曹 林，曾秋鳳，張克英，丁雪梅，白世平，羅玉衡，王建萍，玄 玥，宿卓薇

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維生素C調(diào)控肉雞缺氧肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子－1αmRNA轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制

曹 林，曾秋鳳*，張克英，丁雪梅，白世平，羅玉衡，王建萍，玄 玥，宿卓薇

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，教育部動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安625014）

摘 要：作者旨在通過(guò)脯氨酸羥化酶抑制劑（DMOG）和過(guò)氧化氫（H2O2）刺激肉雞缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）探討維生素C（VC）對(duì)其氧化還原狀態(tài)與缺氧誘導(dǎo)因子－1α（HIF－1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及其受體2（VEGFR2/Flk－1）mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制。在前期PASMCs培養(yǎng)和缺氧模型的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)3個(gè)小試驗(yàn)，VC和H2O2、VC和DMOG、VC和H2O2＋DMOG，每個(gè)試驗(yàn)5個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明：與常氧和缺氧空白組相比，試驗(yàn)1，VC顯著增加SOD/MDA的比值（P＜0.05），顯著下調(diào)HIF－1α/VEGF/VEGFR2mRNA的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05），H2O2顯著上調(diào)缺氧肉雞PASMCs HIF－1αmRNA轉(zhuǎn)錄（P＜0.05）；試驗(yàn)2，DMOG顯著上調(diào)SOD/MDA的比值（P＜0.05），顯著下調(diào)HIF－1α和VEGFR2mRNA轉(zhuǎn)錄（P＜0.05），但顯著上調(diào)VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄（P＜0.05），VC＋DMOG顯著上調(diào)HIF－1α/VEGF/VEGFR2mRNA轉(zhuǎn)錄（P＜0.05）；試驗(yàn)3，VC＋H2O2＋DMOG三者同時(shí)添加極顯著增加HIF－1α/VEGF/VEGFR2mRNA轉(zhuǎn)錄（P＜0.01）。以上結(jié)果提示，VC能提升細(xì)胞外基質(zhì)的抗氧化水平，其對(duì)缺氧基因表達(dá)的調(diào)控與細(xì)胞內(nèi)脯氨酸羥化酶活性和氧化還原狀態(tài)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：肉雞肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；缺氧；HIF－1α；維生素C；H2O2；DMOG

肉雞腹水綜合征（ascites syndrome，AS）又稱(chēng)肉雞肺動(dòng)脈高壓綜合征（pulmonary hypertension syndrome，PHS），是快大型肉雞三大主要營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病之一。缺氧會(huì)引起肉雞肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）異常增生，導(dǎo)致肉雞肺動(dòng)脈血管重構(gòu)、肺動(dòng)脈壓升高、右心室肥大、自由基損傷等病理變化［1］，引發(fā)肉雞AS。眾多研究證實(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子－1α（hypoxia inducible factor－1alpha，HIF－1α）基因表達(dá)與肉雞AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2－3］。

HIF－1α的表達(dá)與活性受細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和脯氨酸羥化酶活性的影響［4］。常氧條件下，H2O2可通過(guò)失活脯氨酸羥化酶來(lái)穩(wěn)定HIF－1α蛋白活性［5］。在人前列腺癌細(xì)胞中胰島素通過(guò)誘導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生上調(diào)HIF－1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)［6］。在人血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體SOD也可調(diào)節(jié)HIF－1α的活性［7］。脯氨酸羥化酶是HIF－1α蛋白通過(guò)泛素化途徑降解的關(guān)鍵酶。DMOG（dimethyloxalylglycine），一種脯氨酸羥化酶的抑制劑，可上調(diào)HIF－1α蛋白的表達(dá)［8］。維生素C（VC）作為一種強(qiáng)抗氧化劑和脯氨酸羥化酶的輔助因子，對(duì)人或鼠類(lèi)腫瘤細(xì)胞HIF－1α基因表達(dá)及其蛋白活性有著較強(qiáng)的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)也表明，適宜濃度的VC（500或1 000μmol·L－1）能有效下調(diào)缺氧肉雞PASMCs中HIF－1α及其下游靶基因VEGF及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2/Flk－1）mRNA的轉(zhuǎn)錄［9］。

