李曉暉，王燕云，田甜，汪晴Δ

(1.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學(xué) 制藥科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024)

促滲肽協(xié)同抗癌藥物作用于腫瘤細(xì)胞的生物活性評價

李曉暉1，王燕云1，田甜2，汪晴2Δ

(1.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學(xué) 制藥科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024)

目的 探討促滲肽TD-34協(xié)同抗癌藥對幾種腫瘤細(xì)胞活性的影響。方法 采用多肽固相合成法合成促滲肽TD-34，分別與抗癌藥物鹽酸阿霉素(DOX·HCl)和甲氨蝶呤(MTX)形成混合物，MTT法檢測細(xì)胞毒性，倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀定性和定量考察細(xì)胞對藥物的吸收及保留情況。結(jié)果 與單獨給藥相比，TD-34與DOX·HCl混合處理后，MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)的細(xì)胞存活率由67.0%下降為21.5%，細(xì)胞吸收增加了26.7%，24 h后的吸收強度仍有50.4%；Caco-2(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞)的細(xì)胞存活率為48.5%，細(xì)胞吸收提高了8.6%，24 h后的吸收強度仍有44.0%。TD-34與MTX混合處理后，非抗性細(xì)胞系MCF-7以及抗性細(xì)胞系MDA-MB-231(人乳腺癌細(xì)胞)的細(xì)胞存活率分別由65.6%降為37.8%、96.0%降為48.3%，Caco-2的細(xì)胞存活率下降了30.0%以上。結(jié)論 促滲肽TD-34可增強藥物對細(xì)胞的毒性，克服癌細(xì)胞的耐藥性，增加藥物的細(xì)胞吸收和保留時間，是抗癌藥的有效促滲劑。

促滲肽；固相合成；耐藥性

一般的抗癌藥物由于靶向性差、藥效低、易產(chǎn)生耐藥性等問題達(dá)不到理想的治療效果，為了解決這些問題，設(shè)計和報道了很多輸送藥物系統(tǒng)[1-2]。促滲肽作為生物類促滲劑，是一類少于30個氨基酸殘基的短肽，能攜帶多肽、蛋白質(zhì)、核酸、納米顆粒以及其他生物活性分子穿透細(xì)胞膜或皮膚，發(fā)揮生物學(xué)作用[3]。因其具有入胞速度快，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，生理狀態(tài)下穩(wěn)定、無毒、無免疫性等優(yōu)勢，為藥物輸送開辟了一條嶄新途徑，在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療以及藥學(xué)等領(lǐng)域具有一定研究價值[4]。促滲肽與藥物作用的方式主要有物理混合[5]、共價連接[6]、形成融合蛋白[7]和修飾藥物載體[8]等。

促滲肽TD-1(ACSSSPSKHCG)是具有11個氨基酸殘基的環(huán)肽，能夠攜帶大分子胰島素通過透皮給藥方式來降低體內(nèi)血糖濃度，從而達(dá)到治療糖尿病的效果[9]，還有研究證明TD-1能幫助siRNA[10]、A型肉毒神經(jīng)毒素[11](BoNT-A)完成透皮作用。本課題組之前以TD-1為模板設(shè)計合成的TD-34(ACSSKKSKHCG)，表現(xiàn)出更好的跨膜轉(zhuǎn)運和經(jīng)皮促滲活性[12]。TD-34作為透皮肽，主要用于經(jīng)皮給藥研究，本文旨在探討 TD-34 的細(xì)胞促滲活性。

鹽酸阿霉素(Doxorubicin hydrochlorid，DOX·HCl)和甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)是目前臨床上常用的2種抗癌藥物，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1，因其不良反應(yīng)大、口服吸收差以及耐藥性的產(chǎn)生限制了他們的臨床應(yīng)用，耐藥性的產(chǎn)生主要是由藥物入胞減少或細(xì)胞的主動外排導(dǎo)致的[13]，因此，克服鹽酸阿霉素和甲氨蝶呤的耐藥性，促進其細(xì)胞吸收，胞內(nèi)積累及保留對腫瘤的治療具有重要意義。

圖1 鹽酸阿霉素和甲氨蝶呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of doxorubicin hydrochloride and methotrexate

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231，人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2來自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 實驗試劑：Wang樹脂、保護氨基酸、縮合試劑HOBt、 HBTU 、DIEA、BOP、DCC、DMAP(上海吉爾生化有限公司)；Sephadex LH-20(Amersham瑞士公司)； DMEM、胰蛋白酶、雙抗、優(yōu)級胎牛血清(美國Hyclone公司)；MTT(美國Amresco公司)；鹽酸阿霉素DOX·HCl(大連美侖生物有限公司)；甲氨蝶呤MTX(上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司)；色譜純試劑(美國TEDIA公司)；分析純試劑(天津科密歐化學(xué)試劑公司)。

