李　琴，羅　飛，吳文湧，彭曉波，楊江科

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 湖北 武漢 430023)

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響應(yīng)面優(yōu)化蘆筍黃酮的酶法輔助提取工藝

李琴，羅飛，吳文湧，彭曉波，楊江科

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 湖北 武漢 430023)

摘要：采用響應(yīng)面法對果膠酶酶解和乙醇抽提的方式分步從蘆筍皮中提取黃酮類化合物的工藝參數(shù)進行了優(yōu)化。通過SAS 9. 0軟件分析，確定了最佳工藝參數(shù)：在液料比 42.2∶1，時間87 min, 溫度75.9 ℃的情況下，對酶解后的蘆筍廢棄物中黃酮進行乙醇萃取，黃酮提取量約為7.28±0.21 mg/g，與預(yù)測值(7.37 mg/g)非常相近，擬合系數(shù)R2(96.67%)顯示該回歸模型可準(zhǔn)確地預(yù)測果膠酶預(yù)處理之后的蘆筍廢棄物中黃酮的乙醇提取效率。

關(guān)鍵詞：蘆筍皮；響應(yīng)面法；果膠酶；黃酮

1引言

黃酮類化合物是一類具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，屬植物次生代謝產(chǎn)物，具有消除氧自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等許多藥用功能。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團，易溶于水、乙醇、甲醇等級性強的溶劑中，但難溶于或不溶于苯、氯仿等有機溶劑中[1-3]。

近幾年，我國蘆筍種植與加工產(chǎn)量巨大。在蘆筍加工過程中，大約15%—25%的老莖和蘆筍皮會被作為廢棄物處理，而研究結(jié)果顯示，這些蘆筍廢棄物中含有許多活性物質(zhì)，其中黃酮類化合物含量非常高，主要存在于蘆筍表皮[4-7]。目前，黃酮的主要提取工藝有醇提、水提等[8-14]。而因為植物組織中存在大量的多糖(果膠等)，這些多糖在醇提或水提過程中會增大萃取體系中的傳質(zhì)阻力，給萃取過程帶來阻力，降低萃取效率[15-19]。因此，在本實驗中，利用果膠酶酶解[20-21]和醇提工藝相結(jié)合，采用響應(yīng)面法優(yōu)化蘆筍皮中的黃酮類化合物的最佳提取工藝[22-29]，為今后蘆筍廢棄物的加工再利用工業(yè)化和高附加值產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)基礎(chǔ)。

2材料和方法

2.1材料

果膠酶購自Biotech；蘆筍皮干粉，自制，將新鮮蘆筍皮曬干用粉碎機粉碎過100目；無水乙醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)39H2O等試劑均為市售分析純，購自國藥集團。

2.2實驗方法

2.2.1酶解反應(yīng)

將蘆筍皮、酶、水以一定的比例混合，裝入50 mL具塞三角瓶中，混合均勻后置于恒溫?fù)u床中以一定溫度和轉(zhuǎn)速密閉振蕩酶解。反應(yīng)完成后，取出離心，吸取上層清液待測。

2.2.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[30-31]

采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法：配制50 mg/L的蘆丁乙醇溶液，分別取0 mL，1.5 mL，3.0 mL，6.0 mL，9.0 mL，12.0 mL移入 25 mL比色管中，加入5 mL的30%乙醇溶液和0.3 mL的5%亞硝酸鈉，混勻后放置5 min，加入0.3 mL的10% 硝酸鋁，搖勻后放置 6 min，加入2 mL的4%氫氧化鈉，用 30% 乙醇定容至25 mL搖勻，放置 10 min 后在 510 nm 處測出吸光度值，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，OD510為縱坐標(biāo)模擬回歸方程，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3黃酮化合物的提取及測定

將2.2.1中所得待測液與乙醇按一定的料液比定溶于錐形瓶中，用循環(huán)式多用真空泵進行抽濾得濾液，移取濾液按2.2.2處理，測定OD510。將OD510代入2.2.2所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中總黃酮含量[30]。

(1)