本試驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究VC、DMOG和H2O2對(duì)缺氧肉雞PASMCs氧化水平和缺氧基因HIF－1α/VEGF/VEGFR2mRNA轉(zhuǎn)錄的影響，揭示VC降低HIF－1α/VEGF/VEGFR2基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制，為VC在肉雞健康養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試驗(yàn)儀器與試劑 儀器：生物安全柜（Thermo1300Series）、倒置顯微鏡（Nikon TS100）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo3111）、照相系統(tǒng)（Nikon DS－Ri1）、多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M2）、ABI 7900型熒光定量PCR儀。試劑：DMEM－F12培養(yǎng)基（HyClone）、南美洲胎牛血清（Sigma）、胰蛋白酶（HyClone）、青鏈霉素（HyClone）、D－h(huán)anks液（武漢博士德）、CoCl2·6H2O（Sigma）。

1.1.2 肉雞肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧模型的建立 30只21日齡健康A(chǔ)A肉公雞，在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上培養(yǎng)肉雞PASMCs，且CoCl2250 μmol·L－1處理48h時(shí)PASMCs細(xì)胞增殖明顯，缺氧基因HIF－1α/VEGF/VEGFR2的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量較空白組也顯著升高。故以CoCl2250μmol·L－1，48 h為條件建立細(xì)胞缺氧模型。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)包括3個(gè)小試驗(yàn)。處理時(shí)間均為48h。

試驗(yàn)1 VC和H2O2對(duì)肉雞缺氧PASMCs氧化還原狀態(tài)及缺氧基因轉(zhuǎn)錄的影響。采用2×2＋1因子設(shè)計(jì)。缺氧條件下，2個(gè)VC添加水平（0和500μmol·L－1），2個(gè)H2O2添加水平（0或50 μmol·L－1）［10］和常氧空白對(duì)照處理，共5個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

試驗(yàn)2 VC和DMOG對(duì)肉雞缺氧PASMCs氧化還原狀態(tài)及缺氧基因轉(zhuǎn)錄的影響。采用2×2＋1因子設(shè)計(jì)。缺氧條件下，2個(gè)VC添加水平（0和500μmol·L－1），2個(gè)DMOG添加水平（0或1 mmol·L－1）［5］和常氧空白對(duì)照處理，共5個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

試驗(yàn)3 VC/H2O2/DMOG對(duì)肉雞缺氧PASMCs氧化還原狀態(tài)及缺氧基因轉(zhuǎn)錄的影響。采用2×2＋1因子設(shè)計(jì)。缺氧條件下，2個(gè)VC添加水平（0和500μmol·L－1），2個(gè)H2O2＋DMOG添加水平（0或50μmol·L－1H2O2＋1mmol·L－1DMOG）和常氧空白對(duì)照處理，共5個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

1.3 樣品收集與檢測(cè)

1.3.1 樣品收集 按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，－80℃保存，用于缺氧基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄量檢測(cè)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液，分別測(cè)定VC、SOD和丙二醛（MDA）的含量。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)液與裂解液氧化和抗氧化指標(biāo)的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)液與裂解液中VC、SOD和MDA的檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?？箟难幔╒C）試劑盒（南京建成，貨號(hào)：A009 50T/48樣）、SOD試劑盒（南京建成，貨號(hào)：A001－1羥胺法）、MDA試劑盒（南京建成，貨號(hào)：A003－1TBA法）。

1.3.3 RT－PCR檢測(cè) 利用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒和ABI Prism7900sequence detection system進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)。反應(yīng)采用10μL體系，冰上操作，反應(yīng)體系包括：5μL SYBR Premix Ex TaqTMII，0.4μL Forward Primer，0.4μL Reverse Primer，0.2μL ROX Reference，3μL dH2O 和1μL cDNA。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s，40個(gè)循環(huán)（95℃5s，60℃34s），熔解曲線檢測(cè)（95℃15s，60℃60s，95℃15s）。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 The sequence of primers

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

缺氧基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量采用2－ΔΔCt法［11］計(jì)算：△Ct（目的基因）＝Ct（目的基因）－Ct（內(nèi)參基因）；△△Ct＝Ct（試驗(yàn)組）－Ct（對(duì)照組）。目的基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量＝2－ΔΔCt。用SAS（9.0）進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著時(shí)用Ducan法進(jìn)行多重比較。以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。用GraphPad Prism 5作圖，但試驗(yàn)3缺氧基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后再用GraphPad Prism 5作圖。

