范燕茹，金 鑫，田巧珍，張 曼，劉 驕，楊銀鳳*

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植物乳桿菌誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD－1表達(dá)的信號(hào)通路途徑初探

范燕茹1，2，金 鑫1，2，田巧珍1，2，張 曼1，2，劉 驕1，2，楊銀鳳1，2*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特010018；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

摘 要：本試驗(yàn)旨在探索乳酸桿菌誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD－1表達(dá)的可能途徑。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT－qPCR）的方法，對(duì)已建立的誘導(dǎo)SBD－1表達(dá)模型中Toll樣受體2（Toll like receptor 2，TLR2）及其相關(guān)因子的基因表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)；然后選用3種信號(hào)通路抑制劑，即NF－κB信號(hào)通路抑制劑PDTC、ERK 1/2信號(hào)通路抑制劑PD98059和JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125，將細(xì)胞分為8組：細(xì)胞組：不作處理；陽(yáng)性對(duì)照組：只添加植物乳桿菌P－8（L.plantarum P－8）誘導(dǎo)；PDTC組：只添加PDTC預(yù)處理細(xì)胞（PDTC）；PDTC＋L.plantarum P－8組：PDTC ＋L.plantarum P－8誘導(dǎo)；PD98059組：PD98059；SP600125組：SP600125；PD98059＋L.plantarum P－8組：PD98059＋L.plantarum P－8；SP600125＋L.plantarum P－8組：SP600125＋L.plantarum P－8。采用RT－qPCR的方法檢測(cè)各組SBD－1mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，綿羊瘤胃上皮細(xì)胞被L.plantarum P－8誘導(dǎo)后，TLR2及其轉(zhuǎn)接蛋白MyD88、NF－κB和ERK1/2、JNK各基因的mRNA水平都較空白組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)極顯著增加（P＜0.01）；添加抑制劑后再誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)抑制劑PD98059和SP600125均能極顯著（P＜0.01）抑制細(xì)胞內(nèi)SBD－1mRNA的表達(dá)，而PDTC僅能顯著抑制（P＜0.05）SBD－1的表達(dá)。結(jié)果表明，L.plantarum P－8可促進(jìn)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞TLR2、MyD88、NF－κB、JNK和ERK1/2基因的mRNA表達(dá)；添加NF－κB信號(hào)通路抑制劑PDTC、ERK 1/2信號(hào)通路抑制劑PD98059和JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125，可抑制L.plantarum P－8對(duì)SBD－1mRNA的誘導(dǎo)作用。綜上表明，L.plantarum P－8有可能通過(guò)激活綿羊瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)NF－κB、JNK、ERK1/2等信號(hào)通路促進(jìn)SBD－1的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：β－防御素－1；瘤胃上皮細(xì)胞；乳酸桿菌；Toll樣受體2；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種具有強(qiáng)抗菌作用的陽(yáng)離子多肽，由于其獨(dú)特的抗菌機(jī)制，病原微生物不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性［1－2］。防御素（Defensins）是抗菌肽中較為重要的一種，包括5個(gè)亞家族：α－防御素、β－防御素和θ－防御素、昆蟲(chóng)防御素和植物防御素［3］。β－防御素由哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞產(chǎn)生，分布在機(jī)體宿主－環(huán)境的界面位置，構(gòu)成機(jī)體抵御外界微生物侵襲的第一道化學(xué)屏障，參與宿主的先天性免疫及獲得性免疫，其在宿主體內(nèi)的表達(dá)分為組成型和誘導(dǎo)型［4－5］。目前研究發(fā)現(xiàn)，綿羊體內(nèi)有兩種β－防御素，即綿羊β－防御素－1（Sheep beta defensin－1，SBD－1）和SBD－2，采用Northern雜交和RT－PCR技術(shù)證實(shí)，SBD－1在綿羊的呼吸道和整個(gè)消化道（除遠(yuǎn)端回腸）內(nèi)有廣泛的表達(dá)，而SBD－2主要在遠(yuǎn)端回腸表達(dá)，舌也有少量表達(dá)［6］。因此SBD－1可能是綿羊胃腸道免疫應(yīng)答的重要組成。益生菌（Probiotics）是在發(fā)酵乳制品有助于健康長(zhǎng)壽的理論發(fā)展起來(lái)的，研究表明，益生菌對(duì)調(diào)節(jié)腸道微生物平衡、提高胃腸道上皮的屏障功能、干擾致病菌在腸黏膜的定植和感染、調(diào)節(jié)局部或全身免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等起作用［7－9］。大量研究證實(shí)，益生菌可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)誘導(dǎo)型防御素的表達(dá)［10－11］。益生菌可以促進(jìn)上皮細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）以及各種細(xì)胞因子、抗菌肽來(lái)參與宿主的先天性免疫防御［12－14］。TLRs為模式識(shí)別受體的一員，是介導(dǎo)天然免疫及病原體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要跨膜信號(hào)傳遞受體，通過(guò)識(shí)別病原和其細(xì)胞壁中的類脂特殊結(jié)構(gòu)即病原相關(guān)分子模式（PAMP）來(lái)介導(dǎo)相關(guān)因子的表達(dá)和相應(yīng)的免疫應(yīng)答發(fā)生。由TLRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可誘導(dǎo)多個(gè)快速反應(yīng)基因的活化，所有的TLRs受體家族成員均依賴于TLRs的TIR結(jié)構(gòu)域經(jīng)MyD88依賴途徑或非MyD88依賴途徑向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)其識(shí)別的信號(hào)，最終活化NF－κB和絲裂原蛋白激酶（MAPKs）。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可通過(guò)誘導(dǎo)Hela上皮細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分泌人β防御素2（HBD2）和HBD3以抵抗白色念珠菌對(duì)細(xì)胞的感染［15］；乳酸桿菌應(yīng)用于雛雞的腸炎治療時(shí)，檢測(cè)到TLR2受體表達(dá)增高，表明TLR2參與宿主的免疫應(yīng)答，同時(shí)提示TLR2可能是乳酸桿菌的跨膜受體［10］。研究表明，TLR2可活化核轉(zhuǎn)錄因子（NF－κB）、激活MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并使被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞合成和釋放細(xì)胞因子［11］。

