王艷秋，武君穎, 李愛華

(1.沈陽市中醫(yī)藥學校中藥教研室，遼寧 沈陽　110300； 2.沈陽飛龍制藥有限公司質量管理部，遼寧 沈陽　110000)

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高效液相色譜法測定齒葉白鵑梅葉中3種黃酮苷元的含量

王艷秋1*，武君穎1, 李愛華2

(1.沈陽市中醫(yī)藥學校中藥教研室，遼寧 沈陽110300； 2.沈陽飛龍制藥有限公司質量管理部，遼寧 沈陽110000)

摘要目的：建立齒葉白鵑梅葉中芹菜素、槲皮素和木犀草素3種黃酮苷元的含量測定方法。方法：采用酸水解法進行水解，對影響酸水解的主要因素酸濃度、水解溫度和水解時間進行考察；采用高效液相色譜進行含量測定，色譜柱為Promosil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相為乙腈-2%冰乙酸(V ∶V=20 ∶80)，柱溫25 ℃，進樣量10 μl，流速1.0 ml/min，檢測波長267 nm。結果：酸水解條件為：鹽酸-甲醇濃度為4.0 mol/L，水解溫度為80 ℃，水解時間為5 h；含量測定中木犀草素、槲皮素和芹菜素的進樣量分別在0.82～8.20、0.869 6～8.696 0和0.777 6～7.776 0 μg范圍內具有良好的線性關系；平均加樣回收率分別為95.8%、97.1%、99.6%。含量測定方法的精密度、穩(wěn)定性、重復性也均符合有關規(guī)定。結論：本研究建立的水解方法和含量測定方法準確、可靠，可用于齒葉白鵑梅葉的質量控制。

關鍵詞齒葉白鵑梅； 黃酮苷元； 含量測定

齒葉白鵑梅(ExochordaserratifoliaS. Moore.)，來源于薔薇科繡線菊亞科白鵑梅屬[1]，在遼寧凌源、喀左一帶，民間多將其嫩葉作為野菜食用，用后有預防和治療糖尿病的功效。研究者等對其進行化學成分的分離和結構鑒定[2-5]。藥理研究結果也證明，齒葉白鵑梅葉確有降血糖和改善小鼠耐糖量的作用[6-8]。含量測定方面有總黃酮的含量以及黃酮單體含量的報道[9-11]。本研究采用酸水解法對齒葉白鵑梅葉中存在的黃酮苷進行水解，采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)建立水解后的3種苷元，即芹菜素、木犀草素和槲皮素的含量測定方法，為更好地控制齒葉白鵑梅的質量奠定基礎。

Agilent 1100 Series型高效液相色譜儀(包括真空脫氣機、四元泵、柱溫箱、VWD、HP1100化學工作站)(美國安捷倫科技有限公司)；CP225D型電子天平(Sartorius，十萬分之一)。

1.2藥品與試劑

齒葉白鵑梅葉采自遼寧省朝陽市凌源縣，共3個批次，分別為樣品1、樣品2和樣品3。經遼寧中醫(yī)藥大學王冰教授鑒定為ExochordaserratifoliaS. Moore.；木犀草素、槲皮素、芹菜素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：20120206、 20120213、 20120314)；水為超純水；甲醇、乙腈(天津科密歐試劑有限公司，色譜純)，其他試劑均為分析純。

色譜柱：Promosil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：乙腈-2%冰乙酸(V∶V=20 ∶80)；柱溫25 ℃；進樣量10 μl，流速1.0 ml/min；檢測波長267 nm。

2.2對照品溶液的制備

精密稱取木犀草素10.25 mg、槲皮素10.87 mg、芹菜素9.72 mg，甲醇定容至25 ml，搖勻，即得3種對照品溶液，濃度分別為0.410 0、0.434 8、0.388 8 mg/ml，即得。

2.3供試品溶液的制備

2.3.1水解時間的考察：取齒葉白鵑梅葉粉末1.0 g，共4份，精密稱定，水解溫度為80 ℃，鹽酸濃度為5.0 mol/L，分別水解3、4、5、6 h，用HPLC檢測，計算3種苷元的含量[12-14]。結果表明水解5 h和水解6 h時3種苷元的含量明顯高于水解其他水解時間，而水解5 h和水解6 h時的含量差別不大，故水解時間確定為5 h。

2.3.2水解時酸濃度的考察：取齒葉白鵑梅葉粉末1.0 g，共四份，精密稱定，水解溫度80 ℃，水解時間為5 h，鹽酸濃度分別為2.0、3.0、4.0、5.0 mol/L，用HPLC檢測，計算3種苷元的含量[12-14]。結果表明鹽酸濃度為4.0 mol/L水解效果最好。

2.3.3水解溫度的考察：取齒葉白鵑梅葉粉末1.0 g，共4份，精密稱定，鹽酸濃度為4.0 mol/L，溫度分別為60、70、80、90 ℃，水解5 h，用HPLC檢測，計算3種苷元的含量[12-14]。結果表明水解溫度為70 ℃水解效果最好。

綜上所述，供試品溶液的制備方法為：精密稱取齒葉白鵑梅葉粉末1.0 g，精密稱定，加入4.0 mol/L鹽酸-甲醇溶液50 ml，于80 ℃的水浴中反應5 h，冷卻后過濾，用甲醇定容至50 ml，過0.45 μm濾膜，即得。水解液和對照品溶液的色譜圖見圖1。

