何 越,田智泉,郜香黎，李敏鴿，冉永峰，黃馨慧

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實(shí)驗(yàn)研究

人羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料的生物相容性及動(dòng)物有效性研究

何 越,田智泉,郜香黎，李敏鴿，冉永峰，黃馨慧

目的 探討人羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料的生物相容性及動(dòng)物有效性。方法 通過生物學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)對(duì)羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料的刺激性、致敏性、細(xì)胞毒性等進(jìn)行檢測(cè)，并通過大鼠皮內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)材料的動(dòng)物有效性(以上市產(chǎn)品雙美膠原蛋白作為對(duì)照)。結(jié)果 羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料無致敏性、無刺激性，且細(xì)胞毒性不大于1級(jí)；大鼠皮內(nèi)植入有效性實(shí)驗(yàn)顯示，羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料于植入后20周依然有肉眼可觀察到的材料保留。雙美膠原植入劑降解完全，肉眼和HE染色均未見材料。且兩種材料在體內(nèi)降解期間的炎癥反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)均為輕度反應(yīng)。結(jié)論 人羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料具有良好的生物相容性，無明顯炎癥及免疫排斥反應(yīng)。其在大鼠皮內(nèi)耐降解性強(qiáng)，保留時(shí)間較長(zhǎng)，可作為一種安全有效的填充注射產(chǎn)品應(yīng)用于臨床。

人羊膜脫細(xì)胞基質(zhì); 生物相容性; 動(dòng)物有效性； 填充材料

目前，被美國FDA以醫(yī)療器械批準(zhǔn)上市的用于修復(fù)皮膚組織缺損的可吸收材料包括:⑴透明質(zhì)酸鈉；⑵膠原蛋白；⑶羥基磷灰石；⑷聚乳酸[1-2]。羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料屬于可吸收膠原類材料,已有大量研究證實(shí)，羊膜本身就是一種良好的生物材料[3]，羊膜臨床應(yīng)用的研究很多，如眼科、口腔、外科、泌尿科等，且多數(shù)臨床效果良好[4-5]。但關(guān)于羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料在整形美容、注射填充方面的相關(guān)研究少見。自 2012年3月至2015年10月，陜西瑞盛生物科技有限公司研發(fā)部對(duì)專利方法所制備的羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料的生物相容性及動(dòng)物有效性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以客觀、準(zhǔn)確的反應(yīng)其安全性。

1 對(duì)象與方法

1.1 羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料的制備

1.1.1 對(duì)象與設(shè)備 新鮮羊膜(陜西省婦幼保健院獲取，并與患者簽訂知情同意書)；胰蛋白酶、碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，均購買自美國GIBCO公司；控溫?fù)u床(上海君翼儀器設(shè)備有限公司)；低溫高速粉碎機(jī)(德國FRITSCH公司)；高速微射流均質(zhì)機(jī)(美國DEBEE公司)。

1.1.2 制備方法 取新鮮羊膜，使用75%乙醇進(jìn)行病毒滅活，再使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行脫細(xì)胞處理，配置EDC∶NHS(4∶1)體系進(jìn)行交聯(lián)改性，之后采用純化水進(jìn)行震蕩清洗，充分洗去殘留試劑，只保留羊膜細(xì)胞外基質(zhì)成分。干燥后利用低溫粉碎機(jī)將羊膜細(xì)胞外基質(zhì)粉碎成粒徑為60～120 μm的微粒，并與PBS溶液配置成混懸液，混懸液進(jìn)行均質(zhì)后灌裝于預(yù)灌封注射器中，輻照滅菌，即獲得凝膠狀羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料。

1.2 生物相容性檢測(cè)

1.2.1 致敏性 取白化豚鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，2～3個(gè)月齡，來源于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心。隨機(jī)分成3組，陽性對(duì)照組(10只)，試驗(yàn)組(10只)、陰性對(duì)照組(10只)，開始適應(yīng)環(huán)境，為時(shí)1周。試驗(yàn)前1 d，在胸廓的背前區(qū)備皮4 cm×6 cm。于豚鼠背部去毛，消毒后于肩胛骨內(nèi)側(cè)從頭向尾成對(duì)注射6個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射 0.1 ml,見圖1。A點(diǎn)注射完全弗氏佐劑與生理鹽水(1∶1)混合液；B點(diǎn)試驗(yàn)組注射待檢物與完全弗氏佐劑的等體積混合物，陰性對(duì)照組則注射生理鹽水，陽性對(duì)照組注射巰基苯并噻唑；C點(diǎn)注射前2種注射液的等體積混合物。之后進(jìn)行局部誘導(dǎo)和激發(fā)，并分別于激發(fā)后24 h和48 h觀察各組動(dòng)物激發(fā)部位皮膚情況，在自然光或全光譜光線下觀察皮膚反應(yīng)。根據(jù)Magnusson和Kligman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)皮膚反應(yīng)情況進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)，無明顯改變；1級(jí)，散發(fā)性或斑點(diǎn)狀紅斑；2級(jí)，中度融合性紅斑；3級(jí)，重度紅斑和水腫[6]。