式中：C為從回歸方程中求得的蘆丁的濃度 (mg/L)，n為提取液稀釋的倍數(shù)，V為提取液的體積(mL)，m為稱取的蘆筍皮的質(zhì)量(g)。

2.2.4試驗設(shè)計

運用軟件SAS 9.0和Box-Behnken法設(shè)計響應(yīng)面實驗優(yōu)化提取效率(表1)，擬合出二次回歸方程(2)，同時檢驗方程的擬合度，獲得最優(yōu)的工藝條件，并進行試驗驗證。

(2)

式中：Y—黃酮含量(mg/g)，β—各項式系數(shù)，X—因子(自變量)。

表1Box-Behnken實驗設(shè)計

因子水平-101X1(液料比,mL/g)30∶140∶150∶1X2(時間,min))707580X3(溫度,℃)6080100

3結(jié)果與討論

3.1響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)表1設(shè)計，利用響應(yīng)面方法，對影響果膠酶預(yù)處理之后的蘆筍廢棄物中黃酮乙醇提取量的3個影響因子進行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2Box-Behnken試驗結(jié)果

No.X1/(mL/g)X2/minX3/℃Y/(mg/g)試驗值預(yù)測值偏差13070806.4676.6270.16023080806.5896.6510.06235070806.8526.8540.00245080806.8576.9020.04554070606.8236.502-0.321640701006.8456.794-0.05174080607.1254.512-2.613840801007.2006.857-0.34393075606.7546.9290.175105075606.9886.366-0.6221130751006.7886.445-0.3431250751007.1226.486-0.636134075807.3387.126-0.212144075807.3387.126-0.212154075807.3387.126-0.212

條件：蘆筍廢棄物1.0 g，酶量5%，酶解溫度40 ℃，酶解時間50 min。

利用SAS 9.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析，擬合得多項式回歸方程模型(3)：

(3)

模型方程(3)的可靠性可通過方差分析來考察，從方差分析結(jié)果(表3)可知，在α=0.05的水平上，該模型回歸高度顯著。擬合系數(shù)R2為96.67%，表明該模型與實驗結(jié)果擬合較好，96.67%的黃酮提取量可以由這個模型進行預(yù)測。因此可用上述模型預(yù)測果膠酶預(yù)處理之后的蘆筍廢棄物中黃酮的乙醇提取量。

表3回歸模型的方差分析

方差來源自由度平方和均方差F值Pr>F回歸91.009260.1121416.147160.00346(線性項)30.281070.0936913.490510.00784(二元項)30.722530.2408534.679650.00090(交互項)30.005650.001880.271300.84399殘差50.034720.00695(失擬項)30.034720.011580.0001(純誤差)20總離差141.04398R2=0.9667

通過對Y的回歸系數(shù)的檢驗(表4)可知，各因子對黃酮乙醇提取量影響的大小順序為X1>X2>X3。通過回歸數(shù)據(jù)典型分析(圖1 A、B、C)可以看出3 個因子的特征值均為負(fù)，表明該模型穩(wěn)定點為一馬鞍形頂點，是極大值，可以直接從此二次響應(yīng)面上確定最佳工藝參數(shù)：液料比 42.2∶1，時間87 min，溫度75.9 ℃。在此條件下, 黃酮乙醇理論提取量為7.831 mg/g。

表4回歸方程的回歸系數(shù)分析

參數(shù)估值標(biāo)準(zhǔn)差tRatioP>|t|X10.15490.02955.25650.0033*X20.10030.02953.40250.0192X30.03310.02951.12430.3120X1X10.36380.0434-8.38730.0004*X1X20.02480.0417-0.59390.5784XIX30.02500.04170.59390.5747X2X20.27850.0434-6.42160.0014*X2X30.01330.04170.31790.7633X3X30.06130.0417-1.41230.2170

*:Significant at 1% level.