圖1　水解液(A)、木犀草素(B)、槲皮素(C)和芹菜素(D)HPLC圖Fig 1　HPLC of hydrolysate(A), luteolin(B), quercetin (C) and apigenin(D)

2.4線性范圍考察

取上述3種對照品溶液，分別進樣2、4、6、8、10、20 μl，經HPLC檢測后，分別以進樣量為橫坐標，吸收峰面積為縱坐標，得木犀草素的回歸方程為：Y=17 010X+68.714，r=0.999 0，表明木犀草素在0.82～8.20 μg范圍內具有良好的線性關系；槲皮素的回歸方程為：Y=26 989X+199.10，r=0.999 1，表明槲皮素在0.869 6～8.696 0 μg范圍內具有良好的線性關系；芹菜素的回歸方程為：Y=31 876X+501.09，r=0.999 3，表明芹菜素在0.777 6～7.776 0 μg范圍內具有良好的線性關系。

2.5精密度試驗

取各對照品溶液，分別連續(xù)進樣6次，以峰面積計算RSD值。結果，木犀草素、槲皮素、芹菜素的RSD值均<3.0%，符合有關規(guī)定。

2.6穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、16、24 h進樣，測定木犀草素、槲皮素、芹菜素的峰面積，RSD值均<3.0%，符合有關規(guī)定。

2.7重復性試驗

取同一批樣品6份，每份1 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，進樣，測定峰面積，計算木犀草素、槲皮素、芹菜素的含量，平均值分別為1.08%、0.91%和3.25%，RSD值均<3.0%，符合有關規(guī)定。

2.8加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品6份，分別精密加入3種對照品溶液，測定含量，并計算回收率。結果，木犀草素、槲皮素、芹菜素的平均加樣回收率分別為95.8%、97.1%、99.6%，RSD值均<3.0%。

2.9樣品測定結果

按上述方法測定3個批次齒葉白鵑梅葉中木犀草素、槲皮素和芹菜素的含量，每個樣品平行2例，見表1。

表1　齒葉白鵑梅葉中3種黃酮苷元的含量測定結果(%)

本研究通過對齒葉白鵑梅葉酸水解條件進行考察，主要考察了對酸水解影響較大的酸濃度、水解溫度和水解時間3個影響因素，以3種苷元的含量作為考察指標，最終確定了將齒葉白鵑梅葉中含有的黃酮苷水解為苷元的最佳工藝為齒葉白鵑梅葉粉末1.0 g，加入4.0 mol/L鹽酸-甲醇溶液50 ml，于80 ℃的水浴中反應5 h。

本研究采用HPLC建立了齒葉白鵑梅水解葉中木犀草素、槲皮素和芹菜素這三種苷元的含量測定方法，確定色譜條件為C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相為乙腈-2%冰乙酸(V∶V=20 ∶80)，柱溫設置在25 ℃，檢測波長設為267 nm。還對包括線性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重復性和加樣回收率在內的方法學進行了考察，最終建立的含量測定方法可用于齒葉白鵑梅葉的質量控制。

參考文獻

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Content Determination of Three Flavonoid Aglycones in Leaves ofExochordaserratifoliaS. Moore. By HPLC

WANG Yanqiu1, WU Junying1, Li Aihua2

(1.Traditional Chinese medicine teaching and research section, Shenyang Traditional Chinese Medicine School Shenyang, Liaoning Shenyang 110300, China; 2.Dept.of Quality Control, Shenyang Green Pharmaceutical co. LTD, Liaoning Shenyang 110000, China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish the content determination method of apigenin, quercetin and luteolin in the leaves of Exochorda serratifolia S. Moore.. METHODS: Acid hydrolyzation was adopted, and the acid concentration, hydrolysis temperature, hydrolysis time were investigated and contents of the flavonoid aglycones were determined by HPLC. The Promosil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)column was adopted, the mobile phase was consisted of acetonitrile-2% glacial acetic acid(V ∶V=20 ∶80), the column temperature was 25 at sample size of 10 μl and flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was set at 267 nm. RESULTS: The conditions of acid hydrolysis were: concentration of hydrochloric acid at 4.0 mol/L with temperature at 80℃, for 5 h. The calibration curves were linear in the range of 0.82-8.20, 0.869 6-8.696 0 μg and 0.777 6-7.776 0 μg. The average recovery rates were 95.8%，97.1% and 99.6%, respectively. The precision, stability and repeatability of content determination conform to the related regulations. CONCLUSIONS: This method is accurate and reliable and can be used for the quality control of leaves of Exochorda serratifolia S. Moore..

KEYWORDSExochorda serratifolia S. Moore; Flavonoid aglycones; Content determination

1材料

1.1儀器

2方法與結果

2.1色譜條件

3討論

中圖分類號R927.2

文獻標志碼A

文章編號1672-2124(2016)06-0796-03

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.06.028

(收稿日期：2016-01-06)

*高級講師。研究方向：藥物分析與質量研究及其相關教學。E-mail：980292565@qq.com

*副主任藥師。研究方向：藥品的質量控制和分析。E-mail:122502654@qq.com