曹曉涵，韓興發(fā)，杜小剛，陳志渝，孟風艷，儲明星，曾憲垠*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，雅安 625014；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，北京 100193)

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GnRH主動免疫雌性大鼠調(diào)控機制研究

曹曉涵1，韓興發(fā)1，杜小剛1，陳志渝1，孟風艷1，儲明星2，曾憲垠1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，雅安 625014；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，北京 100193)

摘要：旨在探討GnRH主動免疫雌性SD大鼠的調(diào)控機制。24只雌性SD大鼠隨機分為免疫組、卵巢切除組和空白對照組(n=8)，免疫組于12周齡注射疫苗，4周后加免；卵巢切除組11周齡外科手術(shù)摘除卵巢；空白對照組不作任何處理。使用放射免疫分析法測定血清激素E2、P4、FSH和LH含量，熒光定量PCR分析各基因mRNA表達情況。結(jié)果顯示，主動免疫顯著降低血清E2、P4、FSH和LH含量，至56周處死時，E2和LH含量有微弱上升，但4種激素含量均顯著低于空白對照組(P<0.05)。與空白對照組相比，主動免疫顯著下調(diào)下丘腦GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA，垂體GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA以及卵巢FSHR、LHR和ER-αmRNA的表達水平(P<0.05)。結(jié)果表明，GnRH主動免疫能顯著抑制雌性SD大鼠性腺發(fā)育，降低血清性激素含量，通過下丘腦ER-αmRNA-GPR54/KiSS-1通路保持動物較長時間去勢；但GnRH主動免疫造成的動物去勢存在恢復(fù)的可能。

關(guān)鍵詞：GnRH；主動免疫；調(diào)控；機制；雌性大鼠

由于存在發(fā)情行為，飼養(yǎng)雌性動物不僅難于管理，更有可能因為無計劃懷孕帶來諸多問題[1]；而對于雌性野生動物，對其進行避孕能更好的地控制動物數(shù)量，方便管理，也能減輕過度的動物數(shù)量給自然環(huán)境帶來的壓力[2]。研究表明，GnRH主動免疫雌性SD大鼠有很好的去勢效果[3]：雌性SD大鼠接受GnRH主動免疫后直至16wpv(Weekspostvaccine)，抗體滴度仍保持較高水平，且血清生殖激素維持極低水平。但隨著時間延長，接受GnRH主動免疫的雌性SD大鼠血清生殖激素、下丘腦-垂體-性腺軸各個生殖相關(guān)基因mRNA表達的變化規(guī)律還未見報道。本研究即對雌性大鼠主動免疫GnRH去勢疫苗，考察初次免疫56周后其生殖激素和生殖相關(guān)基因的變化情況，探討雌性動物GnRH主動免疫的調(diào)控機制，為GnRH主動免疫去勢疫苗更廣泛的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

GnRH并列二聚體卵清蛋白復(fù)合物(本實驗室合成)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR染料SYBRPremixExTaqTMⅡ(PerfectRealTime)、RNAisoPlus(TaKaRa公司)；LH、FSH、E2、P4碘[125I]放射免疫分析藥盒(北京北方生物研究所人源性試劑盒)。

1.2動物選取、分組及處理

24只健康性成熟Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠，10周齡，體重180～220g(購自四川大學華西動物中心)，隨機分為3組，分別是組Ⅰ、組Ⅱ、組Ⅲ(n=8)。組Ⅰ為免疫組(FemaleImmuneGroup，fIG)。12周齡時腿部肌肉注射1mL疫苗，4周后加免，加免時注射劑量及方法同初次免疫。組Ⅱ為卵巢切除組(Ovariectomygroup，OVX)。11周齡時進行手術(shù)。3%戊巴比妥鈉，按照30mg·kg-1體重腹腔注射麻醉。麻醉成功后趴臥，常規(guī)消毒，備皮。在大鼠腰部腎區(qū)偏下中間位置(距離脊柱約1cm位置)開口，切除卵巢。術(shù)后前3d每天肌肉注射青霉素2萬U，同時使用硫酸慶大霉素注射液沖洗傷口，觀察傷口愈合情況。組Ⅲ為空白對照組(Controlgroup，Con)，不作任何處理。試驗期間所有動物均按常規(guī)標準飼養(yǎng)，自由飲水和采食。

