汪 濤，趙雁平，胡衛(wèi)東，李育芳，程 波（.解放軍武漢療養(yǎng)院藥械科，湖北 武漢 430074；.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430030）

?

龍?zhí)俳罟瞧猩叽沧铀睾繙y(cè)定研究

汪 濤1，趙雁平1，胡衛(wèi)東1，李育芳1，程 波2（1.解放軍武漢療養(yǎng)院藥械科，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430030）

[摘要]目的：建立龍?zhí)俳罟瞧猩叽沧铀氐暮繙y(cè)定方法。方法：采用HPLC法測(cè)定龍?zhí)俳罟瞧猩叽沧铀氐暮俊＿x用welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-水（43∶57）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；流速：1.5 mL·min-1；柱溫：35 ℃。結(jié)果：HPLC法測(cè)定蛇床子素不存在干擾，蛇床子素進(jìn)樣量在1.560×10-3～0.046 8 mg·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，線性關(guān)系良好（r = 0.999 9）；平均回收率為100.82%，RSD為1.68%。結(jié)論：HPLC法測(cè)定蛇床子素含量簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠，可作為龍?zhí)俳罟瞧猩叽沧铀氐馁|(zhì)量控制方法。

[關(guān)鍵詞]龍?zhí)俳罟瞧?；蛇床子素；含量測(cè)定；高效液相色譜法

龍?zhí)俳罟瞧瑸榻夥跑娢錆h療養(yǎng)院配制的純中藥制劑，于1990年首次取得軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑批準(zhǔn)文號(hào)，至今已在臨床使多年，2011年再次取得軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑批準(zhǔn)文號(hào)：廣制字（2011）F03001。該制劑采中藥粉末與中藥提取浸膏混合后制粒，顆粒干燥后壓片的方法制備，屬于半浸膏素片；由中藥獨(dú)活、熟地、海桐皮、骨碎補(bǔ)、羌活、當(dāng)歸、牛膝組成[1]。獨(dú)活為君藥；熟地、海桐皮、骨碎補(bǔ)均為臣藥；羌活、當(dāng)歸、牛膝均為佐藥。諸藥配伍，具有補(bǔ)腎活血、通絡(luò)止痛、散寒除濕的功效，于治療肥大性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生、腰椎間盤突出、坐骨神經(jīng)痛、肩周炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者采高效液相色譜法（HPLC）對(duì)龍?zhí)俳罟瞧兴叽沧铀剡M(jìn)行了含量測(cè)定研究，為該制劑建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1　儀器與試藥

高效液相色譜儀（Dionex Ultimate3000，美國戴安公司）；色譜柱為welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；LC-350A型超聲波中藥處理機(jī)（濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠）。

蛇床子素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110822-201308）。龍?zhí)俳罟瞧ㄅ?hào)150108、150305、150317）由解放軍武漢療養(yǎng)院提供。乙腈（色譜純，美國Fisher公司，批號(hào)15035045）；水為純凈水；其余試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2　蛇床子素含量測(cè)定[2]方法和結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1供試品溶液 取龍?zhí)俳罟瞧兴?，取粉末約1.0 g（批號(hào)150305），精密稱定，置具塞錐形瓶?jī)?nèi)，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，再稱定重量，甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2對(duì)照品溶液 精密稱取蛇床子素5.20 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.052 0 mg ·mL-1）。再精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得溶液濃度為0.015 6 mg·mL-1。

2.1.3陰性對(duì)照溶液 取除去獨(dú)活以外的其它藥材，按確定的制備工藝生產(chǎn)陰性供試品。按擬訂的供試品溶液制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

色譜柱為welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；以乙腈-水（43∶57）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；流速：1.5 mL ·min-1；柱溫為35 ℃。理論塔板數(shù)按蛇床子素峰計(jì)算應(yīng)不得低于6000。

2.3專屬性實(shí)驗(yàn)

將上述3種溶液各20 μL，按“2.2”項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣分析，色譜圖結(jié)果顯示，蛇床子素出峰時(shí)間為21.86 min，色譜峰峰形對(duì)稱，達(dá)到基線分離，陰性對(duì)照供試品溶液無干擾，表明該法專屬性良好。詳見圖1。