1.1.3 實驗儀器：Waters 2487型雙波長檢測高效液相色譜儀(美國Waters公司)；電噴霧電離質(zhì)譜儀器(美國惠普公司)；冷凍干燥機(美國Labcono公司)；低溫離心機(德國賽默飛世爾儀器有限公司)；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；XDS-IB倒置熒光顯微鏡(重慶光電光學(xué)儀器有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Heraeus公司)；SpectraMax Plus 384酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 促滲肽的合成

① Fmoc-Gly-OH導(dǎo)入Wang樹脂： Wang 樹脂溶脹30 min后加入Fmoc-Gly-OH(1 eq)、DCC(3 eq)、DMAP(0.5 eq)，常溫攪拌15 h，得到Fmoc-Gly-Wang樹脂。

② 促滲肽合成：加入20%哌啶/DMF，室溫攪拌30 min，脫除Fmoc保護基后，加入Fmoc-AA-OH(3 eq)、HOBt(3 eq)和HBTU(3 eq)溶于DMF中，加入DIEA(5 eq)，室溫下攪拌1 h，反應(yīng)由Kaiser法監(jiān)測，反應(yīng)重復(fù)進行直至合成所需肽段，TFA裂解樹脂，得到直鏈肽段。采用碘氧化法形成二硫鍵，冷凍干燥得到TD-34粗產(chǎn)品。用Sephadex LH-20 對粗肽進行純化，洗脫液為DMF，HPLC分析，冰乙醚沉淀，真空干燥。

③ 結(jié)構(gòu)分析：用RP-HPLC分析促滲肽的純度，色譜柱為Chromolith RP-18e (5 μm, 250 mm×4.6 mm)，流動相A：0.1%TFA/水，流動相B：0.1%TFA/乙腈，洗脫梯度B為10%～100%15 min，流速為1 mL/min，檢測波長為220 nm，進樣量為10 μL。用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)檢測產(chǎn)物相對分子量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：MCF-7、MDA-MB-231培養(yǎng)在含有10% 胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；Caco-2細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%非必須氨基酸、2 mmol/L谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每周更換3次培養(yǎng)基，細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底約80%后，按1:3進行傳代。

1.2.3 MTT法檢測抗腫瘤活性：抗腫瘤活性的檢測選擇MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)，MDA-MB-231(人乳腺癌細(xì)胞)和Caco-2(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞)3種細(xì)胞系。取對數(shù)期細(xì)胞，以1×104個/孔的密度接種于96孔板，過夜培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁，去除完全培養(yǎng)基，替換為含不同藥物濃度的無血清培養(yǎng)基，每孔加200 μL，每個濃度重復(fù)3次。培養(yǎng)箱中孵育24 h，加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h。去除MTT，加200 μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測570 nm OD值，計算存活率。

1.2.4 定性檢測細(xì)胞吸收：取對數(shù)生長期 MCF-7、Caco-2細(xì)胞，以密度為1×105個/孔接種于12孔板，每孔加完全培養(yǎng)基1 mL，過夜培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁，去除完全培養(yǎng)基，更換為含藥的新鮮培養(yǎng)基(DOX·HCl，DOX·HCl+TD-34)1 mL培養(yǎng)2 h后，用冷的PBS清洗3次。置于倒置熒光顯微鏡下，觀察DOX發(fā)出的紅色熒光的強弱，定性比較不同處理組細(xì)胞對DOX·HCl的攝取情況。

1.2.5 定量檢測細(xì)胞吸收：取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，以密度為1×106個/孔接種于6孔板，每孔加完全培養(yǎng)基2 mL。過夜培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁，去除完全培養(yǎng)基，更換為含藥的新鮮培養(yǎng)基(DOX·HCl，DOX·HCl+TD-34)1 mL培養(yǎng)2 h。用冷的 PBS 清洗2次。0.25%胰酶/0.53 mM EDTA消化1 min，800 r/min離心3 min，棄上清，PBS 清洗3次，200 μL PBS 懸浮細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測熒光吸收，激發(fā)波長為488 nm，吸收波長為575 nm。通過FlowJo軟件對數(shù)據(jù)進行整合，比較不同處理組的吸收強度。

2 結(jié)果

2.1 促滲肽合成 TD-34經(jīng)Sephadex LH-20分離純化后，反相高效液相色譜檢測純度為97%，保留時間為2.827 min，ESI-MS檢測[M+H]+為1133.4，與計算值1132.5一致，證明成功合成了目的物。