1.3樣品采集及處理

初次免疫當天記為0wpv。初免當天起至8wpv每2周空腹尾尖采血1次，從第8wpv起每4周空腹尾尖采血1次，每次1.5mL，直至處死(56wpv)。所有血樣于4 ℃放置過夜，3 500r·min-1，4 ℃離心15min，分離血清，-20 ℃保存，用于測定血清激素含量。

各組大鼠于56wpv(初免后第14個月)斷頸處死，處死后迅速分離下丘腦、垂體，放入含1mLTrizol的EP管中4 ℃保存用于提取總RNA；fIG和Con分離雙側(cè)卵巢，去除脂肪組織，放入含1mLTrizol的EP管中4 ℃保存用于提取總RNA。

1.4血清激素含量測定

應(yīng)用RIA測定雌鼠血清中FSH、LH、E2和P4含量，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.5基因表達測定

使用苯酚-氯仿法提取各組織總RNA，電泳檢測其完整性。完整RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板在特定引物下進行定量檢測，內(nèi)參基因選擇β-actin。每個樣品3次重復(fù)。PCR程序：預(yù)變性95 ℃10s；變性95 ℃5s；退火延伸58～60 ℃25s；讀取熒光值，共40個循環(huán)；熔解曲線分析(58～60) ℃直至95 ℃，每0.5 ℃恒溫5s。目的基因mRNA相對表達水平采用標準曲線法進行計算，熒光定量PCR結(jié)果使用Bio-RadCFXManager2.1 分析軟件處理。引物序列見表1。1.6統(tǒng)計分析

利用SPSS20.0軟件對所測數(shù)據(jù)進行單因子方差分析，采用Duncan法進行數(shù)據(jù)間比較，結(jié)果以“平均值±標準誤(mean±SEM)”表示。P<0.05表示數(shù)據(jù)差異顯著。

表1　引物序列

KiSS-1.KiSSpeptin編碼基因；GPR54.KiSSpeptin受體編碼基因；GnRH.促性腺激素釋放激素；GnRH-R.促性腺激素釋放激素受體；LH-β.促黃體生成素β亞基；FSH-β.促卵泡生成素β亞基；LH-R.促黃體生成素受體；FSH-R.促卵泡生成素受體；ER-α.雌激素α受體；β-actin.β-肌動蛋白

KiSS-1.KiSSpeptinencodinggene；GPR54.KiSSpeptinreceptorencodinggene；GnRH.Gonadotropin-releasinghormone；GnRH-R.Gonadotropin-releasinghormonereceptor；LH-β.Luteinizinghormoneβsubunit；FSH-β.Folliclestimulatinghormoneβsubunit；LH-R.Luteinizinghormonereceptor；FSH-R.Folliclestimulatinghormonereceptor；ER-α.Estrogenαreceptor；β-actin.β-myosin

2結(jié)果

2.1RNA完整性

M.RNA marker;1～4.總RNA樣品M.RNA marker;1-4.Tatol RNA samples圖1　總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳Fig.1　Total RNA electrophoresis with agarose gel(1%) image

1%瓊脂糖凝膠電泳顯示(圖1)，提取的總RNA樣品28S和18S條帶清晰，5S條帶基本可見，無DNA污染和降解，純度符合標準，可進行后續(xù)試驗。2.2血清激素含量

2.2.1雌鼠血清E2含量雌鼠血清E2含量如圖2A所示，箭頭表示免疫時間。fIG血清E2濃度在初次免疫后便急劇下降，6wpv時即處于檢測限附近，顯著低于Con(20.6～29.9pg·mL-1)(P<0.05)，并一直維持與OVX相同水平至48wpv，從52wpv時，E2含量出現(xiàn)微弱上升，至試驗結(jié)束(56wpv)時，仍然顯著低于Con(P<0.05)。OVX血清E2含量在0wpv時，即已處于極低水平，從2wpv開始低至不可測水平，顯著低于Con(P<0.05)。

