米 萱,孫 峰,仇利紅,石 定,余 州,楊 力

?

血管瘤及脈管畸形

自噬相關蛋白Atg5和LC3在嬰幼兒血管瘤中的表達

米 萱,孫 峰,仇利紅,石 定,余 州,楊 力

目的 研究自噬相關蛋白在嬰幼兒血管瘤中的表達，初探自噬在嬰幼兒血管瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)判斷其瘤體處于增殖期還是消退期；將石蠟包埋的嬰幼兒血管瘤(IH)標本經(jīng)HE染色后，于光學顯微鏡下觀察不同時期IH內(nèi)血管內(nèi)皮細胞的增生程度、形態(tài)；切片經(jīng)TUNEL 法染色后，根據(jù)標記凋亡細胞計數(shù)比較不同時期IH凋亡率差異；免疫組化染色觀察不同時期IH中Atg5的表達水平差異；免疫熒光標記法分析不同時期IH中LC3-Ⅱ的表達水平變化。結果 Tunel凋亡檢測顯示,消退期IH細胞凋亡率明顯高于增殖期IH(P<0.01)；免疫組化結果顯示,增殖期IH中Atg5的表達水平高于消退期IH(P<0.01)；免疫熒光顯示增殖期IH中的LC3-Ⅱ陽性細胞多于消退期IH。結論 消退期IH凋亡細胞比增殖期明顯增多；增殖期自噬活性較強，消退期自噬下調；自噬的下調有可能促進增殖期IH向消退期轉化。

嬰幼兒血管瘤； 凋亡； 自噬； 增殖期； 消退期； Atg5； LC3-Ⅱ; 自噬相關蛋白

嬰幼兒血管瘤(infantile hemangioma，IH)是主要由血管內(nèi)皮細胞構成的良性腫瘤，目前對于IH與自噬相關關系的研究仍較少。本研究進行血管瘤組織標本的相關檢測和分析，探討不同時期血管瘤的自噬情況，推測自噬在血管瘤發(fā)展進程中的相關作用及意義。

1 對象與方法

1.1 標本組織來源

收集自2014年 1 月至2015 年8月于西京醫(yī)院全軍整形外科研究所行手術切除并經(jīng)病理確診的7例血管瘤患者組織。男性3例，女性4例；年齡6個月至1.5歲。本研究符合第四軍醫(yī)大學醫(yī)學倫理會標準并獲得患兒父母的知情同意。

1.2 血管瘤分期標準

根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)判定其瘤體處于增殖期還是消退期。增殖期血管瘤特征：血管瘤開始出現(xiàn)并伴瘤體增大、色澤較深；消退期血管瘤特征：瘤體縮小或瘤體大小不變，但出現(xiàn)退色或張力降低。并結合HE染色結果綜合判斷。本組7例標本中，增殖期4例，消退期3例。

1.3 主要試劑

抗人多克隆抗體Atg5(SANTA CRUZ公司，美國)；LC3-Ⅱ抗體(CST公司，美國)；免疫組化試劑盒(上海明睿生物技術有限公司)；生物素化山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記驢抗山羊IgG、辣根酶標記鏈酶親合素、Cy3標記山羊抗兔IgG、DAPI(碧云天公司，美國)。

1.4 主要儀器

正置顯微鏡、熒光顯微鏡BX53、顯微鏡DP73(OLYMPUS公司，日本)；石蠟包埋機EG-1160、切片機、烘片機(LEICA公司，德國)。

1.5 方法

1.5.1 HE染色 將石蠟包埋的新鮮血管瘤標本切片，厚度為5 mm，HE染色，常規(guī)脫蠟、經(jīng)HE染后的切片依次浸入75%、85%、95%的乙醇中，每級停留2 min，脫水、透明，滴加半滴中性樹膠，蓋上蓋玻片封片，室溫晾干。光學顯微鏡下觀察不同時期血管瘤內(nèi)血管內(nèi)皮細胞的增生程度、形態(tài)及管腔大小、血管數(shù)量、間質纖維細胞的增生程度等。