1.2.2 刺激性 取12只新西蘭兔，體質(zhì)量(2.0±0.2) kg，3～4個(gè)月齡，來源于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心。分籠飼養(yǎng)于空調(diào)室內(nèi)，室溫(21±2)℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照12 h/d，自由飲用自來水。試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。并在試驗(yàn)前24 h將動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)背毛去除10 cm×15 cm，分為樣品組和陽性對(duì)照組。通過單次接觸、多次給藥,在同一部位行皮膚刺激性試驗(yàn)，確保每次給藥時(shí)間相同，貼敷時(shí)間一般不超過4周。在自然光線下觀察皮膚反應(yīng)(紅斑和水腫)，根據(jù)皮膚反應(yīng)情況打分。紅斑和焦痂形成：無紅斑，0分；輕微紅斑(勉強(qiáng)可見)，1分；明顯紅斑，2分；中度～重度紅斑，3分；嚴(yán)重紅斑(紫紅色)至輕微焦痂形成，4分。水腫形成：無水腫，0分；輕微水腫(勉強(qiáng)可見)，1分；輕度水腫(皮膚隆起輪廓清楚)，2分；中度水腫(皮膚隆起約1 mm)，3分；重度水腫(皮膚隆起超過1 mm，范圍擴(kuò)大)，4分。兩項(xiàng)評(píng)分之和為其總分。根據(jù)GB16886[6]第十部分對(duì)刺激的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)產(chǎn)品有無刺激性。

1.2.3 細(xì)胞毒性 將傳代48～72 h生長(zhǎng)旺盛的L929細(xì)胞胰酶消化收集，用高糖DMEM培養(yǎng)基配置成1×104/ml的細(xì)胞懸液，接種至96孔板中，每孔200 μl。樣品按照1∶9比例浸提，浸提介質(zhì)為含10%新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，浸提溫度為37℃，浸提時(shí)間為24 h。將試驗(yàn)組、空白對(duì)照組及陽性對(duì)照組分別加入細(xì)胞懸液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。在培養(yǎng)第5天時(shí)，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)各孔吸光度值(OD值)，用空白調(diào)零孔OD值調(diào)零，取平均值并記錄。根據(jù)各組的吸光度均值計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率。根據(jù)細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)反應(yīng)分級(jí)：細(xì)胞相對(duì)增殖率≥100%為0級(jí)，80%～99%為1級(jí)，50%～79%為2級(jí)，30%～49%為3級(jí)，1%～29%為4級(jí)，0為5級(jí)。

1.3 動(dòng)物有效性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

大鼠6只，220 g左右，3～4個(gè)月齡。分籠飼養(yǎng)于空調(diào)室內(nèi)，室溫(21±2)℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照12 h/d，自由飲食飲水。每只大鼠背部皮下分別植入羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料和雙美加強(qiáng)型膠原蛋白植入劑(臺(tái)灣雙美生物科技有限公司)各1個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.1 ml樣品。分別于術(shù)后1、4、8、12、16和20周各處死1只大鼠并取材，拍照記錄手術(shù)部位外觀，觀察有無紅腫、潰爛等不良反應(yīng)發(fā)生，對(duì)比觀察不同植入材料的皮下降解情況，并對(duì)取材點(diǎn)進(jìn)行常規(guī)HE組織學(xué)檢測(cè)及免疫組化檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 生物相容性

2.1.1 致敏性 所有豚鼠皮內(nèi)誘導(dǎo)體積均為0.1 ml,激發(fā)體積均為0.1 ml。根據(jù)Magnusson和Kligman分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，激發(fā)后24 h和48 h，試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的反應(yīng)等級(jí)均為0級(jí)，陽性對(duì)照組為2、3級(jí)，有中、重度的致敏反應(yīng)。

