王心倩，孫　妍，占衛(wèi)紅，雷　航，陳高瞻，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023)

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結(jié)核分枝桿菌 Rv3607c T細(xì)胞表位分布情況預(yù)測(cè)及分析

王心倩，孫妍，占衛(wèi)紅，雷航，陳高瞻，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023)

摘要：為了預(yù)測(cè)和分析結(jié)核分枝桿菌( MTB) Rv3607c抗原的 CD4+T以及CD8+T 細(xì)胞表位的分布狀況，首先在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取抗原的氨基酸序列，然后使用BLAST并與人類蛋白進(jìn)行同源比對(duì)；之后使用NetMHC數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)并分析MTB的Rv3607c抗原的CD4+T細(xì)胞表位的分布狀況；再使用SYFPEITHI、NETCTL、BIMAS和NetMHC 在線預(yù)測(cè)分析MTB的Rv3607c抗原CD8+T細(xì)胞表位的分布狀況。結(jié)合兩個(gè)表位預(yù)測(cè)結(jié)果，篩選出最終表位肽段，為后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)做準(zhǔn)備。其結(jié)果為：首先預(yù)測(cè)出MTB的Rv3607c抗原有4個(gè)CD8+T細(xì)胞候選表位；而CD4+T細(xì)胞表位的初步結(jié)果為強(qiáng)結(jié)合表位29個(gè)，弱結(jié)合表位183個(gè)。結(jié)合兩個(gè)表位預(yù)測(cè)并分析，最終篩選出2個(gè)優(yōu)勢(shì)表位肽段。最后預(yù)測(cè)出的T 細(xì)胞候選表位將作為結(jié)核病特異性診斷和抗結(jié)核多表位疫苗的研究根基。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；Rv3607c；T細(xì)胞表位分析

1引言

結(jié)核病是影響我國(guó)人民健康的最主要的重大傳染性疾病，是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的。據(jù)2015年WHO報(bào)[1]，2014年估算全球有960萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病病例，其中包括約540萬(wàn)男性、320萬(wàn)女性以及100萬(wàn)的兒童，其中150萬(wàn)人死于結(jié)核病，更不幸的是，HIV 共感染的不斷擴(kuò)散、MDR-TB患者的不斷增多，愈加加劇了結(jié)核病的危害性。

目前，卡介苗( BCG)是唯一廣泛使用的疫苗，BCG對(duì)兒童具有較強(qiáng)的保護(hù)作用[2]，尤其是防止兒童重癥結(jié)核病的發(fā)生，如結(jié)核性腦膜炎。但是卡介苗對(duì)成年人的保護(hù)作用在降低[3]，并且有些人接種卡介苗后不能保證不感染結(jié)核病。隨著耐藥結(jié)核病的高發(fā)，以及各種抗結(jié)核藥物的較大毒副作用，使得結(jié)核病的發(fā)病率以及死亡率不斷攀升。理想的抗結(jié)核藥物應(yīng)當(dāng)具有抗病高效性以及快速殺菌活性，并且價(jià)格低廉。

1998年，結(jié)核病的全基因序列被Cole等[4]破譯，分子病理學(xué)檢測(cè)技術(shù)也逐漸被應(yīng)用于結(jié)核病的檢查當(dāng)中，基因檢查技術(shù)也在結(jié)核分枝桿菌應(yīng)用非常廣泛，結(jié)核病研究也進(jìn)入了基因組學(xué)新時(shí)代。抗原表位負(fù)責(zé)與抗體或者細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)，即一個(gè)抗原分子的免疫活性區(qū)域。就目前所知，一個(gè)蛋白質(zhì)抗原的表位，包含B細(xì)胞表位、輔助性T細(xì)胞表位和細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位、自然殺傷細(xì)胞表位等一些與免疫識(shí)別密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)，并且也包含了一些不利于保護(hù)性免疫作用的結(jié)構(gòu)。因此篩選和鑒定MTB蛋白抗原優(yōu)勢(shì)抗原表位對(duì)于通曉結(jié)合分支桿菌抗原引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)、深入了解結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制、改進(jìn)免疫學(xué)診斷方法以及新型疫苗開發(fā)具有相當(dāng)重要的意義[5]。

2材料與方法

2.1材料

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得MTB的Rv3607c蛋白序列(Gene ID: 885345、133 aa)。

2.2同源性分析比對(duì)