1.5.2 TUNEL檢測 標本蠟塊切成5 μm的薄片，切片脫蠟至水，透化，滴加3%H2O250 μl封閉，滴加TUNEL反應液(Enzyme solution及Label Solution按1∶9配制;即用即配，冰上操作)50 μl，保濕、避光、37℃孵育60 min。滴加Converter-POD 50 μl。保濕、37℃孵育30 min。加DAB底物50 μl，待顏色剛剛變深時迅速置于水中終止反應。蘇木素復染，浸入1%鹽酸乙醇中分化3 s，立即浸入自來水中，流水反藍20 min。 脫水、透明、封片,反藍后的切片依次浸入75 %、85 %、95 %的乙醇中，每個停留2 min，瀝干殘液，浸入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ，二甲苯Ⅰ、Ⅱ中，分別浸泡10 min，取出切片，擦干周圍液體，膠頭滴管滴加半滴中性樹膠，蓋上蓋玻片。低倍顯微鏡下觀察染色情況，選取陽性細胞豐富的視野，高倍鏡下拍照。

1.5.3 免疫組化(Atg5) 切片脫蠟、至水，抗原修復，過氧化氫孵育，滴加正常山羊(與二抗同一種屬)血清封閉，室溫孵育15 min，棄去血清，一抗孵育，將Atg5用PBS按1∶50稀釋，滴加至完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)4℃過夜。浸泡在PBS中5 min，重復3次。二抗孵育，二抗用PBS稀釋200倍，濕盒內(nèi)37℃孵育30 min，浸泡在PBS中5 min，重復3次。辣根酶標記，37℃孵育30 min。取出切片，擺放在切片架上，浸泡在PBS中5 min，重復3次。DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察染色效果。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行光密度分析，統(tǒng)計不同時期IH平均光密度(平均IOD值)。

1.5.4 免疫熒光(LC3-Ⅱ) 切片脫蠟、至水步驟同前。將切片置于煮沸的抗原修復液中，低火修復10 min。將切片置于PBS中5 min，3次。用免疫組化筆畫圈，滴加山羊血清，完全覆蓋組織，室溫、濕盒內(nèi)放置30 min。PBS中停留5 min，重復3次。滴加一抗(1∶200)孵育，滴加至完全覆蓋細胞，濕盒內(nèi)4℃過夜。浸泡在PBS中5 min，3次。滴加熒光二抗，用PBS稀釋200倍(以下操作避光)，室溫孵育1.5 h。將裝好切片的切片架浸泡于PBS中5 min，3次。滴DAPI復染核，將裝好切片的切片架浸泡于PBS中5 min，3次。滴加抗熒光淬滅劑，蓋玻片封片。熒光顯微鏡下觀察染色效果。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行分析，比較不同時期IH陽性細胞百分比情況。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 HE染色

增殖期血管瘤組織標本：血管內(nèi)皮細胞增生成團，間隔組織少，形成大小不等的變形管腔樣結構或血竇，大部分管徑微小，只有內(nèi)皮細胞包裹 (圖1a)。消退期血管瘤組織標本：內(nèi)皮細胞疏松，血管內(nèi)皮細胞呈單層或復層，基底膜增厚。間質纖維結締組織增多，脂肪組織增多。內(nèi)皮細胞團與纖維脂肪組織無明顯邊界(圖1b)。

2.2 TUNEL凋亡檢測

經(jīng)DAB顯色后，凋亡細胞即染色陽性的細胞，胞核呈棕色至棕褐色(圖2)；統(tǒng)計分析結果顯示，增殖期血管瘤凋亡指數(shù)為(4.97±0.89)%，消退期血管瘤凋亡指數(shù)為(15.56±1.78)%，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 免疫組化

Atg5在細胞膜及細胞漿中均有表達(圖3);光密度分析結果顯示，增殖期血管瘤樣本中Atg5的IOD值為0.0214±0.0016，消退期血管瘤樣本中Atg5的IOD值 為0.0150±0.0020，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4 免疫熒光

從圖4可見，LC3-Ⅱ用Cy3標記，呈明亮的紅色熒光，細胞核用DAPI襯染為藍色。LC3在胞漿中可見較為明顯的表達；在增殖期血管瘤中，LC3-Ⅱ表達陽性的細胞多于消退期血管瘤。

3 討論

1982年,JB Mulliken和J Glowack依據(jù)血管內(nèi)皮細胞的生物學特性,將先天性血管病變分為血管瘤和血管畸形。嬰幼兒血管瘤與其他脈管畸形的顯著區(qū)別是：前者具有以內(nèi)皮細胞增生為特征的增殖期,后者是胚胎血管發(fā)生過程中的結構異常。Kleiman等將血管瘤按病程分為3期:即增殖期(0～1歲)、消退期(1～5歲)和消退完成期(5～10歲),在臨床上可表現(xiàn)出3個序貫發(fā)生的階段[1]。至于消退期IH發(fā)生的原因以及IH如何從增殖期轉變到消退期，有研究者推測可能與凋亡相關。因為通過凋亡蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，消退期血管瘤的細胞凋亡水平是增殖期血管瘤的5倍[2]，且免疫組織化學染色提示凋亡的細胞為內(nèi)皮細胞。

