組別提取物含藥血清培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期分布變化趨勢(shì)與24 h一致，而且變化更加明顯(P<0.05或<0.01)。見(jiàn)表3。

各組提取物含藥血清組間比較，10%不同組別提取物含藥血清培養(yǎng)細(xì)胞24 h及48 h后，S期細(xì)胞百分比菟絲子總多糖低劑量組與減味壽胎丸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，余各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

菟絲子各提取物組間比較，對(duì)細(xì)胞周期分布影響效果最好的組別分別為：總提物低劑量組、總黃酮高劑量組及總多糖高劑量組。

表3 不同組別10%含藥血清作用24 h及48 h后CTB細(xì)胞的周期分布Tab.3 Cell cycle distribution of the CTB cells after interfered with 10% serum in different groups(±s，%，n=5)

*P<0.05，**P<0.01，與空白對(duì)照組比，compared with blank control group；△P<0.05，與減味壽胎丸組比，compared with Shoutaiwanjianwei group

3 討論

菟絲子是壽胎丸的君藥，其化學(xué)成分主要包括黃酮類(lèi)、糖苷、氨基酸及微量元素，還有膽甾醇、蕓苔甾醇、谷甾醇、豆甾醇及三萜酸類(lèi)、生物堿、香豆素、鞣酸等化學(xué)成分[6]。其中黃酮類(lèi)是其主要活性成分，其次為糖類(lèi)物質(zhì)。同時(shí)，菟絲子黃酮能改善心血管血流動(dòng)力學(xué)， 有免疫增強(qiáng)作用，因此它和多糖成分可能都會(huì)對(duì)菟絲子的補(bǔ)益活性產(chǎn)生影響[7]。因此本研究以菟絲子總黃酮及總多糖提取物為研究對(duì)象。

滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)胚泡的植入及胚胎的正常發(fā)育起重要作用。滋養(yǎng)層細(xì)胞又分為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(CTB)，前者是一個(gè)多核細(xì)胞體，位于絨毛膜表面，直接參與母體-胎兒之間物質(zhì)交換，喪失了增殖能力，需要具有明顯增殖能力的CTB細(xì)胞持續(xù)增生、融合以維持其功能。細(xì)胞增殖是細(xì)胞擴(kuò)增及組織和器官發(fā)育的基礎(chǔ)，在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[8]。一旦此過(guò)程受到破壞或干擾，就會(huì)導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育[9]。因此CTB細(xì)胞的增殖功能對(duì)妊娠維持至關(guān)重要。CTB細(xì)胞良好的增殖是胚胎正常生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，正常早孕期CTB細(xì)胞的增殖能力很強(qiáng)，而反復(fù)自然流產(chǎn)、IUGR、先兆子癇等均伴有CTB細(xì)胞的增殖能力下降[10]。

王海燕等[11]探討補(bǔ)腎益氣方對(duì)正常早孕期人CTB細(xì)胞增殖、侵襲、分化等生物學(xué)行為的影響，采用MTT分析了不同濃度含藥血清對(duì)CTB細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)含藥血清培養(yǎng)的細(xì)胞在490 nm處的光吸收值明顯高于空白對(duì)照組，且隨著給藥濃度增加，給藥時(shí)間延長(zhǎng)，這種作用更加明顯，提示補(bǔ)腎中藥增強(qiáng)生長(zhǎng)中的正常早孕期人CTB細(xì)胞的活力。邢長(zhǎng)英等[12]用灌服補(bǔ)腎益氣方的大鼠血清處理體外培養(yǎng)的人CTB細(xì)胞48 h，可見(jiàn)人CTB細(xì)胞的增殖活力增強(qiáng)，且體積分?jǐn)?shù)20%含藥血清的作用高于10%含藥血清(P<0.01)。提示補(bǔ)腎益氣方不僅促進(jìn)CTB細(xì)胞增殖活力, 并且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi), 中藥促增殖的作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。馬紅霞等[13]研究菟絲子總黃酮對(duì)CTB細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果提示菟絲子總黃酮呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性增強(qiáng)早孕期CTB細(xì)胞活力，促進(jìn)CTB細(xì)胞ERK1/2的磷酸化。推測(cè)菟絲子總黃酮可能是通過(guò)活化MAPK/ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)CTB細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果亦表明菟絲子總提物、菟絲子總黃酮及菟絲子總多糖高、低濃度的含藥血清均可增加細(xì)胞的增殖活性(P<0.05)。且細(xì)胞增殖活性隨含藥血清濃度升高而增加，呈明顯的劑量依賴(lài)性(P<0.05)。各提取物不同劑量組對(duì)細(xì)胞增殖活性增加程度比較效果最好的分別為：菟絲子總提物低劑量組、菟絲子總黃酮高劑量組及菟絲子總多糖高劑量組。這表明作為菟絲子主要有效成分的總黃酮和總多糖物質(zhì)均可增強(qiáng)CTB細(xì)胞的增殖活性，這可能與菟絲子作為壽胎丸復(fù)方的君藥發(fā)揮補(bǔ)腎安胎藥效有著密切關(guān)系。

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。早孕期CTB細(xì)胞以增殖為主，同時(shí)，正常妊娠亦存在一定程度的滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡[14]，且主要發(fā)生在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，適度的細(xì)胞凋亡有利于絨毛內(nèi)血管腔及分支形成。正常妊娠中滋養(yǎng)層細(xì)胞存在一定程度的凋亡，而流產(chǎn)患者的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡率則明顯增多[15]。同時(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡具有重要的生理和病理意義，因此進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的研究具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。

