徐　杰，趙為民，任守文，趙　芳，周艷紅，李惠俠，方曉敏*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所動(dòng)物品種改良和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014)

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CYP1A1與PPAR-γ在豬肺炎支原體感染炎性反應(yīng)調(diào)控中的作用關(guān)系

徐杰1，2，趙為民2，任守文2，趙芳2，周艷紅1，2，李惠俠1*，方曉敏2*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所動(dòng)物品種改良和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014)

摘要：為研究豬CYP1A1基因表達(dá)變化對(duì)肺炎支原體感染的影響，探討CYP1A1與過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)在肺炎支原體感染炎性反應(yīng)過程中的作用關(guān)系，通過基因克隆及真核表達(dá)載體構(gòu)建，獲得豬CYP1A1基因全長(zhǎng)編碼序列真核載體，借助細(xì)胞轉(zhuǎn)染和抗性篩選技術(shù)獲取穩(wěn)定表達(dá)CYP1A1基因的豬肺泡巨噬細(xì)胞系，構(gòu)建豬肺炎支原體細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分析炎癥反應(yīng)前后CYP1A1與PPAR-γ間的表達(dá)變化關(guān)系。結(jié)果顯示：在肺炎支原體感染PAM細(xì)胞的炎性反應(yīng)過程中，PPAR-γ與CYP1A1表達(dá)呈明顯的正相關(guān)，并參與炎癥調(diào)控，揭示豬肺炎支原體感染過程中CYP1A1基因可通過調(diào)控PPAR-γ發(fā)揮抑炎作用。

關(guān)鍵詞：豬；CYP1A1；PPAR-γ；支原體肺炎；炎癥反應(yīng)

細(xì)胞色素酶P450(CYP 450)是一組結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的超家族基因編碼酶系，主要參與機(jī)體外源性有害物質(zhì)、內(nèi)源活性物質(zhì)及攝入藥物的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化[1]。其亞家族成員CYP1A1主要編碼產(chǎn)物為芳香羥化酶，代謝底物為多環(huán)芳烴、芳香胺等[2]。作為前致癌物質(zhì)代謝活化的主要功能酶，CYP1A1在癌癥病變及腫瘤發(fā)生過程中的作用機(jī)制備受關(guān)注。近年來，在腫瘤惡化及相關(guān)疾病的臨床研究中發(fā)現(xiàn)P450酶在很多炎癥疾病發(fā)病過程中具有一定的活性變化，引起藥物代謝率的改變[3-4]。E.Paszti-Gere等[5]通過構(gòu)建肝腸體外模型發(fā)現(xiàn)LPS應(yīng)激構(gòu)成的肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)引起細(xì)胞色素酶P450家族的顯著差異表達(dá)，其中包括CYP1A1的下調(diào)；本團(tuán)隊(duì)在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，豬支原體肺炎感染豬與健康豬之間CYP1A1基因表達(dá)水平存在顯著差異，暗示CYP1A1可能通過某種調(diào)控途徑參與肺炎支原體感染炎癥反應(yīng)過程。

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)是由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子[6-7]，目前研究已表明它與炎癥反應(yīng)有較為密切的聯(lián)系，具有顯著的抑炎作用[8-10]。而且，PPAR-γ在細(xì)胞色素酶的介導(dǎo)途徑中也發(fā)揮一定作用，是細(xì)胞色素酶的五種誘導(dǎo)活化因子之一[11]。有研究發(fā)現(xiàn)芳香化酶敲除小鼠肝組織PPAR表達(dá)水平發(fā)生了變化，猜想PPAR與細(xì)胞色素酶的表達(dá)有關(guān)[12]，但PPAR-γ涉及的核內(nèi)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，在人、家禽方面的調(diào)控機(jī)制并未得到深入的研究，本課題在前期研究中也發(fā)現(xiàn)PPAR-γ與CYP1A1表達(dá)水平具有一定相關(guān)性。為探討CYP1A1在豬肺炎支原體感染炎癥反應(yīng)過程中的作用及分子途徑，作者通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CYP1A1的細(xì)胞系以及豬肺炎支原體細(xì)胞感染模型，監(jiān)測(cè)并分析炎癥反應(yīng)前后CYP1A1與PPAR-γ間的表達(dá)變化關(guān)系，為進(jìn)一步揭示豬支原體肺炎發(fā)生的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

梅山豬，由上海梅山豬保種場(chǎng)提供；豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21(PAM)及豬肺炎支原體(Mhp)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供；真核載體構(gòu)建相關(guān)試劑盒、單克隆抗體及基因工程酶系分別來自上海英駿公司、(大連)寶生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材及細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑分別來自南京維森特生物公司及上海前塵生物公司。

1.2方法

1.2.1CYP1A1基因克隆豬屠宰取肝組織樣，提取總RNA，2.2%甲醛變性凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測(cè)RNA純度及濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GenBank中豬CYP1A1基因cDNA序列(NCBI Reference Sequence：NM_214412.1)為模板設(shè)計(jì)引物(表1)，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，PrimerSTAR高保真酶擴(kuò)增CYP1A1基因，目的片段長(zhǎng)度1 572 bp；PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，20 ℃保持，擴(kuò)增結(jié)束后產(chǎn)物以1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1　相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增信息