圖1 HE染色(×200) a.增殖期 b.消退期 圖2 TUNEL染色(×400) a.增殖期 b.消退期 圖3 Atg5免疫組化染色(×400) a.增殖期 b.消退期 圖4 LC3-Ⅱ免疫熒光染色(×400) a.增殖期 b.消退期
Fig 1 HE staining (×200). a.proliferative phase. b.regression phase. Fig 2 TUNEL staining (×400). a.proliferative phase. b.regression phase. Fig 3 Immunohistochemistry stain of Atg5 (×400). a.proliferative phase. b.regression phase. Fig 4 Immunofluorescent staining of LC3-Ⅱ (×400). a.proliferative phase. b.regression phase.

通常自噬的發(fā)生包含4個階段：自噬體的誘導、延伸、閉合成熟及降解。 首先，在各種復雜的分子調控作用下誘導啟動自噬；接著內(nèi)質網(wǎng)來源的單層膜凹陷成杯狀雙層膜結構，包裹細胞內(nèi)受損的細胞器和其他廢物，進而由 LC3-Ⅱ和Atg12-Atg5-Atg16L復合體共同作用，延伸并閉合形成自噬體；接著與溶酶體融合降解其中的廢物，分解的氨基酸、脂肪酸及其他有用物質可回收再利用，為細胞的重建、再生和修復提供必需的原料。因此，自噬不僅可清除體內(nèi)的受損蛋白和細胞器，還可回收利用其中的廢物，從而為應激狀態(tài)下的細胞提供能量，是一種防止細胞死亡的保護性反應[3]。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，自噬與腫瘤、衰老、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和代謝疾病等密切相關。且在不同腫瘤或同一腫瘤的不同階段起著不同的作用。自噬對細胞的作用具有兩面性，既可以促進細胞生存，又可以誘導細胞死亡，主要取決于疾病進展的不同時期、細胞的微環(huán)境變化[4]。盡管大部分腫瘤細胞的自噬活性是降低的，但仍有一些腫瘤自噬活性較高，如大腸癌細胞、肺癌細胞及宮頸癌Hela細胞等。研究顯示，在缺乏血清的條件下培養(yǎng)Hela細胞3 h，自噬活性明顯上調。推測高水平的自噬對腫瘤細胞在惡劣環(huán)境下的生存起到保護性作用[5]。

最近武漢大學口腔醫(yī)學院的研究團隊發(fā)現(xiàn)，在IH 標本中有自噬相關蛋白Beclin1 和Atg5 的表達，即IH內(nèi)存在自噬活化，且增殖期血管瘤中自噬相關分子Beclin1與survivin共表達，體外實驗也發(fā)現(xiàn)短時間的缺氧培養(yǎng)可以誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬,自噬加快了細胞的生長增殖，推測在增殖期IH中，自噬促進了內(nèi)皮細胞的存活[6]。

Atg5作為關鍵性基因參與自噬過程，參與兩個泛素樣連接系統(tǒng)及自噬小體的產(chǎn)生[7]。LC3 (在酵母中即ATG8)，作為公認的自噬特異性標志物，其定位于前自噬泡或者自噬泡表面，與自噬體的形成密不可分。在自噬過程中，細胞質可溶型LC3-Ⅰ經(jīng)加工修飾，與自噬體膜上PE相聚合，產(chǎn)生LC3- Ⅱ[8]，其數(shù)量多寡與自噬體含量呈正線性相關關系。通過特異熒光抗體方式，與LC3相聯(lián)結聚合，自噬體熒光顯微鏡下為高亮熒光顆粒樣或者泡樣結構，可間接評估自噬情況。

本研究顯示，Atg5在增殖期血管瘤中的表達呈現(xiàn)強陽性，而在消退期血管瘤中的表達較弱，平均光密度值比較差異具有統(tǒng)計學意義。另外，免疫熒光檢測結果顯示，LC3-Ⅱ陽性細胞在消退期血管瘤標本中明顯少于增殖期血管瘤標本，這間接表明消退期血管瘤自噬體的形成減少。