王晟等[16]研究菟絲子總黃酮對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)睪丸細(xì)胞所致凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)睪丸細(xì)胞亞二倍體凋亡，結(jié)果顯示對(duì)照組的亞二倍體細(xì)胞含量幾乎是高劑量組的2倍。表明菟絲子總黃酮對(duì)于生精細(xì)胞具有保護(hù)凋亡作用，菟絲子總黃酮具有抗氧化、清除氧自由基、抑制睪丸細(xì)胞凋亡的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究表明各提取物10%含藥血清分別培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，S期細(xì)胞百分比均較空白對(duì)照組顯著增加(P均<0.05，P<0.01)，G2/M期細(xì)胞百分比較空白對(duì)照組顯著減少(P均<0.05，P<0.01)。提示10%含藥血清培養(yǎng)細(xì)胞后，處于S期的細(xì)胞明顯增多，阻滯在G2-M期細(xì)胞減少，表明含藥血清可誘導(dǎo)細(xì)胞處于DNA合成期及有絲分裂期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生率。菟絲子各提取物組間比較，對(duì)細(xì)胞周期分布影響效果最好的組別分別為：總提物低劑量組、總黃酮高劑量組及總多糖高劑量組。

綜上所述，本研究分別采用MTT法及流式細(xì)胞術(shù)用檢測(cè)了CTB細(xì)胞的吸光度值及細(xì)胞周期中不同時(shí)期的細(xì)胞數(shù)，分析含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響，證實(shí)含藥血清能促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)果提示：菟絲子總提物、菟絲子總黃酮及總多糖提取物高、低濃度的含藥血清均可增加細(xì)胞的增殖活性。且細(xì)胞增殖活性隨含藥血清濃度升高而增加，呈明顯劑量依賴(lài)性。10%含藥血清培養(yǎng)細(xì)胞24、48 h后，處于S期的細(xì)胞明顯增多，阻滯在G2-M期細(xì)胞減少，表明含藥血清可誘導(dǎo)細(xì)胞處于DNA合成期及有絲分裂期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生率。菟絲子總提物、菟絲子總黃酮及總多糖提取物高低劑量組與減味壽胎丸組均能促進(jìn)細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生率，這為菟絲子作為該復(fù)方的主要成分發(fā)揮治療作用提供了參考依據(jù)，也為后續(xù)進(jìn)一步研究菟絲子主要有效部位提取物的藥效作用奠定了基礎(chǔ)，但因?yàn)闀r(shí)間所限，本研究?jī)H觀(guān)察了菟絲子提取物對(duì)CTB細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并未設(shè)置對(duì)照細(xì)胞作為參考，課題組成員后續(xù)進(jìn)一步研究了減味壽胎丸及其有效成含藥血清對(duì)人早孕蛻膜細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示減味壽胎丸及有效成分可不同程度抑制人早孕蛻膜凋亡[17]。提示該復(fù)方及其有效成分可能通過(guò)對(duì)CTB細(xì)胞及蛻膜細(xì)胞增殖凋亡同時(shí)產(chǎn)生影響而發(fā)揮補(bǔ)腎安胎藥效，在此基礎(chǔ)上目前本課題組在進(jìn)一步深入研究減味壽胎丸含藥血清對(duì)CTB細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白因子表達(dá)的影響，相關(guān)研究結(jié)果待進(jìn)一步分析總結(jié)后發(fā)表。

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(編校：王儼儼)

Effects of different extraction serum of semen cuscutae on cell proliferation and apoptosis of cytotrophoblast(CTB)cells

LIU Xin-yu1Δ, LIU Yu-lei1, LUO Song-ping2

(1. Department of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital Affiliated to Southern Medical University, Shenzhen 518038, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)

ObjectiveTo observe the effects of serum of the different semen cuscuta extraction on proliferation and apoptosis of cytotrophoblast(CTB)cells.MethodsThe female SD rats were randomly divided into 8 groups, 5 rats in each group, including blank control group, Shoutaiwanjianwei group, high and low dose of semen cuscuta total extract, high and low dose of semen cuscuta general flavones, high and low dose of semen cuscuta total polysaccharides, the rats in each group were administrated with corresponding drugs by gavage, twice daily, after consecutive treatment of 3 days, the blood samples were collected from abdominal aorta, then serum was separated.CTB cells were cultivated with serum of above blank control and different extracts at different volume(5%, 10%and 20%), the cell proliferation was detected by MTT and cell cycle was analysed by flow cytometry.ResultsMTT results showed,after treated with the high and low dose of drug containing serum for 48 hours, the optical density accelerated in a certain degree, the 5%, 10%and 20%of each group were significantly different from that of blank control group(P<0.05 orP<0.01)except for 5%high dose of semen cuscuta total extract and 5%low dose of semen cuscuta total polysaccharides.The proliferation increased with the concentration of serum dosage in an obvious dosage dependent tendency.The flow cytometry results showed, the percentage of S-phase were obviously accelerated than the blank group(P<0.05 or <0.01), while the percentage of G2/M phase were obviously reduced compared with blank group(P<0.05 or <0.01).Changes of 48h’s treatment were accordance with the 24 h’s with the more significant change.ConclusionHigh and low dose of serum semen cuscuta extracts could increase the proliferative activity of the CTB cells and reduce the apoptosis of the cells, the best ones are the low dose of semen cuscuta total extract, high dose of general flavones, high dose of total polysaccharides respectively.

semen cuscutae; cytotrophoblast; total extract; total flavonoids; total polysaccharides

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81273795)；廣東省中醫(yī)藥局“建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省”科研項(xiàng)目(20152058)；廣東省建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目([2015]102號(hào))

劉新玉，通信作者，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：自然流產(chǎn)的中醫(yī)藥防治，E-mail：liuxinyu0611@163.com。

R285

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.12