在 NCBI中的 Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )將Rv3607c的蛋白序列以及核酸序列與其他序列進(jìn)行同源比對(duì)分析。登錄NCBI選擇protein Blast，然后選擇非重復(fù)蛋白序列Non-redundant protein sequences ( nr) 數(shù)據(jù)庫(kù)，并提交Rv3607c抗原序列，分析抗原序列與MTB復(fù)合群、非結(jié)核分支桿菌以及其他細(xì)菌的同源性；然后選擇人類Human，進(jìn)行分析比對(duì)Rv3607c抗原序列與人蛋白序列的同源性。

2.3Rv3607c抗原的CD4+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)

登錄NetMHCⅡpan 3.1 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/service/NetMHCⅡpan/)，該軟件可預(yù)測(cè)MHCⅡ中的三類分子HLA-DR、HLA-DR以及HLA-DR。預(yù)測(cè)分析時(shí)的限定條件選定為15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的多肽，HLA-DR亞型，對(duì)MTB Rv3607c抗原進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。NetMHCⅡpan 3.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果輸出依據(jù)親和力的強(qiáng)弱判定，認(rèn)定親和值小于50 nm為強(qiáng)結(jié)合，親和值大于50 nm小于500 nm為弱結(jié)合。

2.4Rv3607c抗原的CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

2.4.1NetMHC表位預(yù)測(cè)

登錄NetMHC ( http://www.cbs.dtu.dk/service/NetMHC/)，該軟件可預(yù)測(cè)分析HLA-A、HLA-B、HLA-C以及HLA-E類別的MHC分子。由于絕大多數(shù)HLA分子偏向于與九個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽有強(qiáng)結(jié)合，所以選擇氨基酸長(zhǎng)度為9個(gè)，并選擇可能性最大的HLA-A 02 :01(A2 )以及HLA-A0301(A3 )兩類HLA分子作為限定條件[6]。其預(yù)測(cè)結(jié)果評(píng)定方法同NetMHCⅡpan 3.1 Server 。

2.4.2SYFPEITHI表位預(yù)測(cè)

SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/#userconsent#)是一個(gè)主要組織相容性復(fù)合體的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以進(jìn)行針對(duì)MHC等位基因的產(chǎn)物的配體進(jìn)行預(yù)測(cè)。進(jìn)入網(wǎng)站“http://www.syfpeithi.de/#userconse nt#”，選擇HLA- A* 02: 01、HLA- A* 03: 01兩類，多肽長(zhǎng)度選為9 個(gè)氨基酸，提交抗原序列，記錄分析得分在前2%的多肽序列。

2.4.3BIMAS表位預(yù)測(cè)

進(jìn)入BIMAS網(wǎng)站“http :// www - bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bin d/”，BIMAS是依據(jù)多肽分子與HLAⅠ類分子解離所用時(shí)間的一半進(jìn)行排序，其分析結(jié)果是依據(jù)系數(shù)表推導(dǎo)的。選擇 A_0201、A3兩類HLA分子，多肽長(zhǎng)度選為9 個(gè)氨基酸，而后輸入Rv3607c的氨基酸序列并提交，進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[7]。

2.4.4NetCTL表位預(yù)測(cè)

登錄NetCTL網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)，從Supertype網(wǎng)頁(yè)選擇類別中，選定A2和A3兩個(gè)超類型，Weight on C terminal cleavage值填寫為“0.15”，以及Weight on TAP transport efficiency填寫為“0.05”，Threshold for epitope identification填寫為“0.75”，而后輸入Rv3607c的氨基酸序列，進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。NetCTL 預(yù)測(cè)是通過(guò)人工網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)操作的，結(jié)果是以得分高低來(lái)分別顯示敏感度和特異度的高低。最后，對(duì)預(yù)測(cè)出的九個(gè)氨基酸的肽段，并且得分超過(guò)0.75的進(jìn)行記錄分析[8]。

3結(jié)果

3.1Rv3607c抗原同源性比對(duì)結(jié)果

Rv3607c抗原與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(包括非洲分枝桿菌、減毒牛分枝桿菌、人型結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)的同源性都達(dá)到100%；與非結(jié)核分枝桿菌的同源性為65%—83%，其平均值為74%，與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群相比，二者之間的同源性不如前者的高；與其他細(xì)菌平均值為65%。Rv3607c抗原序列與人類蛋白同源性比對(duì)結(jié)果匯總可見表1。從表1中可以看得出，Rv3607c抗原與人類蛋白相似性較低，并且同源性僅為46%。