3.2響應(yīng)面交互因子分析

圖1顯示隨著液料比、時間和溫度分別增加，黃酮提取量均有不同程度的增加，但是當(dāng)各參數(shù)的值分別超過某一定值后，黃酮提取量則均顯示不同程度的下降。

圖1(A)表明溫度不變時，液料比增至42.2∶1，黃酮提取量也隨之增加，但當(dāng)液料比大于42.2∶1時，黃酮提取量下降，可能是因為在一定范圍內(nèi)，當(dāng)液料比緩慢增大時，對黃酮的析出與萃取體系的均相是有一定促進作用的，而隨著醇量的不斷增加并超過一定值后，黃酮析出速率下降，但由于醇量增加導(dǎo)致萃取體系擴大，從而降低了單位萃取體系中黃酮的量。同樣，當(dāng)酶量保持不變時，圖1(B)顯示在一定溫度范圍內(nèi)(≤75.9 ℃)，溫度的上升有利于黃酮析出，溫度超過75.9 ℃時，黃酮提取量隨溫度升高而降低，原因可能是過高的溫度使醇逸出，降低實際參與萃取的乙醇量，進而影響了黃酮的提取量。圖1(C)則顯示液料比保持不變時，時間與溫度對黃酮提取量的影響。當(dāng)萃取時間少于87 min，黃酮提取量是緩慢增加的，而隨著萃取時間的延長，萃取體系逐漸趨于平衡，甚至反萃，因而導(dǎo)致黃酮提取量在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢。

3.3模型驗證

通過回歸模型分析，得到最優(yōu)反應(yīng)條件為：液料比 42.2∶1(X1=0.22)，時間87 min(X2=0.33)， 溫度75.9 ℃(X3=0.17)。優(yōu)化上述參數(shù)條件后(液料比 42∶1，時間87 min，溫度76 ℃)進行乙醇萃取，3次驗證實驗得黃酮提取平均量為7.28±0.21 mg/g，與回歸模型預(yù)測值7.37 mg/g十分接近。表明該模型能較好地預(yù)測果膠酶預(yù)處理之后的蘆筍廢棄物中黃酮的乙醇提取量。

圖1　黃酮乙醇提取效率的因素交互影響

4結(jié)論

筆者所做實驗優(yōu)化了果膠酶預(yù)處理之后的蘆筍廢棄物中黃酮的乙醇提取工藝參數(shù)，通過軟件SAS 9.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，獲得回歸模型。該模型的擬合系數(shù)R2為96.67%，說明該模型能夠較好地反映果膠酶預(yù)處理之后采用乙醇萃取蘆筍廢棄物中黃酮的實際情況。同時優(yōu)化了果膠酶預(yù)處理之后采用乙醇萃取蘆筍廢棄物中黃酮的最佳工藝條件為：液料比 42.2∶1，時間87 min，溫度75.9 ℃。在該參數(shù)條件下對蘆筍廢棄物中黃酮進行乙醇萃取，黃酮提取量約為7.28±0.21 mg/g，與預(yù)測值非常相近，為今后蘆筍廢棄物的加工再利用工業(yè)化和高附加值產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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Response surface optimization of extraction technology of flavonoids from asparagus waste assisted with enzymatic method

LIQin,LUOFei,WUWen-yong,PENGXiao-bo,YANGJiang-ke

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023, China)

Abstract：Experiments were carried to optimize the ethanol extraction parameters of flavonoids from asparagus peel which was hydrolyzed by pectinase using response surface methodology in the study. All the data were analyzed by SAS 9.0 software and the optimized conditions were obtained as follows: solid-liquid ratio 42.2:1, 87 min, 75.9 degrees.Under the optimum conditions, the quantity of flavonoids extractedwas up to 7.28 mg/g, which was close to the predicted value (7.37 mg/g). The model had a satisfactory coefficient ofR2(96.67%) and verified experimentally. The results showed that response surface methodology was a useful method to optimize the ethanol extraction parameters of flavonoids from asparagus peel which was hydrolyzed by pectinase .

Key words：asparagus peel; response surface methodology; pectinase; flavonoids

收稿日期：2015-04-20.

作者簡介：李琴(1978-)，女，講師，博士，E-mail：qinyun_2013@163.com.

文章編號：2095-7386(2016)02-0109-05

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.02.021

中圖分類號：TS 201.1

文獻標(biāo)識碼：A