2.2 抗腫瘤活性檢測 MTT結(jié)果顯示促滲肽TD-34對腫瘤細(xì)胞無明顯毒性作用，TD-34與DOX·HCl混合給藥后，提高了DOX·HCl對MCF-7以及抗性細(xì)胞系模型Caco-2的細(xì)胞毒性，存活率分別由67.0%下降為21.5%，86.0%降為71.9%。TD-34與MTX混合給藥后提高了MTX對MCF-7以及抗性細(xì)胞系 MDA-MB-231 的細(xì)胞毒性，存活率分別由65.6%下降為37.8%，96.0%降為48.3%，且對抗性細(xì)胞的作用效果更明顯。見表1。

表1 腫瘤細(xì)胞存活率的比較

*P<0.05，**P<0.01，與單獨藥物處理組比較，compared with doxorubicin or methotrexate alone；-：未處理組，untreated group

2.3 不同摩爾比的混合物對Caco-2細(xì)胞活性的影響 從表1可以看出，混合處理后，Caco-2的細(xì)胞活性下降不如其他組腫瘤細(xì)胞明顯，與單獨藥物處理相比，細(xì)胞存活率只下降了15%左右。改變混合物中藥物和促滲肽的濃度，考察不同摩爾比的混合物處理后Caco-2的細(xì)胞活性。

結(jié)果如圖2所示：DOX·HCl對Caco-2幾乎無毒性作用，即使將DOX·HCl的濃度提高到100 μM，細(xì)胞存活率仍在80%以上，說明以Caco-2作為DOX·HCl的抗性細(xì)胞系模型是可行的。當(dāng)混入TD-34后，毒性有所提高，細(xì)胞存活率最低可達(dá)到48.3%，同樣地，MTX對Caco-2的抑制率只有19.0%，當(dāng)MTX為10 μM時，混入TD-34后，細(xì)胞存活率下降了10%～20%；但當(dāng)MTX為100 μM時，細(xì)胞存活率顯著下降了30%以上。表明對于Caco-2細(xì)胞，TD-34對MTX的促滲作用較DOX·HCl更明顯，且加入低濃度的TD-34就可起到促滲作用。

圖2 不同摩爾比混合物處理后的Caco-2細(xì)胞活性(n=3)Fig.2 Viability of Caco-2 cells which were treated with mixtures in different mixture ratio(n=3)

2.4 DOX·HCl及混合物細(xì)胞攝取定性分析 結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞對照組無紅色熒光，與DOX·HCl處理組相比，混合物組處理2 h后熒光較強且主要分布在細(xì)胞膜周圍，說明TD-34促進了DOX·HCl的細(xì)胞吸收，且主要通過與細(xì)胞膜的相互作用完成促滲。處理24 h后，DOX·HCl處理組幾乎觀察不到熒光，混合物處理組仍能觀察到紅色熒光，說明混入TD-34后DOX·HCl的保留性較單獨使用DOX·HCl有所增強。見圖3。

圖3 DOX·HCl及混合物不同處理時間下的MCF-7細(xì)胞攝取結(jié)果(×250)Fig.3 Fluorescent images of cellular uptake in MCF-7 with DOX·HCl and mixtures in different times(×250)

2.5 DOX·HCl及混合物對Caco-2細(xì)胞的影響 與DOX·HCl處理組比較，混合物處理組隨著處理時間的延長，細(xì)胞單層膜的完整性逐漸被破壞，粗糙程度逐漸增加(見圖4)。證明 TD-34 有可能打開Caco-2細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)，通過旁路途徑促進藥物吸收。

圖4 DOX·HCl及混合物不同處理時間下MCF-7細(xì)胞顯微圖片(×250)Fig.4 Micrograph of Caco-2 cells which were treated with DOX·HCl and mixtures in different times(×250)

2.6 細(xì)胞吸收定量分析 利用流式細(xì)胞儀對DOX·HCl的細(xì)胞吸收進行定量分析。研究結(jié)果與2.5研究結(jié)果一致，MCF-7細(xì)胞處理2 h后，混合物處理組較DOX·HCl處理組的熒光強度上升了26.7%，處理24 h后，DOX·HCl處理組幾乎沒有熒光吸收，而混合物處理組的熒光吸收仍有50.4%；Caco-2細(xì)胞處理2 h 后，混合物處理組較DOX·HCl處理組的熒光強度上升了8.6%，24 h后，DOX·HCl處理組的熒光吸收明顯降低，而混合物處理組的熒光強度仍有44.0%，再次證明了TD-34可促進DOX·HCl的細(xì)胞吸收及延長保留時間。見圖5。

圖5 流式細(xì)胞法測定MCF-7、Caco-2對DOX·HCl及混合物的細(xì)胞吸收Fig.5 Cellular uptake of DOX·HCl and mixtures in MCF-7 and Caco-2 cells by Flow Cytometry