2.1.2 皮膚刺激性 樣品組在24 h時(shí)，1例出現(xiàn)輕微紅斑；48 h時(shí)，1例出現(xiàn)輕微紅斑，1例出現(xiàn)輕微水腫。陽性對(duì)照組無一例出現(xiàn)紅斑和水腫。根據(jù)GB16886標(biāo)準(zhǔn)，樣品組與陽性對(duì)照組的評(píng)分差值小于1.0，且平均評(píng)分積分小于0.5，判斷本產(chǎn)品無刺激性。

2.1.3 細(xì)胞毒性 羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料的細(xì)胞增殖率為(92.00±1.29)%，細(xì)胞毒性為1級(jí)。

2.2 動(dòng)物有效性

2.2.1 大體觀察與HE染色 大鼠背部注射羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料4周時(shí)，材料保留明顯，材料周圍有少量炎癥細(xì)胞浸潤；4周后炎癥明顯降低，材料緩慢降解；20周時(shí)依然可見部分材料殘留，基本無炎癥反應(yīng)發(fā)生(圖2)。雙美膠原蛋白在20周時(shí)材料基本降解完全，僅見少許材料降解痕跡(圖3)。

2.2.2 免疫組化 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，試驗(yàn)組在注射后4周和20周均無明顯的免疫反應(yīng)(圖4)。

3 討論

3.1 生物相容性 羊膜位于胎盤的最內(nèi)層，其光滑，無血管、神經(jīng)及淋巴，無免疫原性。華萍等[7]發(fā)現(xiàn)，凍干羊膜或新鮮羊膜均具有良好的組織相容性,不會(huì)引起明顯的急性免疫排斥反應(yīng),作為異體移植材料免疫安全性較好。

圖1 豚鼠背部注射示意(1為大鼠頭部，2為注射點(diǎn)，3為尾部) 圖2 大鼠背部注入羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料 a.術(shù)后4周大體 b.術(shù)后4周HE染色(×40) c.術(shù)后20周大體 d.術(shù)后20周HE染色(×40) 圖3 大鼠背部注入雙美加強(qiáng)型膠原蛋白植入劑 a.術(shù)后4周大體 b.術(shù)后4周HE染色(×40) c.術(shù)后20周大體 d.術(shù)后20周HE染色(×40) 圖4 材料植入部位不同時(shí)間點(diǎn)的免疫反應(yīng)情況(×100) a.術(shù)后4周 b.術(shù)后20周
Fig 1 Schematic diagram of guinea pig back injection (1 is the head of rats,2 is injection site and 3 is rat tail). Fig 2 Gross observation and HE staining for amniotic membrane matrix implants at the rat back. a.postview at 4 weeks by gross observation. b.postview at 4 weeks by HE staining (×40). c.postview at 20 weeks by gross observation. d.postview at 20 weeks by HE staining (×40). Fig 3 Gross observation and HE staining for Sunmax plus at the rat back. a.postview at 4 weeks by gross observation. b.postview at 4 weeks by HE staining (×40). c.postview at 20 weeks by gross observation. d.postview at 20 weeks by HE staining (×40). Fig 4 Immune response of embedded parts at different time points(×100). a.postview at 4 weeks. b.postview at 20 weeks.

筆者報(bào)道的羊膜基質(zhì)是以人體羊膜為原料，脫去細(xì)胞后保留以基底膜為主的細(xì)胞外基質(zhì)，去除了其他抗原成分，主要成分為膠原蛋白及其他結(jié)構(gòu)蛋白。羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料是將脫細(xì)胞處理的羊膜基質(zhì)通過物理機(jī)械方法粉碎成粒徑較為均一的微粒，之后均勻分散于低滲緩沖液中制成羊膜基質(zhì)混懸液，填充于預(yù)灌封注射器中。本產(chǎn)品使用專利技術(shù)對(duì)羊膜基質(zhì)進(jìn)行脫細(xì)胞、去抗原、滅活病毒及滅菌處理等，保證了在去除細(xì)胞成分的同時(shí)，充分保留細(xì)胞外基質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)以及主要成分，有效保證植入的安全性。研究結(jié)果也顯示，所制備的產(chǎn)品具有良好的生物相容性，不引起明顯的過敏反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)。這也與Spira等[8]的報(bào)道結(jié)果相一致，其經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人羊膜膠原植入12個(gè)月，在纖維素增生、血管浸潤和脂肪細(xì)胞與植入物的接合過程，其炎癥反應(yīng)均很低。

3.2 動(dòng)物有效性

目前，國內(nèi)外批準(zhǔn)的注射填充類產(chǎn)品中，市場(chǎng)較為常見的是透明質(zhì)酸和膠原類。雙美膠原蛋白植入劑屬于膠原類產(chǎn)品，其是由提取的豬皮膠原交聯(lián)后與生理緩沖液混合形成，有報(bào)道稱，雙美膠原產(chǎn)品的體內(nèi)有效性為9～12個(gè)月，且炎癥反應(yīng)小，無明顯免疫反應(yīng)[9]。