2.2.2雌鼠血清P4含量雌鼠血清P4含量如圖2B所示，箭頭表示免疫時間。Con血清P4含量整個試驗期間保持較穩(wěn)定狀態(tài)，波動為15.97～21.91ng·mL-1。初次主動免疫后，fIG血清P4含量下降，加強免疫繼續(xù)快速下降，至28wpv時低至不可測水平，顯著低于Con(P<0.05)。與血清E2含量變化情況類似，OVX血清P4含量在0wpv時即已處于極低水平，從6wpv開始低至不可測水平，顯著低于Con(P<0.05)。

2.2.3血清FSH含量雌性大鼠血清FSH含量見圖2C，箭頭表示免疫時間。在整個試驗期間Con血清FSH含量維持平穩(wěn)，波動為3.19～4.28mIU·mL-1。主動免疫引起雌性大鼠血清FSH含量下降，初次免疫后，第2周開始便顯著低于Con(P<0.05)，從8wpv直至試驗結(jié)束時的56wpv，血清FSH含量一直保持在不可測的低水平。OVX血清FSH濃度從手術(shù)后開始升高，顯著高于Con(P<0.05)。

2.2.4血清LH含量雌性大鼠血清LH含量見圖2D，在整個試驗期間Con血清LH含量維持較平穩(wěn)狀態(tài)，在3.68～4.44mIU·mL-1波動。主動免疫引起雌性大鼠血清LH含量下降，初次免疫后，第2周開始便顯著低于Con(P<0.05)，從8～40wpv，血清LH含量一直保持在不可測的低水平。從44wpv開始，血清LH含量緩慢上升，但是至試驗結(jié)束時的56wpv，仍顯著低于Con(P<0.05)。OVX血清LH濃度從手術(shù)后開始升高，顯著高于Con(P<0.05)。

圖2　雌鼠血清E2(pg·mL-1)、P4(ng·mL-1)、FSH(mIU·mL-1)和LH(mIU·mL-1)含量變化Fig.2　Serum E2，P4，F(xiàn)SH and LH levels of female rats

綜上表明，主動免疫能顯著降低雌性大鼠血清E2、P4、FSH和LH含量，并能保持長達56wpv。

2.3下丘腦-垂體-性腺軸生殖相關(guān)基因mRNA表達變化

2.3.1下丘腦生殖相關(guān)基因mRNA表達變化下丘腦生殖相關(guān)基因表達變化情況如圖3a，試驗56wpv時，觀察到GnRH主動免疫顯著下調(diào)雌性SD大鼠下丘腦GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA表達(P<0.05)；外科去勢手術(shù)也同樣顯著下調(diào)下丘腦GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA的表達(P<0.05)。

2.3.2垂體生殖相關(guān)基因mRNA表達變化垂體生殖相關(guān)基因表達變化情況如圖3b，試驗56wpv時，觀察到與Con相比，GnRH主動免疫顯著下調(diào)雌性SD大鼠垂體GnRHR、FSH-β和LH-βmRNA表達(P<0.05)；而外科去勢手術(shù)顯著上調(diào)雌性SD大鼠垂體GnRHR、FSH-β和LH-βmRNA表達(P<0.05)。

2.3.3卵巢生殖相關(guān)基因mRNA表達變化卵巢生殖相關(guān)基因表達情況如圖3c所示，試驗56wpv時，觀察到GnRH主動免疫顯著下調(diào)雌性SD大鼠卵巢FSHR、LHR和ER-αmRNA表達情況(P<0.05)。

*.與空白組相比差異顯著Compared to intact controls，* donates a significant difference圖3　GnRH主動免疫對下丘腦、垂體和卵巢生殖相關(guān)mRNA表達水平的影響Fig.3　Effects of active immunization against GnRH on the mRNA expression levels of hypothalamic GnRH and ER-α

綜上所述，GnRH主動免疫對雌鼠生殖相關(guān)基因mRNA的表達調(diào)控有顯著的長期的影響：明顯下調(diào)下丘腦GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA、垂體GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA以及卵巢FSHR、LHR和ER-αmRNA表達水平。而外科去勢對雌鼠生殖相關(guān)基因mRNA表達調(diào)控有不同影響：顯著下調(diào)下丘腦GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA；顯著上調(diào)垂體GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA表達水平。