在前期試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可有效的誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞中SBD－1的表達(dá)，但關(guān)于乳桿菌與SBD－1之間誘導(dǎo)機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，那么是否同其他哺乳動(dòng)物防御素相似也是由TLR2識(shí)別PAMP來(lái)激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)對(duì)SBD－1的調(diào)控作用？因此，本研究在已建立的誘導(dǎo)SBD－1表達(dá)的模型中，對(duì)TLR2受體及其相關(guān)因子的基因表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)；進(jìn)一步檢測(cè)信號(hào)通路抑制劑對(duì)SBD－1誘導(dǎo)表達(dá)的影響，研究結(jié)果可作為揭示乳酸桿菌誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞中SBD－1表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的理論基礎(chǔ)與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘤胃組織 從呼和浩特市北亞清真屠宰場(chǎng)挑選健康狀況良好的綿羊，屠宰后立即剪取瘤胃內(nèi)面乳頭密集處組織一塊，用生理鹽水沖洗干凈后放入磷酸鹽緩沖液（PBS）中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試菌株 植物乳桿菌P－8（Lactobacillus plantarum P－8，L.plantarum P－8）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.3 主要試劑及儀器設(shè)備 主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone）、MRS肉湯培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱）、RNA fast200總RNA極速抽提試劑盒（上海飛捷）、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （DRR047A）（TaKaRa）、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（DRR820A）（TAKARA）、NF－kB抑制劑PDTC（Sigma）、ERK 1/2抑制劑PD98059（Sigma）、JNK抑制劑SP600125（Sigma）等。