表1人類蛋白同源性與抗原Rv3607c比較結(jié)果

蛋白最高評(píng)分期望值同源性/%Rv3607c29.65.146

從以上結(jié)果可以得出Rv3607c抗原與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的同源性相當(dāng)高，另一方面Rv3607c抗原與人類蛋白的同源性卻較低。因此認(rèn)為，Rv3607c抗原有作為免疫性結(jié)核病疫苗的潛能，并且也有繼續(xù)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析實(shí)驗(yàn)的必要性。

3.2Rv3607c抗原 T細(xì)胞表位結(jié)合預(yù)測(cè)結(jié)果

3.2.1Rv3607c抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

使用NetMHCⅡ pan 3.1 Server對(duì)Rv3607c抗原的CD4+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，過(guò)程中選擇在中國(guó)HLAⅡ分子中分布頻率較高的分子DRB1_0101、DRB1_0301、DRB1_0401、DRB1_0701、DRB1_0802、DRB1_0901、DRB1_1101、DRB1_1302、DRB1_1501作為限定條件，預(yù)測(cè)結(jié)果見表2。從預(yù)測(cè)結(jié)果可知，不同HLA分子結(jié)合數(shù)目大相徑庭，具體來(lái)說(shuō)Rv3607c抗原與DRB1_0101強(qiáng)結(jié)合的數(shù)目明顯較多；與DRB1_1302結(jié)合的短肽數(shù)目最少。與不同HLA分子強(qiáng)弱結(jié)合的數(shù)目可見表2。

表2NetMHCⅡpan對(duì)Rv3607c抗原的CD4+T細(xì)胞表位分布的預(yù)測(cè)結(jié)果

HLAⅡ分子Rv3607c總肽段數(shù)118強(qiáng)結(jié)合肽段數(shù)弱結(jié)合肽段數(shù)DRB1_01011440DRB1_0301022DRB1_0401017DRB1_0701028DRB1_0802212DRB1_0901315DRB1_11011020DRB1_1302010DRB1_1501019

3.2.2Rv3607c CD8+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果

選擇在中國(guó)分布較廣的HLAⅠ分子， HLA-0201 和 HLA-0301作為限定條件，對(duì)Rv3607c抗原使用 NETCTL、SYFPEITH、NetMHC和BIMAS這4種不同在線預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，并且綜合HLA-0201和HLA-0301的預(yù)測(cè)結(jié)果，匯總結(jié)果見表3。最后，綜合各種在線工具預(yù)測(cè)結(jié)果，Rv3607c抗原預(yù)測(cè)出4條抗原表位多肽。

表3不同在線預(yù)測(cè)工具對(duì) Rv3607c抗原CD8+T 細(xì)胞表位的綜合分析

蛋白位置序列NETCTL親和值得分SYFPEITHI得分NetMHC親和值得分BIMAS得分29-37FVIDVTVWI0.82941.4115206.91強(qiáng)結(jié)合94.69247-55DLADTYDYV0.39870.724422453.57弱結(jié)合86.45856-64RLASRAAEI0.20680.548624214.31弱結(jié)合10.433106-114QTFDDVAVV0.52030.932322190.15弱結(jié)合13.819

3.2.3Rv3607c CD4+T和CD8+T細(xì)胞表位綜合分析預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)五種在線預(yù)測(cè)工具分別預(yù)測(cè)，得出Rv3607c抗原的CD4+與CD8+T細(xì)肽段。最后依據(jù)CD4+T細(xì)胞表位的肽段包含CD8+T 細(xì)胞表位的肽段的原則，預(yù)測(cè)篩選出抗原 Rv3607c有2 條肽段，結(jié)果見表4 。

表4Rv3607c抗原的CD4+T和CD8+T細(xì)胞表位綜合分析

蛋白序列CD8表位肽段CD4表位肽段47-61DLADTYDYVDLADTYDYVRLASRA106-120QTFDDVAVVQTFDDVAVVIRRSRR

4討論

在近幾年的研究中，許多特異性結(jié)核抗原被研究人員發(fā)現(xiàn)[9]，這一結(jié)果為結(jié)核病疫苗的研制提供了有價(jià)值的研究基礎(chǔ)。許多新的疫苗也在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是仍然存在許多T細(xì)胞所識(shí)別的MTB蛋白抗原有待開發(fā)，這些抗原表位對(duì)于T細(xì)胞的激活和應(yīng)答，包括參與抗MTB感染的免疫起到的重要作用是不容忽視的。在未來(lái)的研究中，我們還應(yīng)當(dāng)加大對(duì)其他MTB蛋白抗原的研究力度，并研制出更具有治療效用、簡(jiǎn)單便捷的疫苗。