3討論

有研究結(jié)果表明，接受GnRH主動免疫的動物其血清促性腺激素及性激素濃度[4-6]均有降低。本研究也得到相似結(jié)果。P4和E2是由卵巢分泌的重要孕激素和雌激素，本研究中免疫雌鼠血清P4和E2含量均顯著低于空白組，顯示達到了很好的免疫去勢效果，這與GnRH主動免疫動物的研究結(jié)果一致[5，7]。并且，fIG和OVX血清P4和E2含量無顯著差異(P>0.05)，表明在進行GnRH主動免疫56wpv后，fIG保持與去卵巢大鼠一樣的去勢效果。GnRH主動免疫雌鼠后，血清FSH、LH、P4及E2含量與空白對照組相比顯著下降(P<0.05)，這與GnRH主動免疫動物的研究結(jié)果一致。

Kisspeptin-GPR54信號系統(tǒng)通過兩種方式調(diào)節(jié)GnRH來控制排卵周期，位于下丘腦前腹側(cè)室周核(AVPV)的kisspeptin神經(jīng)細胞引發(fā)產(chǎn)生GnRH分泌峰，繼而調(diào)控雌激素對GnRH的正反饋調(diào)節(jié)[8]；其余位于下丘腦ARC的kisspeptin神經(jīng)細胞則參與GnRH的產(chǎn)生和雌激素對GnRH分泌的負反饋調(diào)節(jié)[9]。有報道研究E2對小鼠前腦KiSS-1系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。位于弓狀核的KiSS-1基因，在卵巢切除的小鼠中表達升高，在卵巢切除后，雌激素替代治療的小鼠中表達降低：而位于前腹面室旁核的KiSS-1基因的表達正好與此相反。由此得出結(jié)論：位于弓狀核的KiSS-1神經(jīng)元可能在GnRH分泌的負反饋中起到一定作用，而位于AVPV的KiSS-l可能參與了GnRH分泌的正反饋調(diào)節(jié)，并且通過試驗證實E2對KiSS-1的效應(yīng)主要是通過ER-α介導(dǎo)的[10]。研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦GnRH信號的上調(diào)可促進垂體FSH和LH合成和分泌，提高血液P4、E2濃度，從而改善母鵝繁殖性能[11]。反之，GnRH信號的下調(diào)則抑制垂體FSH和LH的合成和分泌，與本研究結(jié)果一致。垂體FSH和LH的合成與分泌受下丘腦直接調(diào)控，GnRH主動免疫降低下丘腦GnRH含量[12-13]，繼而導(dǎo)致FSH和LH分泌減少。

去勢的雄性恒河猴模型，青春期組KiSS-1mRNA表達明顯高于少年組，但GPR54mRNA水平無差別；雌性恒河猴模型青春期組KiSS-1mRNA和GPR54mRNA水平都顯著高于少年組，表明KiSS-1受體和配體共同參與中樞神經(jīng)生殖內(nèi)分泌調(diào)控[14]。本研究也得到一致結(jié)論：GnRH主動免疫后，下丘腦GPR54和KiSS-1mRNA表達水平均顯著下降。

在垂體水平，本研究發(fā)現(xiàn)GnRG主動免疫56wpv后，GnRH-RmRNA和LH-βmRNA仍處于顯著低于Con的水平，而FSH-βmRNA表達開始上升，接近Con，二者表達量無顯著差異(P>0.05)。下丘腦正中隆起分泌的GnRH通過垂體門脈系統(tǒng)到達垂體前葉與GnRH-R結(jié)合產(chǎn)生生物學效應(yīng)，刺激FSH和LH的合成和釋放。有研究表明，對大鼠使用GnRH拮抗劑會下調(diào)垂體GnRH-RmRNA的數(shù)量[15]；另外，M.Lopot[16]等學者給母羊第三腦室灌注GnRH，觀察到腺垂體中GnRH-RmRNA含量升高。這些結(jié)果說明垂體GnRH-RmRNA的數(shù)目的穩(wěn)定維持需要GnRH激素參與，原因是GnRH的存在能夠刺激GnRH-RmRNA的表達或增加GnRH-RmRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。垂體GnRH-RmRNA的數(shù)目的穩(wěn)定維持需要GnRH激素參與，結(jié)合本研究結(jié)果可推測，主動免疫后，雌鼠下丘腦GnRH激素的分泌受到影響，至56wpv時，GnRH的分泌可能還未恢復(fù)至正常水平。