2 結(jié) 果

2.1 VC和H2O2對(duì)肉雞缺氧PASMCs氧化還原狀態(tài)及缺氧基因轉(zhuǎn)錄的影響

2.1.1 VC和H2O2對(duì)肉雞缺氧PASMCs氧化還原狀態(tài)的影響 從圖1可看出，肉雞PASMCs培養(yǎng)液和裂解液中VC含量常氧空白組最低，且與缺氧空白組相比差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。缺氧條件下，H2O2組培養(yǎng)液中VC含量顯著降低（P＜0.05），裂解液中VC含量與缺氧空白組和VC＋H2O2組相比也顯著降低（P＜0.05）；VC組培養(yǎng)液中VC含量顯著高于其他處理組（P＜0.05）；VC＋H2O2組培養(yǎng)液中VC濃度顯著低于VC組（P＜0.05），但顯著高于其他處理組（P＜0.05），裂解液中VC含量與缺氧空白組相比有升高趨勢(shì)，但顯著高于其他處理組（P＜0.05）。

肉雞PASMCs培養(yǎng)液和裂解液中SOD活性常氧空白組最高，且培養(yǎng)液中SOD活性與H2O2組相比差異顯著（P＜0.05），裂解液中SOD活性顯著高于除H2O2組外的缺氧組（P＜0.05）。缺氧條件下，H2O2組培養(yǎng)液中SOD活性與其他缺氧組相比僅有降低趨勢(shì)，但裂解液中SOD活性上升，顯著高于其他缺氧組（P＜0.05）；VC組和VC＋H2O2組裂解液中SOD活性顯著低于常氧組和H2O2組（P＜0.05）。

肉雞PASMCs培養(yǎng)液中MDA含量常氧空白組顯著高于缺氧條件下的各處理（P＜0.05）；缺氧條件下，VC＋H2O2組MDA含量顯著高于VC組（P＜0.05），其他缺氧組間差異不顯著。此外，肉雞PASMCs培養(yǎng)液中VC組SOD/MDA的比值顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。

圖1 VC和H2O2對(duì)肉雞缺氧PASMCs培養(yǎng)液和裂解液氧化還原狀態(tài)的影響Fig.1 Effects of VC and H2O2on the redox state of culture medium and lysis solution of broiler PASMCs under hypoxia condition

2.1.2 VC和H2O2對(duì)肉雞缺氧PASMCs缺氧基因轉(zhuǎn)錄的影響 從圖2可看出，肉雞PASMCs缺氧基因HIF－1α/VEGF/VEGFR2mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在常氧空白組顯著低于缺氧試驗(yàn)組（P＜0.05）。缺氧條件下，HIF－1α和VEGF mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量呈現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)；H2O2組缺氧基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量最大，顯著高于其他處理組（P＜0.05）；VEGFR2mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在缺氧空白組最大，顯著高于VC組和H2O2＋VC組（P＜0.05）。

2.2 VC和DMOG對(duì)肉雞缺氧PASMCs氧化還原狀態(tài)及缺氧基因轉(zhuǎn)錄的影響

2.2.1 VC和DMOG對(duì)肉雞缺氧PASMCs氧化還原狀態(tài)的影響 從圖3可看出，肉雞PASMCs培養(yǎng)液和裂解液中VC含量常氧空白組最低，且與缺氧組相比達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。缺氧條件下，培養(yǎng)液中VC含量，DMOG組顯著低于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），VC組顯著高于其他處理組（P＜0.05），VC＋H2O2組顯著高于缺氧空白組（P＜0.05）。

圖2 VC和H2O2對(duì)肉雞缺氧PASMCs缺氧基因mRNA轉(zhuǎn)錄的影響Fig.2 Effects of VC and H2O2on the mRNA expression of hypoxia genes of broiler PASMCs under hypoxia condition

肉雞PASMCs培養(yǎng)液和裂解液中SOD活性常氧空白組最高，其培養(yǎng)液中SOD活性與DMOG組相比達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其裂解液中SOD活性與缺氧試驗(yàn)組相比均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