筆者報(bào)道的羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料，有效成分為脫細(xì)胞羊膜基質(zhì)，為同種異體原料，主要成分為膠原蛋白。膠原是細(xì)胞外最重要的不溶性纖維蛋白，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的骨架成分，可以提高細(xì)胞的張力和彈性，并且具有低免疫原性的特點(diǎn)[10-11]。為進(jìn)一步延遲體內(nèi)降解時(shí)間，產(chǎn)品進(jìn)行了EDC交聯(lián)處理，并通過有效清洗進(jìn)行清除，經(jīng)檢測(cè)合格，且對(duì)終產(chǎn)品進(jìn)行了輻射照射滅菌。

通過動(dòng)物有效性實(shí)驗(yàn)對(duì)比證實(shí)，羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料在觀察期，除注射后1周炎癥相對(duì)明顯外，其他各觀察點(diǎn)均具有較低的炎癥反應(yīng)，且于注射后4、12和20周時(shí)行免疫組化檢測(cè)，均無明顯反應(yīng)。在20周時(shí)，雙美膠原蛋白已經(jīng)完全降解，而羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料降解緩慢，依然有較為明顯的殘留(22周時(shí)完全降解)。因此，羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料符合目前較為理想的保留時(shí)間較長(zhǎng)的可降解吸收型填充產(chǎn)品的要求。本產(chǎn)品為可注射細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)品，相比于高純度的膠原產(chǎn)品，所含的細(xì)胞外基質(zhì)具有天然的生物支架結(jié)構(gòu)，植入人體后能很好地引導(dǎo)周圍組織纖維細(xì)胞長(zhǎng)入，間接提高膠原分泌，而且其基質(zhì)成分的微粒大小不同，使其能被更好的控制、延遲體內(nèi)降解時(shí)間，提高有效性。故羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料具有更好的填充效果。Sclafani等[12]也證實(shí)，微?；募?xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)品與提取膠原類植入填充產(chǎn)品相比，其在鼻唇溝或唇部填充方面具有更好的填充效果和更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間，且植入皮內(nèi)較植入皮下維持效果更為顯著。

綜上所述，人羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)填充材料具有良好的生物相容性，無明顯炎癥及免疫排斥反應(yīng)；通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其皮內(nèi)耐降解性強(qiáng)，保留時(shí)間長(zhǎng)，可作為一種安全、有效的美容填充注射產(chǎn)品使用。

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Research of biocompatibility and effectiveness in animals of human amniotic membrane acellular matrix filler material

HEYue,TIANZhi-quan,GAOXiang-li,LIMin-ge,RANYong-feng,HUANGXin-hui.

(DepartmentofResearchandDevelopment,ShanxiReshineBiotechnologyco.,LTD,Xi′an710077,China)

HUANGXin-hui,Email:huangxinhui@cbmrt.cn

Objective To investigate the biocompatibility and effectiveness in animals of human amniotic membrane acellular matrix filler material.Methods Irritation,sensitivity,and cell toxicity were detected by biological assessment experiments,and the efficacy of the material in animals was also inspected by a rat subcutaneous implantation experiment (Control group for Sunmax Ⅱ collagen implant agent).Results Amniotic membrane acellular matrix filler material was not sensitive or irritative,and the cytotoxicity of the cells was less than 1 degree.The results of the rat implant experiment showed the amniotic membrane matrix implants still retained visiblity at 20 weeks,while the Sunmax Ⅱ collagen implant agent degraded completely to detection by the naked eye and HE staining.The inflammatory reaction and immune rejection reaction of the two materials in vivo were both mild.Conclusion Human amniotic membrane acellular matrix material has excellent biocompatibility without obvious inflammation and immune rejection.The acellular amniotic matrix can be used as a safe and effective filling injection in clinical application because of its strong resistance to degradation and longer retention time.

Human amniotic acellular matrix; Biocompatibility; Animal efficacy; Filler material

710077 陜西 西安，陜西瑞盛生物科技有限公司 研發(fā)部

何 越(1987-)，男，陜西西安人，碩士.

黃馨慧，710077，陜西瑞盛生物科技有限公司 研發(fā)部，電子信箱：huangxinhui@cbmrt.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.06.019

R318;R-332

A

1673-7040(2016)06-0381-04

2016-02-07)