此外，GnRH主動免疫還顯著下調(diào)了卵巢FSH-RmRNA和LH-RmRNA的表達(P<0.05)，與前人研究成果一致[17]。由此可推斷GnRH主動免疫通過下調(diào)卵巢FSH-RmRNA和LH-RmRNA基因表達，降低卵巢FSH-R和LH-R數(shù)量，在性腺水平減弱甚至阻止FSH和LH對性腺自身發(fā)育的作用，達到去勢效果。本研究還表明，卵巢ER-αmRNA表達顯著低于空白組(P<0.05)，同樣是因為外周低含量的E2影響其受體mRNA的表達[18-20]。

本研究結(jié)果顯示，在進行主動免疫后的56wpv，雌性大鼠仍然保持很好的去勢狀態(tài)，這為將GnRH免疫去勢疫苗推廣到控制野生動物數(shù)量提供了較好的理論依據(jù)。由于野生動物在野外活動的不確定性[21]，為定時定點免疫造成了一定障礙。而本研究對雌性動物進行間隔僅一個月的兩次免疫即可造成長達一年的去勢狀態(tài)。若能在動物的發(fā)情期之前有針對地對動物進行免疫，可以保證動物順利度過發(fā)情期而不會導(dǎo)致懷孕。

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(編輯程金華)

RegulatoryMechanismsofActiveImmunizationagainstGnRHinFemaleRatsandItsMechanism

CAOXiao-han1，HANXing-fa1，DUXiao-gang1，CHENZhi-yu1，MENGFeng-yan1，CHUMing-xing2，ZENGXian-yin1*

(1.College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Key Laboratory of Farm Animal Genetic Resources and Germplasm Innovation of Ministry of Agriculture，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China)

Abstract:ToexploretheregulatorymechanismsofactiveimmunizationagainstGnRHinfemaleSDrats.24adultfemaleSDratswereallocatedto3groupsof8animalseachrandomly.8ratswereimmunizedagainstGnRHat12weekofage，4weekslateranequaldoseboosterwasadministered.8ratsweresurgicallyovarictomyat11weekofagewhile8intactratswithoutanytreatments.Bloodsampleswerecollectedatday0(0wpv)untiljustbeforesacrificedat56wpv.SerumlevelsofFSH，LH，E2andP4weredeterminedusingRIA.Aftersacrificed，hypothalamusandpituitarywereremoved，themRNAexpressionsofreproduction-relatedgenesweredeterminedbyreal-timefluorescencequantitativePCR(RT-PCR)；Ovarieswereexcised，adiposetissueswereremoved，thenthemRNAexpressionsforreproduction-relatedgenesweredeterminedbyRT-PCR.AfterimmunizationtwiceagainstGnRH，theconcentrationsofE2，P4，F(xiàn)SHandLHinimmunizedratsshowedasignificantlylowerthanthatinControlgroup(P<0.05).Moreover，activeimmunizationagainstGnRHsignificantlydown-regulatedthemRNAlevelsofGnRH，GPR54，KiSS1andER-αinthehypothalamus，GnRH-R，F(xiàn)SH-β and LH-βinthepituitary(P<0.05)，aswellasFSHR，LHRandER-αinovaries(P<0.05).ThisstudyindicatedGnRHhadexcellentimmunogenicandwasagoodalternativeofsurgicalcastration.ActiveimmunizationagainstGnRHcauseanimalsinalong-terminfertilityorsterilitybythefeedbackloopofER-α- GPR54/KiSS-1，andthefertilityofimmunocastratedratsshowatendancytorecover.

Keywords:GnRH；activeimmunization；regulatory；mechanisms；femalerat

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.011

收稿日期：2015-05-27

基金項目：四川省科技廳國際合作項目(2012HH0013)；四川農(nóng)業(yè)大學雙支計劃(00770107)

作者簡介：曹曉涵(1984-)，女，四川成都人，講師，博士，主要從事生殖免疫調(diào)控研究，E-mail：caoxiaohan2007@hotmail.com *通信作者：曾憲垠，研究員，主要從事動物生殖免疫調(diào)控研究，E-mail：xyzeng1966@163.com

中圖分類號：S852.4

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0502-07