2.4線性關(guān)系的考察

分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.052 0 mg·mL-1）0.3、0.6、1.5、3.0、6.0、9.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取不同濃度的對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：Y = 7.467 1×102X + 0.034 1，r = 0.999 9。結(jié)果表明：蛇床子素對(duì)照品在1.560×10-3～0.046 8 mg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.5儀器精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)150305）重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，RSD為0.30%。結(jié)果表明，本試驗(yàn)精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品（批號(hào)150305）6份，分別按“2.1.1”項(xiàng)下方法擬定制備，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果表明供試品中蛇床子素的平均含量為0.263 1 mg·g-1，RSD為1.16%。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品（批號(hào)150305），按“2.1.1”項(xiàng)下方法擬定制備，分別于配制后0、1、2、8、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定峰面積值的RSD為0.23%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.104 mg·mL-1）3、5、10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得不同濃度的蛇床子素對(duì)照品溶液（濃度分別為3.12、5.20、10.40 μg ·mL-1）。再精密稱取已知準(zhǔn)確含量的同一批供試品（批號(hào)150305）共9份，分別精密加入上述不同濃度的蛇床子素對(duì)照品溶液20 mL，每個(gè)濃度制備3份，按擬訂的供試品溶液制備方法制備，精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示蛇床子素的平均回收率為100.82%，RSD為1.68%，詳見表1。

圖1　HPLC色譜圖A–對(duì)照品，B–供試品，C–陰性對(duì)照；1–蛇床子素Fig 1 HPLC chromatogramsA–reference substance, B–sample, C–negative reference substance; 1–osthole

2.9耐用性試驗(yàn)

分別精密稱取同一批號(hào)（批號(hào)150305）的供試品粉末，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件，采3種不同品牌的色譜柱，依法測(cè)定。結(jié)果顯示：welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：分離度 > 1.5，理論塔板數(shù)11 944，含量為0.263 1 mg·g-1；Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：分離度 > 1.5，理論塔板數(shù)9904，含量為0.267 1 mg· g-1；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：分離度> 1.5，理論塔板數(shù)12 517，含量為0.267 7 mg·g-1，RSD為0.94%。表明3種不同品牌色譜柱均能重現(xiàn)現(xiàn)有方法。

2.10供試品的含量測(cè)定

取本品3批，批號(hào)分別為150108、150305、150317，按“2.2～2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表2。

表1　加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 9Tab 1 Results of recovery test. n = 9

表2　供試品中蛇床子素的含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 Results of content determination of osthole in samples

3　討論

龍?zhí)俳罟瞧?味中藥材組成，方中獨(dú)活味辛、苦，性微溫，治風(fēng)寒濕痹，腰膝酸痛，手腳攣痛，藥理研究顯示其具有擴(kuò)張血管、減少滲出、鎮(zhèn)痛抗關(guān)節(jié)炎等作[3]。羌活辛散祛風(fēng)、味苦燥濕、能祛風(fēng)散寒除濕，故善治腰以上風(fēng)寒濕痹，尤以肩背肢節(jié)疼痛者佳。研究表明羌活能解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、增加腦血流量、緩解疼痛和抗凝[4]。當(dāng)歸，以補(bǔ)血行氣、舒筋活絡(luò)、活血止痛[5]。研究顯示，牛膝具有擴(kuò)張下肢血管和改善血液黏度和微循環(huán)的作，從而起到消腫止痛的治療作[6]。熟地以“填骨髓，長(zhǎng)肌肉，生精血”，“通血脈，益氣力”。研究顯示，骨碎補(bǔ)具有促進(jìn)骨折愈合和補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效[7-8]。諸藥合，起到祛風(fēng)除濕散寒、活血化瘀、通絡(luò)鎮(zhèn)痛、改善血液循環(huán)、消炎止痛的作。

3.1含量測(cè)定指標(biāo)成分的選擇

在建立龍?zhí)俳罟瞧杏行С煞趾繙y(cè)定方法的過程中，根據(jù)龍?zhí)俳罟瞧?味藥材所起作及量，分別對(duì)獨(dú)活、熟地中的有效成分進(jìn)行了含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)。但是在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，龍?zhí)俳罟瞧芤褐惺斓厮锘ㄌ擒誋PLC色譜峰未達(dá)到基線分離、獨(dú)活所含二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯加樣回收實(shí)驗(yàn)時(shí)存在干擾，均不能被作龍?zhí)俳罟瞧暮繙y(cè)定指標(biāo)成分。