儀器設(shè)備：－80℃冰箱、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)）、移液器（Eppendorf，德國(guó)）、多功能酶標(biāo)儀（SynergyTMH4，Biotek）、冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）、倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）、電子天平（Sartorius，德國(guó)）、立式自動(dòng)高壓滅菌鍋（TOMY，日本）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（VⅱA 7，ABI，美國(guó)）、普通電冰箱（海爾，青島）、水平離心機(jī)（北京醫(yī)療器械廠）、超凈工作臺(tái)（蘇凈，蘇州）、數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊）。

1.2 方法

1.2.1 L.plantarum P－8的活化培養(yǎng) L.plantarum P－8置于滅菌脫脂乳中，－80℃保存，使用前接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37℃無(wú)氧條件下靜置培養(yǎng)24h，活化傳代。在MRS瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)倍比稀釋，菌落計(jì)數(shù)，以確定菌液濃度，用于后續(xù)試驗(yàn)。使用前用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗兩次，調(diào)整制成合適濃度的菌液。

1.2.2 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與處理 采用本實(shí)驗(yàn)室已成熟的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，從新鮮的瘤胃組織中獲得并培養(yǎng)上皮細(xì)胞，待原代細(xì)胞匯合度為80%以上時(shí)，將細(xì)胞以1×106個(gè)·mL－1接種于細(xì)胞六孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)3d，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，細(xì)胞饑餓處理24h后，添加107cfu·mL－1L.plantarum P－8進(jìn)行誘導(dǎo)，陰性對(duì)照組只加同等體積的細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每組有3個(gè)平行樣。在37℃、5%CO2飽和濕度的環(huán)境中作用2h后，以滅菌無(wú)Ca2＋、Mg2＋的PBS溶液（含100 U·mL－1青霉素，0.05mg·mL－1鏈霉素）洗3次，洗去細(xì)胞表面的乳酸桿菌，再換以新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含100U·mL－1青霉素和0.05mg·mL－1鏈霉素），再在培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2飽和濕度）中繼續(xù)培養(yǎng)8h。根據(jù)RNA Fast200說(shuō)明書(shū)提取上述細(xì)胞總RNA，提取的RNA用核酸測(cè)定儀檢測(cè)吸光度A260nm和A280nm，測(cè)定RNA濃度和純度，同時(shí)用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量。

1.2.3 信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞的干預(yù) 將已經(jīng)饑餓24h的細(xì)胞分為8組（表1）：細(xì)胞組：不作處理；陽(yáng)性對(duì)照組：只添加植物乳桿菌P－8（L.plantarum P－8）誘導(dǎo)；PDTC組：只添加PDTC預(yù)處理細(xì)胞；PDTC＋L.plantarum P－8組：先添加PDTC預(yù)處理細(xì)胞1h，再用L.plantarum P－8誘導(dǎo)；PD98059組和SP600125組的處理同PDTC組；PD98059＋L.plantarum P－8組和SP600125＋L.plantarum P－8組的處理同PDTC＋L.plantarum P－8組。其中，L.plantarum P－8的添加濃度為107cfu·mL－1，誘導(dǎo)方法同上；PDTC的工作濃度為50μmol·L－1［16］，PD98059和SP600125的工作濃度均20μmol·L－1［17］。各組細(xì)胞均在37℃、5% CO2飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)8h后，提取RNA。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄及RT－qPCR檢測(cè) 細(xì)胞提取總RNA按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，4℃保存反轉(zhuǎn)錄所得cDNA。

根據(jù)GenBank中，各目的基因的基因序列，設(shè)計(jì)引物（表2）并送至生工生物工程有限公司（上海）合成。以cDNA為模板，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT－qPCR）的方法檢測(cè)各基因的mRNA表達(dá)含量。

表1 細(xì)胞分組Table 1 Groups

表2 各基因的引物序列Table 2 Primer sequences of genes for RT－qPCR

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)中，RT－qPCR的數(shù)據(jù)采用ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β－actin基因作為內(nèi)參，設(shè)每個(gè)基因陰性對(duì)照的表達(dá)量為1，經(jīng)Excel計(jì)算整理后，采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件根據(jù)試驗(yàn)需求分別進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，并根據(jù)分析結(jié)果進(jìn)行繪圖，圖中*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié) 果