結(jié)核特異性免疫反應(yīng)極其需要有效的T細(xì)胞免疫應(yīng)答[10-11]。有研究表明，CD4+T細(xì)胞能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ，并且該細(xì)胞因子對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)核小鼠模型有極強(qiáng)的保護(hù)作用[12]。此外，通過(guò)對(duì)結(jié)核小鼠模型進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)人員也證實(shí)了CD8+T細(xì)胞對(duì)特異性免疫應(yīng)答過(guò)程具有保護(hù)作用[13]。同時(shí)在艾滋病患者中，出現(xiàn)了代謝阻礙的CD4+T細(xì)胞會(huì)更容易感染結(jié)核病[14]，即結(jié)核病合并感染艾滋病[15]。有部分研究報(bào)道，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)受到結(jié)核分枝桿菌感染的患者體內(nèi)存在MTB特異性CD8+T細(xì)胞[16-17]，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞[18]以及自然殺傷性細(xì)胞[19]。到目前為止，還沒有研究人員對(duì)結(jié)核分枝桿菌Rv3607c所編碼的蛋白是否影響結(jié)核病的發(fā)病做出相關(guān)判斷。本研究由于材料的局限性以及其他各方因素的限制，無(wú)法做出更加精準(zhǔn)的判斷，只有通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，對(duì)Rv3607c的表位在結(jié)核病診斷所發(fā)揮的作用進(jìn)行驗(yàn)證包括測(cè)定其免疫保護(hù)作用的強(qiáng)弱，才能給出更加讓人信服的結(jié)論。

筆者預(yù)測(cè)分析是通過(guò)生物信息學(xué)的方法，并使用 SYFPEITH和INETCTL等在線預(yù)測(cè)軟件對(duì) MTB的Rv3607c的CD8+T以及CD4+T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，最終分析預(yù)測(cè)結(jié)果得出優(yōu)勢(shì)抗原表位肽段，并且為之后驗(yàn)證該抗原多肽段的特異性和敏感性做預(yù)備。預(yù)測(cè)過(guò)程中，使用NetMHC pan 2.1 Server 在線預(yù)測(cè)工具對(duì)CD4+T 細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，再使用SYFPEITH對(duì)比其他3種在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)結(jié)果得出Rv3607c抗原的CD8+T細(xì)胞表位有4個(gè)。最后，綜合CD8+T細(xì)胞表位和CD4+T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)分析的結(jié)果，選取出2條多肽段(DLADTYDYVRLASRA、QTFDDVAVVIRRSRR)進(jìn)行人工合成，為進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者使用五種在線預(yù)測(cè)工具對(duì)MTB的Rv3607c抗原T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。這五種在線預(yù)測(cè)工具是根據(jù)Rv3607c的抗原表位多肽與不同等位基因結(jié)合能力強(qiáng)弱以及最終得分高低選取出最終優(yōu)勢(shì)抗原肽段。最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將作為后階段實(shí)驗(yàn)的理論依據(jù)以及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，確定了該抗原的實(shí)驗(yàn)價(jià)值，為進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)打下了良好的基礎(chǔ)。

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Prediction and analysis of T cell epitopes’s distribution of theMycobacteriumtuberculosisRv3607c

WANGXin-qian，SUNYan，ZHANWei-hong，LEIHang，CHENGao-zhan，YUXiao-li

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytecnic University,Wuhan 430023,China)

Abstract：To predict and analyze the distribution of CD4+T cell and CD8+T cell epitopes encoded by the Rv3607c ofMycobacteriumtuberculosis,We obtain the amino acid sequences by online NCBI database and analyze the homology between MTB complex and human proteins by BLAST,and predicting the distribution of CD8 T cell epitopes by SYFPEITHI、NETCTL、BIMASand NetMHC databases．After the predictiction，we can select the superior epitopes . For the results，there are 4 CD8+T cell epitopes candidates，29 strong and 138 weak candidate CD4+T cell epitopes candidates. In the end，two superior epitopes can be selected. Prediction of T cell epitopes will be the basis diagnosis of tuberculosis and the study of new tuberculosis vaccine.

Key words：Mycobacteriumtuberculosis;Rv3607c;T cell epitope analyze

收稿日期：2015-01-05.

作者簡(jiǎn)介：王心倩(1993-)，女，碩士研究生，E-mail: wawawayyy@qq.com.

文章編號(hào)：2095-7386(2016)02-0036-04

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.02.006

中圖分類號(hào)：Q 93

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A