圖3 VC和DMOG對(duì)肉雞缺氧PASMCs培養(yǎng)液和裂解液氧化還原狀態(tài)的影響Fig.3 Effect s of VC and DMOG on the redox state of culture medium and lysis solution of broiler PASMCs under hypoxia condition

肉雞PASMCs培養(yǎng)液中MDA含量常氧空白組和VC＋DMOG組無(wú)差異，但顯著高于其他試驗(yàn)組（P ＜0.05）。缺氧條件下，DMOG組MDA含量最低，與缺氧空白組相比達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。肉雞PASMCs培養(yǎng)液中SOD/MDA的比值DMOG組最大，顯著高于除VC組外的所有試驗(yàn)組（P＜0.05）；VC組SOD/MDA的比值與常氧空白組和缺氧空白組相比有升高趨勢(shì)，與DMOG＋VC組相比達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。2.2.2 VC和DMOG對(duì)肉雞缺氧PASMCs基因轉(zhuǎn)錄的影響 從圖4可看出，肉雞PASMCs缺氧基因HIF－1α/VEGF/VEGFR2mRNA在常氧條件下的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量同試驗(yàn)1一致，顯著低于缺氧試驗(yàn)組（P＜0.05）。缺氧條件下，DMOG＋VC組缺氧基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量都最大，顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；DMOG組HIF－1αmRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著低于其他缺氧組（P＜0.05），VEGF mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著高于除DMOG＋VC組外的試驗(yàn)組（P＜0.05），VEGFR2mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量也達(dá)到最小值，顯著低于除VC組外的缺氧組（P＜0.05）；VC組與缺氧空白組相比，VEGFR2mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著降低（P＜0.05）。

圖4 VC和DMOG對(duì)肉雞缺氧PASMCs基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig.4 Effect of VC and DMOG on the mRNA expression of hypoxia genes of broiler PASMCs under hypoxia condition

2.3 VC/H2O2/DMOG對(duì)肉雞缺氧PASMCs氧化還原狀態(tài)及缺氧基因轉(zhuǎn)錄的影響

2.3.1 VC/H2O2/DMOG對(duì)肉雞缺氧PASMCs氧化還原狀態(tài)的影響 從圖5可看出，肉雞PASMCs培養(yǎng)液和裂解液中VC含量常氧空白組最低，除VC＋H2O2＋DMOG組外，培養(yǎng)液中VC含量與缺氧組相比達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。缺氧條件下，H2O2＋DMOG組培養(yǎng)液中VC含量顯著高于除VC組外的其他缺氧組（P＜0.05），裂解液中VC含量最高，但僅與VC組相比達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；VC組培養(yǎng)液中VC含量最高，與其他缺氧組相比達(dá)到顯著水平（P＜0.05），裂解液中VC含量最低但各處理組之間無(wú)顯著差異（P＜0.05）；VC＋H2O2＋DMOG組培養(yǎng)液中VC含量最低，顯著低于其他缺氧組（P＜0.05）

圖5 VC、H2O2和DMOG對(duì)肉雞缺氧PASMCs培養(yǎng)液和裂解液氧化還原狀態(tài)的影響Fig.5 Effect of VC，H2O2and DMOG on the redox state of culture medium and lysis solution of broiler PASMCs under hypoxia condition

肉雞PASMCs培養(yǎng)液和裂解液中SOD活性常氧空白組都處于最高水平，培養(yǎng)液中SOD活性與VC＋H2O2＋DMOG組相比達(dá)到顯著水平（P＜0.05），裂解液中SOD活性與缺氧組相比均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

肉雞PASMCs培養(yǎng)液中MDA含量常氧空白組最高，顯著高于除H2O2＋DMOG組外的其他缺氧組（P＜0.05），VC組SOD/MDA的比值最大，顯著高于其他處理組（P＜0.05）。

2.3.2 VC/H2O2/DMOG對(duì)肉雞缺氧PASMCs缺氧基因轉(zhuǎn)錄的影響 從圖6可看出，肉雞PASMCs缺氧基因HIF－1α/VEGF/VEGFR2mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量于VC＋H2O2＋DMOG組最大，極顯著高于其他處理組（P＜0.01）；VEGFR2mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量H2O2＋DMOG組顯著高于常氧空白組、缺氧空白組和VC組（P＜0.05）。