2.1 L.plantarum P－8誘導(dǎo)下細(xì)胞中SBD－1及其通路基因mRNA的變化

107cfu·mL－1L.plantarum P－8直接作用于培養(yǎng)的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞2h，又繼續(xù)培養(yǎng)8h后，對(duì)細(xì)胞中SBD－1及其相關(guān)信號(hào)通路基因TLR2、MyD88、ERK1/2、JNK以及NF－κB的RT－qPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，設(shè)每個(gè)基因陰性對(duì)照的表達(dá)量為1。如圖1所示，在誘導(dǎo)細(xì)胞中的SBD－1mRNA水平極顯著高于未處理細(xì)胞中的水平（P＜0.01）；用相同的方法檢測(cè)多個(gè)可能涉及到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵基因TLR2、MyD88、ERK1/2、JNK以及NF－κB的mRNA相對(duì)表達(dá)量，也有類似結(jié)果：誘導(dǎo)細(xì)胞的膜表面受體TLR2及其轉(zhuǎn)接蛋白MyD88的mRNA相對(duì)表達(dá)量的水平顯著高于未處理細(xì)胞（P＜0.01），誘導(dǎo)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)關(guān)鍵因子ERK1/2、JNK和NF－κB的mRNA水平也較未處理細(xì)胞的表達(dá)顯著增高（P＜0.01）。而各基因表達(dá)量的增加幅度相比，差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 L.plantarum P－8對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞中SBD－1及其通路基因mRNA表達(dá)的影響（±s）Fig.1 Genes expression of SBD－1and pathway in sheep rumen epithelial cells induced by L.plantarum P－8（±s）

2.2 添加不同信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)SBD－1 mRNA表達(dá)的影響

用3種不同的信號(hào)通路抑制劑對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞預(yù)處理后，再進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，RT－qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞中SBD－1的表達(dá)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖2。添加ERK1/2信號(hào)通路抑制劑的PD98059結(jié)果可見(jiàn)圖2A，在不添加L.plantarum P－8誘導(dǎo)的細(xì)胞中，PD98059抑制SBD－1的表達(dá)，差異顯著（P＜0.05）；L.plantarum P－8誘導(dǎo)的情況下，細(xì)胞接受PD98059的預(yù)處理后，細(xì)胞中SBD－1的表達(dá)較不添加組的極顯著降低（P＜0.01），同樣用PD98059預(yù)處理的細(xì)胞組中，L.plantarum P－8不能有效誘導(dǎo)SBD－1的表達(dá)（P＞0.05）。添加JNK信號(hào)通路的抑制劑SP600125，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2B所示，SP600125的添加對(duì)細(xì)胞本身SBD－1的表達(dá)沒(méi)有影響（P＞0.05）；而同在L.plantarum P－8的誘導(dǎo)下，SP600125抑制SBD－1的表達(dá)，差異極顯著（P＜0.01）；L.plantarum P－8不能引起SP600125預(yù)先處理的細(xì)胞組中SBD－1的表達(dá)（P＞0.05）。在研究NF－κB信號(hào)通路的抑制劑PDTC對(duì)細(xì)胞中SBD－1表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn)，PDTC對(duì)細(xì)胞本身表達(dá)SBD－1有一定的抑制作用（P＜0.05），同時(shí)也能極顯著的抑制由L.plantarum P－8誘導(dǎo)的SBD－1的表達(dá)（P＜0.01），但試驗(yàn)結(jié)果也表明，L.plantarum P－8仍會(huì)顯著的誘導(dǎo)PDTC預(yù)處理過(guò)的細(xì)胞中SBD－1的表達(dá)（圖2C）。在L.plantarum P－8誘導(dǎo)細(xì)胞時(shí)，PD98059、SP600125和PDTC均能極顯著的抑制SBD－1的表達(dá)（P＜0.01），但相對(duì)于未處理細(xì)胞或只用抑制劑處理的細(xì)胞卻有不一樣的情況，結(jié)果表明，在L.plantarum P－8促進(jìn)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD－1的表達(dá)這一過(guò)程中，ERK1/2、JNK和NF－κB信號(hào)通路都有參與，但參與程度不盡相同。