本研究得出結論，消退期IH中凋亡細胞多于增殖期IH，增殖期IH細胞自噬活性高于消退期，推測自噬可能參與增殖期IH的內(nèi)皮細胞保護作用。其原因可能是由于增殖期血管瘤中內(nèi)皮細胞密度較大，生長速度快，細胞暴露于由高增殖率和供血不足所導致的缺氧環(huán)境，正如文獻所述，缺氧環(huán)境和雌激素為IH的發(fā)生、發(fā)展提供適宜的細胞外環(huán)境，導致嬰幼兒血管瘤的增殖[9]，自噬可以為在代謝性應激狀態(tài)中的細胞提供氨基酸、核苷酸等營養(yǎng)物質，加強細胞的存活能力；而自噬的下調有可能促進內(nèi)皮細胞啟動凋亡程序，引發(fā)IH由增殖期向消退期轉化。至于自噬活化及下調所涉及的具體分子機制及通路仍需下一步探索研究。由于我們的前期實驗標本較少，且僅靜態(tài)檢測了自噬相關蛋白的表達，關于目前開始倍受關注的自噬流檢測尚需收集更多標本加以完善和分析。

[1] Kleiman A,Keats EC,Chan NG,et al.Evolution of hemangioma endothelium[J].Exp Mol Pathol,2012,93(2):264-272.

[2] Razon MJ,Kraling BM,Mulliken JB,et al.Increased apoptosis coincides with onset of involution in infantile hemangioma[J].Microcirculation,1998,5(2-3):189-195.

[3] Mizushima N.Autophagy:process and function[J].Genes Dev,2007,21(22):2861-2873.

[4] Ogier-Denis E,Codogno P.Autophagy:a barrier or an adaptive response to cancer[J].Biochim Biophys Acta,2003,1603(2):113-128.

[5] Cuervo AM.Autophagy:in sickness and in health[J].Trends Cell Biol,2004,14(2):70-77.

[6] Chen G,Zhang W,Li YP,et al.Hypoxia-induced autophagy in endothelial cells:a double-edged sword in the progression of infantile haemangioma?[J].Cardiovasc Res,2013,98(3):437-448.

[7] Mizushima N,Kuma A,Kobayashi Y,et al.Mouse Apg16L,a novel WD-repeat protein,targets to the autophagic isolation membrane with the Apg12-Apg5 conjugate[J].J Cell Sci,2003,116(Pt 9):1679-1688.

[8] Chen Y,Azad MB,Gibson SB.Methods for detecting autophagy and determining autophagy-induced cell death[J].Can J Physiol Pharmacol,2010,88(3):285-295.

[9] Chang EI,Chang EI,Thangarajah H,et al.Hypoxia,hormones,and endothelial progenitor cells in hemangioma[J].Lymphat Res Biol,2007,5(4):237-243.

Expression of autophagy-related proteins(Atg5 and LC3)in infantile hemangioma

MIXuan,SUNFeng,QIULi-hong,SHIDing,YUZhou,YANGLi.

(InstituteofPlasticSurgery,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

Objective To study the expression of autophagy-related proteins in infantile hemangioma (IH) and explore the role of autophagy in the occurrence and development of IH.Methods According to the clinical manifestations of children,tumors in the proliferative phase or regression phase were identified.Specimens were embedded in paraffin and then were observed under a light microscope after HE staining.The degree of hyperplasia and morphology of vascular endothelial cells were observed at different periods in IH.After TUNEL staining,slices labeled according to apoptotic cell counts were compared between the IH at different periods to determine differences in apoptotic rate.The difference in ATG5 expression and the changes in LC3-Ⅱ expression between the IH at different periods were observed by IHC and immunofluorescence analysis,respectively.Results Measurement by TUNEL method demonstrated that the IH apoptosis rate in the regression phase was significantly higher than that in the proliferative phase (P<0.01).Immunohistochemistry showed that the expression level of ATG5 in the proliferative phase was higher than that in the regression phase (P<0.01).Immunofluorescence demonstrated that the positive expression of LC3-Ⅱ in the IH of the proliferative phase was higher than that in the regression phase in the proliferating IH group.Conclusion Apoptotic cells increased significantly in the regression phase over those of the proliferative phase.Autophagic activity of IH in the proliferative phase is higher than that in the regression phase IH.Down-regulating autophagy may promote the transformation of proliferating IH to regression phase.

Infantile hemangioma； Apoptosis； Autophagy; Proliferative period; Regression phase; Atg5; LC3-Ⅱ; Autophagy-related proteins

陜西省社會發(fā)展攻關計劃項目(2014K11-03-09-11)

710032 陜西 西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 全軍整形外科研究所

米 萱(1988-)，女，陜西西安人，醫(yī)師，碩士研究生.

楊 力，710032，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 全軍整形外科研究所，電子信箱：yangli@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.06.007

R732.2

A

1673-7040(2016)06-0343-04

2016-04-17)