圖6 VC/H2O2/DMOG對(duì)缺氧肉雞PASMCs基因轉(zhuǎn)錄的影響（數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換）Fig.6 Effect of VC/H2O2/DMOG on the mRNA expression of hypoxia genes of broiler PASMCs under hypoxia condition（Data of figure 6is logarithmic conversion）

3 討 論

HIF－1α是肉雞AS發(fā)生的關(guān)鍵啟動(dòng)因子。研究證實(shí)，VC是降解HIF－1α蛋白關(guān)鍵酶活性得以發(fā)揮的必需營(yíng)養(yǎng)成分［5］，可有效降低肉雞肺、肝中HIF－1α的表達(dá)，增強(qiáng)血清抗氧化水平，顯著降低肉雞AS的發(fā)病率。VC是一種廣譜抗氧化物，在細(xì)胞內(nèi)外液中都有重要的抗氧化活性，能有效清除O－2、H2O2、OH－、LOO－等，減輕氧化劑對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄、DNA、蛋白質(zhì)或膜結(jié)構(gòu)的損傷。但當(dāng)有過(guò)渡金屬（如鐵和銅）存在時(shí)VC也可能起還原劑作用［12］。SOD是清除體內(nèi)自由基的重要抗氧化酶，而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈?zhǔn)浇K止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物，其含量可間接反映自由基的產(chǎn)生情況［13］。SOD/MDA比值能夠反映自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化和清除速率，便于深入了解自由基的代謝情況。

本試驗(yàn)在CoCl2誘導(dǎo)肉雞PASMCs建立細(xì)胞缺氧模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常氧條件下缺氧基因HIF－1α/VEGF/VEGFR2的轉(zhuǎn)錄量都很低，而缺氧能顯著上調(diào)其轉(zhuǎn)錄，這與D.Shweiki等的研究結(jié)果［14］一致。缺氧會(huì)引起機(jī)體自由基代謝異常［15］，H2O2的添加加劇細(xì)胞氧化與抗氧化失衡，加強(qiáng)氧化應(yīng)激，上調(diào)HIF－1α和VEGF mRNA的表達(dá)［16－17］。有研究證實(shí)H2O2與HIF－1α和VEGF mRNA的顯著轉(zhuǎn)錄息息相關(guān)［18］。飼糧中添加1 000 mg·kg－1VC能增強(qiáng)肉雞血清抗氧化水平，顯著下調(diào)AS肉雞肺HIF－1α/VEGF/VEGFR2mRNA的轉(zhuǎn)錄［2－3］。本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)VC能顯著提升培養(yǎng)液中SOD/MDA的比值，增強(qiáng)肉雞PASMCs抗氧化能力，顯著下調(diào)HIF－1α/VEGF/VEGFR2mRNA的轉(zhuǎn)錄。

脯氨酸羥化酶是HIF－1α通過(guò)泛素蛋白途徑降解的限速酶［19］。DMOG通過(guò)抑制脯氨酸羥化酶活性來(lái)抑制HIF－1α羥化，減少HIF－1α蛋白降解，穩(wěn)定HIF－1α蛋白活性，上調(diào)HIF－1信號(hào)通路。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DMOG的添加顯著下調(diào)HIF－1αmRNA的轉(zhuǎn)錄，原因在于DMOG阻斷了HIF－1α通過(guò)泛素化蛋白途徑的降解，使其在細(xì)胞內(nèi)大量積累［5］，反饋性地下調(diào)HIF－1αmRNA的轉(zhuǎn)錄。脯氨酸羥化酶的抑制劑有兩類(lèi)：鐵螯合劑，如去鐵敏和環(huán)吡酮胺，或鐵競(jìng)爭(zhēng)劑，如二氯化鈷（CoCl2）；酮戊二酸類(lèi)似物，如DMOG［20－21］和FG－4487等。本試驗(yàn)用于化學(xué)誘導(dǎo)缺氧的CoCl2已競(jìng)爭(zhēng)性地抑制了脯氨酸羥化酶的活性，再加入DMOG進(jìn)一步抑制脯氨酸羥化酶對(duì)HIF－1α的羥化作用，使HIF－1α蛋白保持穩(wěn)定，并與HIF－1β結(jié)合形成HIF－1［22］。DMOG使HIF－1α蛋白在細(xì)胞內(nèi)的大量積累，顯著提升其靶基因VEGF mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量［23］，且VEGF和VEGFR2的表達(dá)受多種上游轉(zhuǎn)錄因子，如HIF－1α、癌基因Ras和細(xì)胞因子等的共同調(diào)控［24］。在CoCl2誘導(dǎo)肉雞PASMCs缺氧的基礎(chǔ)上，VC＋DMOG以及VC＋H2O2＋DMOG作用時(shí)，VC不僅沒(méi)有下調(diào)缺氧基因的轉(zhuǎn)錄，反而促使其相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著升高，甚至是常氧組的上萬(wàn)倍?？赡苡捎赩C在不同生理狀態(tài)下其作用效果存在差異。本試驗(yàn)條件下VC可能增加了肉雞缺氧PASMCs對(duì)DMOG和H2O2＋DMOG的敏感性，這與馬愛(ài)國(guó)等研究發(fā)現(xiàn)0.5 mmol·L－1VC可能增加細(xì)胞DNA對(duì)H2O2及其他有害物質(zhì)損害的敏感性的結(jié)果［25］一致。