3 討論

目前常用的抗癌藥物如氟尿類、阿霉素、氨甲喋呤、喜樹堿、姜黃素等，在治療過程中通常存在毒性大、輸送效率低、易產(chǎn)生抗藥性、靶向性差等缺點[14]，促滲肽與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)促滲方法相比，具有生物相容性良好、輸送效率高等優(yōu)點，開發(fā)有效的促滲肽，尋求高效的藥物輸送體系是提高藥效、增加給藥途徑、克服抗藥性的有效途徑，對解決抗癌藥現(xiàn)存的一些問題具有重大意義。

本研究選擇Caco-2作為DOX·HCl的抗性細(xì)胞模型，考察DOX·HCl及不同摩爾比的混合物對Caco-2的細(xì)胞毒性、形態(tài)變化及細(xì)胞攝取與保留的影響，并與非抗性細(xì)胞系MCF-7比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TD-34可以提高DOX·HCl的藥效，增加藥物的細(xì)胞吸收和保留時間。其促滲機理可能是TD-34的陽離子電荷與細(xì)胞表面的陰離子成分發(fā)生靜電相互作用，從而增加藥物與細(xì)胞膜的相互作用，促進其滲透細(xì)胞膜。此外，TD-34可打開Caco-2細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞單層膜的完整性，打開其旁路通道。

MTX多藥抗性主要是由于多聚谷氨酸水平下降以及介導(dǎo)甲氨喋呤吸收的還原型葉酸載體(reduced folate carrier，RFC)的表達(dá)量下降或其結(jié)構(gòu)改變所引起的[17]。人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231是一種抗甲氨喋呤的癌細(xì)胞，其耐藥的產(chǎn)生主要是由于RFC的表達(dá)量下降而導(dǎo)致的，而RFC主要介導(dǎo)MTX進入細(xì)胞[18]。

因此，本研究選擇了MTX與TD-34進行混合，通過比較混合物與單獨藥物在MCF-7、Caco-2、MDA-MB-231三種細(xì)胞系中的細(xì)胞活性差異，發(fā)現(xiàn)TD-34提高了MTX對抗性細(xì)胞系MDA-MB-231的細(xì)胞毒性，且較其他2種細(xì)胞系毒性作用更加顯著。

綜上所述，TD-34可以作為藥物的促滲劑，為藥物的胞內(nèi)輸送和耐藥性的克服方面開辟了新途徑。

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(編校：吳茜)

Biological activity evaluation of penetrating peptide enhances cytotoxicity of anti-cancer drugs to cancer cell

LI Xiao-hui1, WAMG Yan-yun1, TIAN Tian2, WANG Qing2Δ

(1.School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China;2.School of Pharmaceutical Science and Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China)

ObjectiveTo investigate the effect of penetration peptide TD-34 combined with anti-cancer drugs on cancer cell cytotoxicity.MethodsPenetration TD-34 was synthesized by solid-phase synthesis method, forming mixtures with two anti-cancer drugs, DOX·HCl and MTX. Cytotoxicity was tested by MTT method. Qualitative and quantitative study of cell uptake and retention were detected by inverted fluorescence microscopy and flow cytometry, respectively. ResultsCompared with drug treated alone, in TD-34 and DOX·HCl’s mixtures treated group, cell viability rate decreased from 67.0%to 21.5% of MCF-7, increase 26.7% in cellular uptake, absorption intensity was still 50.4% after 24 h; cell viability rate of Caco-2 was 48.5%, cellular uptake increased 8.6%, absorption intensity was still 44% after 24 h; in TD-34 and MTX’s mixtures treated group, cell viability decreased from 65.6% to 37.8%of MCF-7 and 96.0% to 48.3% of resistance cell line MDA-MB-231, respectively; cell viability decreased by more than 30% of Caco-2. ConclusionPenetration peptides TD-34 can enhance cytotoxic of drugs, overcome resistance of cancer cells, increase cellular uptake and retention time of drugs, can be used as an effective anticancer drug penetration enhancers.

penetration peptide;solid-phase synthesis;drug resistance

李曉暉，女，博士，副教授，研究方向：多肽藥物化學(xué)，E-mail：lxhxh@dlut.edu.cn；汪晴，通信作者，男，博士，教授，研究方向：生物大分子經(jīng)皮/跨膜給藥系統(tǒng)研究；功能性材料及緩控釋給藥系統(tǒng)的研究；經(jīng)皮給藥計算機模擬與PK/PD相關(guān)性研究；藥品和化妝品研究開發(fā)，E-mail：qwang@dlut.edu.cn。

R966

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.04