3 討 論

防御素是一種廣泛存在于動(dòng)物體的呼吸道、消化道以及生殖道的具有廣譜抗菌作用的陽(yáng)離子多肽，在動(dòng)物體的天然免疫和獲得性免疫中扮演著重要的作用。SBD－1是廣泛表達(dá)于綿羊整個(gè)消化道的一種重要防御素，多種益生菌可不同程度的促進(jìn)其在綿羊瘤胃上皮細(xì)胞中的表達(dá)［18－19］，但其機(jī)制尚不清楚。

益生菌可被TLRs識(shí)別，可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘發(fā)很多反應(yīng)的快速活化，產(chǎn)生抗菌肽包括防御素等效應(yīng)分子，激活炎癥反應(yīng)，參與機(jī)體防御反應(yīng)。N.T.Funderburg等［20］證實(shí)HIV病人易患黏膜感染與TLR1表達(dá)減少，導(dǎo)致HBD－3表達(dá)的應(yīng)答障礙，進(jìn)而機(jī)體免疫防御減弱；D.R.Hill等［21］以HT－29結(jié)腸上皮細(xì)胞為載體，研究HBD－2的表達(dá)與TLR4的相關(guān)性，表明HBD－2的表達(dá)是依賴于TLR4的，并且TLR4缺失會(huì)降低HBD－2的表達(dá)；在以仔豬腹瀉為模型的研究中，發(fā)現(xiàn)pBD－2的表達(dá)是受多種TLRs共同調(diào)控的［22］。在本研究中，在mRNA的水平上證實(shí)，L.plantarum P－8在誘導(dǎo)SBD－1表達(dá)的同時(shí)會(huì)促進(jìn)TLR2及其轉(zhuǎn)接蛋白MyD88的基因表達(dá)，表明L.plantarum P－8誘導(dǎo)的SBD－1表達(dá)是與TLR2信號(hào)通路相關(guān)的，同時(shí)有可能激活了胞內(nèi)的MyD88依賴性途徑。

TLRs家族成員可向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)識(shí)別信號(hào)，與轉(zhuǎn)接蛋白結(jié)合，活化NF－κB、JNK等轉(zhuǎn)錄因子，最終誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌可經(jīng)TLRs激活NF－κB、MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞內(nèi)MBD－14的表達(dá)［23］；R.Paolillo等［24］就植物乳桿菌對(duì)人結(jié)腸上皮細(xì)胞的免疫作用研究發(fā)現(xiàn)，HBD－2的表達(dá)與植物乳桿菌是依賴TLR2－NF－κB/AP－1（MAPKs）途徑促進(jìn)HBD－2的表達(dá)的，均提示細(xì)胞內(nèi)防御素的表達(dá)可能是多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同介導(dǎo)的。

本研究表明，L.plantarum P－8具有提高NF－κB、JNK、ERK1/2的mRNA表達(dá)水平的作用；選用這3個(gè)因子的抑制劑來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證其參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況，結(jié)果表明，這3種抑制劑均可以有效的抑制L.plantarum P－8誘導(dǎo)SBD－1表達(dá)的作用。L.plantarum P－8首先可被綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的TLR2識(shí)別并結(jié)合，然后將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，再經(jīng)MyD88依賴途徑激活下游NF－κB、JNK、ERK1/2等信號(hào)通路，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)SBD－1表達(dá)的調(diào)控。但本研究仍需在后續(xù)的試驗(yàn)中從蛋白水平的層面驗(yàn)證不同信號(hào)通路的參與情況，也要進(jìn)一步探索不同信號(hào)通路間是否存在交互作用，以期更加全面的揭示L.plantarum P－8誘導(dǎo)SBD－1表達(dá)的機(jī)制。