4 結(jié) 論

VC可以有效地緩解肉雞缺氧PASMCs因H2O2氧化刺激引起的缺氧基因的轉(zhuǎn)錄，但還能增強(qiáng)其對(duì)DMOG和H2O2＋DMOG的敏感性，上調(diào)缺氧基因的轉(zhuǎn)錄。

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（編輯 白永平）

Molecular Mechanism of Vitamin C on Hypoxia Inducible Factor－1αmRNA Transcription of Broiler Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells under Hypoxia Condition

CAO Lin，ZENG Qiu－feng*，ZHANG Ke－ying，DING Xue－mei，BAI Shi－ping，LUO Yu－h(huán)eng，WANG Jian－ping，XUAN Yue，SU Zhuo－wei
（Key Laboratory of Animal Nutrition for Disease Resistance in the Ministry of Education，Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University，Ya’an625014，China）

Abstract：This study was conducted to investigate the molecular mechanism of Vitamin C（VC）on redox state and the mRNA transcription of hypoxia inducible factor－1α（HIF－1α），Vascular endothelial growth factor（VEGF）and Vascular endothelial growth factor receptor 2（VEGFR2/Flk－1）in broiler PASMCs under hypoxia condition through dimethyloxalylglycine（DMOG）and H2O2.This study executed on the basis of the culture of PASMCs and hypoxia model，included 3 experiments，VC and H2O2，VC and DMOG，VC and H2O2＋DMOG，including 5treatments with six replicates of each experiment.Compared with control group under normoxic and hypoxic，Exp.1showed that VC significantly increased SOD to MDA ratio（P＜0.05），and down－regulated the mRNA transcription of HIF－1α/VEGF/VEGFR2（P＜0.05）；Exp.2showed that DMOG significantly increased SOD to MDA ratio（P＜0.05），and down－regulated the mRNA transcription of HIF－1αand VEGFR2（P＜0.05）respectively，but significantly up－regulated the mRNA tran－scription of VEGF（P＜0.05），VC＋DMOG significantly up－regulated the mRNA transcription of HIF－1α/VEGF/VEGFR2（P＜0.05）；Exp.3showed that VC＋H2O2＋DMOG markedly upregulated the mRNA transcription of HIF－1α/VEGF/VEGFR2（P＜0.01）.These results suggested that VC could increase cellular antioxidantive ability，and regulate the relative expression of hypoxia genes based on the activity of proline hydroxylase and the redox state of broiler PASMCs.

Key words：broiler pulmonary artery smooth muscle cells；hypoxia；hypoxia inducible factor－1α；vitamin C；H2O2；DMOG

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366－6964（2016）05－1033－08

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.022

收稿日期：2015－10－10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)青年基金（31101733）；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)211雙支計(jì)劃

作者簡(jiǎn)介：曹 林（1990－），男，四川綿陽(yáng)人，碩士生，主要從事家禽營(yíng)養(yǎng)與飼料研究，E－mail：1315522048@qq.com

*通信作者：曾秋鳳，研究員，博士，主要從事家禽營(yíng)養(yǎng)與飼料研究，E－mail：zqf@sicau.edu.cn