蛇床子素為獨(dú)活有效成分之一，獨(dú)活又為方中主藥，并且含量測(cè)定及加樣回收實(shí)驗(yàn)不存在干擾，故選擇蛇床子素作為控制龍?zhí)俳罟瞧|(zhì)量的指標(biāo)成分。

3.2流動(dòng)相的選擇

《中國藥典》2015年版一部中獨(dú)活項(xiàng)下測(cè)定蛇床子素，以乙腈-水（49∶51）為流動(dòng)相，測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)供試品分離度差，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，選定乙腈-水（43∶57）為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示供試品溶液峰形較好，蛇床子素能夠達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)按蛇床子素峰計(jì)算不低于6000。故最終采此流動(dòng)相。

3.3蛇床子素含量限度的確定

由于《中國藥典》2015年版一部中對(duì)獨(dú)活中蛇床子素的含量有規(guī)定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，選擇蛇床子素的含量為重點(diǎn)控制對(duì)象。根據(jù)含量測(cè)定的結(jié)果及大量配制中的實(shí)際情況，建議龍?zhí)俳罟瞧瑧?yīng)含蛇床子素≥70 μg·片-1。龍?zhí)俳罟瞧呐R床觀察數(shù)據(jù)顯示，其對(duì)患者血、尿常規(guī)、肝腎功能、心電圖等方面檢查均無不良影響，未發(fā)現(xiàn)異常變化。同時(shí)，在治療前后也未發(fā)現(xiàn)因龍?zhí)俳罟瞧鸬亩靖弊鱗9]。因此，我們認(rèn)為該制劑在目前口服劑量、療效范圍內(nèi)藥安全。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 汪濤，胡衛(wèi)東，李衛(wèi)興，等.龍?zhí)俳罟瞧苽涔に囇芯縖J].中國藥業(yè)，2012，21（14）：59-61.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（四部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：通則0512.

[3] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1977：1705.

[4] 馬玉林，李建民，馬莉，等.藥植物羌活的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（24）：13092-13093.

[5] 汪濤，胡衛(wèi)東，李衛(wèi)興，等.龍?zhí)俳罟瞧乃幮W(xué)實(shí)驗(yàn)研究[J].中國療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2013，22（2）：98-100.

[6] 李衛(wèi)興，李育芳，李清紅，等.龍?zhí)俳罟瞧委熇夏旯琴|(zhì)增生性腰椎病療效觀察[J].華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2012，26（4）：328-330，371.

[7] 范婧蓉，韓博，李禹濤，等.骨碎補(bǔ)水提液對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的影響[J].中國獸醫(yī)雜志，2009，45（2）：13-15.

[8] 高穎，王新巒，王乃利，等.骨碎補(bǔ)中的化學(xué)成分[J].中國藥物化學(xué)雜志，2008，18（4）：284-287.

[9] 李衛(wèi)興，李清紅，陳立.龍?zhí)俳罟瞧瑢?duì)肝腎功能影響的臨床觀察[J].華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2011，25（5）：450-451.

Study on content determination of osthole in Longtengjingu tablets

WANG Tao1, ZHAO Yan-ping1, HU Wei-dong1, LI Yu-fang1, CHENG Bo2(1. The Drug and Equipment Section of Wuhan Sanatorium of PLA, Wuhan 430074, China; 2. Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

[ABSTRACT]Objective: To establish a content determination method of osthole in Longtengjingu tablets. Methods：The content of osthole in Longtengjingu tablets were determined by HPLC. The analysis was performed on welch Ultimate AQ-C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm). The mobile phase was consisted of acetonitrile and water (43 : 57). The detection wavelength was 330 nm. The fow rate was 1.5 mL·min-1. The column temperature was 35 ℃. Results: There was no interference for osthole detection by HPLC method. The linear range of osthole was 1.560 × 10-3–0.046 8 mg·mL-1(r = 0.999 9). The average recovery was 100.82% (RSD = 1.68%). Conclusion: The method is simple, stable, reliable, and can be adopted as the quality control method of osthole.

[KEY WORDS]Longtengjingu tablets; Osthole; Content determination; HPLC

[中圖分類號(hào)]R917

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672–8157(2016)02–0089–03

[基金項(xiàng)目]軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃項(xiàng)目（14TG0197）

[作者簡(jiǎn)介]汪濤，男，主管藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、中藥制劑。E-mail：taidi1127@126.com

收稿日期：（2015-10-12 修回日期：2015-12-05）