劃線部分為酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基

The underlined bases are designed to protect the restriction site

1.2.2真核表達(dá)載體構(gòu)建目的片段回收純化后，使用Taq酶加A尾(PrimerSTAR高保真酶擴(kuò)增后為平末端)，經(jīng)與pMD-18-T載體連接，構(gòu)建PMD-18-T-CYP1A1克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆搖菌12 h，菌液PCR鑒定并測(cè)序。小量提取pMD-18-T-CYP1A1重組質(zhì)粒與pcDNA3.1/zeo(+)載體質(zhì)粒，XhoⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定并回收片段，T4酶連接CYP1A1基因片段與酶切后的pcDNA3.1/zeo(+)載體片段，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆搖菌12 h，小量提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，菌液PCR驗(yàn)證并測(cè)序鑒定，無內(nèi)毒素大量提取質(zhì)粒。

1.2.3CYP1A1過表達(dá)細(xì)胞系的建立制備100、150、200、250、300 μg·mL-1的Zeocin篩選培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)PAM，選取10～14 d將PAM完全殺死的濃度為Zeocin篩選濃度。將正常PAM接種于六孔板并培養(yǎng)至貼壁程度達(dá)到80%，用轉(zhuǎn)染試劑LipofectmineTM2000分別將pcDNA3.1/zeo(+)-CYP1A1質(zhì)粒、pcDNA3.1/zeo(+)質(zhì)粒以每孔2.5 μL轉(zhuǎn)染入PAM，用RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，Zeocin篩選培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞大量死亡，并有抗性克隆出現(xiàn)時(shí)，減半濃度維持培養(yǎng)，將抗性克隆逐漸篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)，至傳代穩(wěn)定后RT-PCR，Western blot檢驗(yàn)CYP1A1基因表達(dá)，構(gòu)建成功的CYP1A1過表達(dá)PAM細(xì)胞系備用。

1.2.4Mhp感染PAM及PPAR-γ表達(dá)監(jiān)測(cè)分別用Mhp菌液感染貼壁程度達(dá)到80%的CYP1A1過表達(dá)PAM(記為過表達(dá)組)、pcDNA3.1/zeo(+)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(記為空載組)，正常PAM(記為正常組)，每孔500 mL Mhp菌液和1 000 mL無雙抗RPMI1640培養(yǎng)液。感染后0、4、12、24、48 h時(shí)收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄，豬肺炎支原體P36基因PCR擴(kuò)增鑒定感染效果；以HPRT基因?yàn)閮?nèi)參，RT-PCR監(jiān)測(cè)各組細(xì)胞PPAR-γ表達(dá)變化，相關(guān)引物及擴(kuò)增信息如表1。相對(duì)定量2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因表達(dá)水平，SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05和P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1CYP1A1基因克隆及真核載體構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1A，目的片段濃度高、特異性好，可用作后續(xù)試驗(yàn)。菌液PCR電泳結(jié)果如圖1B，陽(yáng)性克隆條帶清晰，特異性好，經(jīng)與GenBank中CYP1A1序列測(cè)序比對(duì)，相似性達(dá)99%。菌液提取質(zhì)粒后雙酶切電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后形成兩條帶，一條為目的條帶(1 572 bp)，一條為pMD18-T載體條帶(2.9 kb)，如圖1C。

連接后的真核載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/zeo-CYP1A1經(jīng)NotⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，電泳結(jié)果如圖2：雙酶切后出現(xiàn)兩條帶，一條為CYP1A1(1 572 bp)，一條為pcDNA3.1(+)/zeo載體條帶；分別單酶切后形成一條帶。菌液測(cè)序結(jié)果與之前測(cè)序結(jié)果基本一致，證明CYP1A1與pcDNA3.1(+)/zeo連接正確。

A.CYP1A1基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，1泳道為成功擴(kuò)增的CYP1A1條帶；B.重組pMD18-T-CYP1A1菌液PCR鑒定示例；C.重組質(zhì)粒雙酶切后電泳示例，M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，Marker左右兩側(cè)條帶均為重組質(zhì)粒雙酶切后條帶A.RT-PCR result of porcine CYP1A1 gene，land 1 is the amplified products of CYP1A1 band；B.PCR identification of recombinant pMD18-T-CYP1A1 vector；C.Double digestion result of recombinant plasmid，M.DNA marker，both sides of the Marker are band of double digestion result of recombinant plasmid圖1　目的基因擴(kuò)增及克隆載體構(gòu)建鑒定Fig.1　RT-PCR result of porcine CYP1A1 gene and identification of recombinant cloning vector

2.2CYP1A1過表達(dá)細(xì)胞系的建立

PAM經(jīng)過不同濃度的Zeocin篩選培養(yǎng)液處理后均開始大量死亡，其中Zeocin含量在250 μg·mL-1條件下，PAM細(xì)胞于14 d全部死亡，故確定最佳Zeocin篩選質(zhì)量濃度為250 μg·mL-1，該質(zhì)量濃度用于后續(xù)抗性克隆的篩選。