圖2 不同信號(hào)通路抑制劑對(duì)細(xì)胞SBD－1mRNA表達(dá)的影響（±s）Fig.2 Effect of various antagonists on SBD－1mRNA expression（±s）

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，L.plantarum P－8可促進(jìn)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞TLR2、MyD88、NF－κB、JNK和ERK1/2的基因表達(dá)；而信號(hào)通路抑制劑的添加進(jìn)一步證明，L.plantarum P－8促進(jìn)SBD－1的分泌與NF－κB、JNK、ERK1/2信號(hào)通路的激活有關(guān)。

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（編輯 程金華）

Preliminary Study on the Pathway of SBD－1Expression in Sheep Rumen Epithelial Cells Induced by Lactobacillus plantarum

FAN Yan－ru1.2，JIN Xin1.2，TIAN Qiao－zhen1.2，ZHANG Man1.2，LIU Jiao1.2，YANG Yin－feng1.2*
（1.College of Veterinary，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2.Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease，Ministry of Agriculture，Hohhot 010018，China）

Abstract：This study aims to explore the possible approach that lactobacilli induce the expression of SBD－1in sheep rumen epithelium cells.Real－time fluorescence quantitative PCR（RT－qPCR）was conducted in this study to determine mRNA expressive variation of the toll like receptor 2 （TLR2）and its related factors in the established model to induce SBD－1.Three signaling pathway inhibitors were chosen which named NF－κB signaling pathway inhibitor PDTC，ERK 1/2signaling pathway inhibitor PD98059and JNK signaling pathway inhibitor SP600125，respectively.The tested cells were divided into 8groups：cell group：without treatment；positive groups：L.plantarum P－8；PDTC groups：PDTC pretreatment cells only；PDTC＋L.plantarum P－8 group：PDTC＋L.plantarum P－8；PD98059group：PD98059；SP600125group：SP600125；PD98059＋L.plantarum P－8group：PD98059＋L.plantarum P－8；SP600125＋L.plantarum P－8 group：SP600125＋L.plantarum P－8.RT－qPCR method was used for detecting the expression levels of SBD－1mRNA.The results indicated that the mRNA expression of TLR2，MyD88，NF－κB，ERK1/2and JNK had significant increase compared with the cell groups（P＜0.01）after the sheep rumen epithelial cells were induced by L.plantarum P－8，PD98059and SP600125could significantly inhibited the mRNA expression of SBD－1in cells（P＜0.01）with pretreatment that adding the inhibitors and were induced by L.plantarum P－8，however，the expression of SBD－1 was only inhibited significantly by the inhibitor PDTC（P＜0.05）.The results in this paper implied that L.plantarum P－8could promote the mRNA expression of TLR2，MyD88，NF－κB，JNKand ERK1/2.To add NF－κB signaling pathway inhibitor PDTC，ERK 1/2signaling pathway inhibitor PD98059and JNK signaling pathway inhibitor SP600125could inhibit the effect of L.plantarum P－8on inducing SBD－1mRNA.Thus，L.plantarum P－8could improve the SBD－1 expression by activating the signaling pathways of NF－κB，JNK and ERK1/2.

Key words：β－defensin－1；rumen epithelium cells；lactobacillus；toll－like receptor 2；real－time quantitative PCR

中圖分類號(hào)：S826；S852

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366－6964（2016）05－1026－07

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.021

收稿日期：2015－10－22

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31160491）；內(nèi)蒙古自治區(qū)人才開(kāi)發(fā)基金項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：范燕茹（1988－），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，博士生，主要從事動(dòng)物解剖學(xué)與黏膜免疫研究，E－mail：shining＿fyr@126.com

*通信作者：楊銀鳳，教授，博士，主要從事動(dòng)物解剖學(xué)與黏膜免疫研究，E－mail：julie1963@163.com