抗性克隆細(xì)胞篩選、收集并提取DNA 后，RT-PCR檢測(cè)到了CYP1A1的表達(dá)(圖3 A)，且過表達(dá)組亮度明顯高于正常組；Western blot法檢測(cè)結(jié)果(圖3B)也表明：重組細(xì)胞系的CYP1A1基因相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常細(xì)胞和空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞，灰度差異較為明顯，說明重組基因成功整合到PAM細(xì)胞。

2.3Mhp感染PAM及PPAR-γ表達(dá)監(jiān)測(cè)

肺炎支原體感染后，各處理組細(xì)胞隨時(shí)間推移大量死亡，但形態(tài)無明顯變化(圖4)，間接說明Mhp感染活性較好。針對(duì)Mhp感染的P36鑒定瓊脂糖電泳顯示：各處理組細(xì)胞均檢測(cè)到427 bp的P36基因表達(dá)，條帶亮，濃度高(圖5)，表明Mhp對(duì)PAM感染成功。

A.重組細(xì)胞系RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，泳道1為重組細(xì)胞PCR擴(kuò)增片段(過表達(dá))，泳道2為正常細(xì)胞PCR擴(kuò)增片段，M為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；B.Western blot灰度值效果圖，1、2組為空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞，3組為正常細(xì)胞，4～6組為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞A.The identification result of recombinant cell lines by RT-PCR，1 land is the amplified PCR products of recombinant cell (over-expression)，2 land is the amplified PCR products of normal group，M is the DNA marker；B.The picture of grey level of Western blot，1-2 is the blank transfection of cell group，3 is the normal cell group，4-6 is the recombinant plasmid transfection of cell group圖3　轉(zhuǎn)染效果的鑒定Fig.3　The identification of transfection efficiency

圖4　Mhp感染后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞變化Fig.4　Cells changes at different times after Mhp stimulation

1～4.感染后4、12、24、48 h收集的正常組細(xì)胞；5～8.感染后4、12、24、48 h收集的過表達(dá)組細(xì)胞；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1-4.The collection of normal cell group at 4，12，24，48 h after infection；5-8.The collection of over-expression cell group at 4，12，24，48 h after infection；M.DNA marker圖5　Mhp感染PAM細(xì)胞效果的PCR鑒定Fig.5　PCR identification of PAM cell after Mhp infection

與對(duì)照組相比，*.差異顯著(0.01

各組細(xì)胞感染Mhp后PPAR-γ表達(dá)監(jiān)測(cè)顯示：與未感染細(xì)胞相比，過表達(dá)組、空載組、正常組PPAR-γ表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上調(diào)，但不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞PPAR-γ表達(dá)水平存在顯著差異(圖6)，且在感染過程中上調(diào)時(shí)間先后也存在顯著差異，其中，過表達(dá)組細(xì)胞(24 h)較空載組、正常組細(xì)胞(12 h)出現(xiàn)極顯著上調(diào)的時(shí)間晚，在感染0～48 h的時(shí)間段內(nèi)，過表達(dá)組細(xì)胞PPAR-γ的表達(dá)量均顯著高于空載組和正常組(P<0.05)，其中0、24、48 h表現(xiàn)為差異極顯著(P<0.01)，表明CYP1A1與PPAR-γ的表達(dá)量呈正相關(guān)。在炎癥反應(yīng)過程中，PPAR-γ的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著變化，表明PPAR-γ參與了炎癥調(diào)控，過表達(dá)組、空載組及正常組PPAR-γ上調(diào)敏感度及峰值水平有顯著差異，表明炎癥程度可能不同。

3討論

運(yùn)用真核載體轉(zhuǎn)染技術(shù)定向改變目標(biāo)基因的表達(dá)水平是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的常用方法。作者參考劉旺根[13]的真核載體構(gòu)建方案，根據(jù)豬CYP1A1基因的酶切位點(diǎn)及真核載體pcDNA3.1/zeo(+)的多克隆位點(diǎn)，選用了合適的限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NotⅠ完成了載體與目的基因的連接，在PCR擴(kuò)增方案上，提前添加酶切位點(diǎn)，形成特異性的黏性末端以保證CYP1A1基因的定向克隆，避免了反序連接而導(dǎo)致目的基因表達(dá)受阻。本試驗(yàn)選用的豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21細(xì)胞是豬病毒學(xué)和免疫學(xué)常用的細(xì)胞，該細(xì)胞由PSV3neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染而獲得傳代能力，本身攜帶新霉素(neo)抗性基因和SV40大T抗原，故選用博來霉素(Zeocin)作為抗性克隆篩選實(shí)際，以攜帶Zeocin抗性的pcDNA3.1/zeo(+)作為真核載體成功構(gòu)建了CYP1A1過表達(dá)細(xì)胞系。

PPAR-γ核內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與炎癥反應(yīng)有著直接和間接的聯(lián)系，它能夠與配體復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CBP和p300等核內(nèi)轉(zhuǎn)錄輔助因子，形成對(duì)NF-κB等炎癥活化因子的抑制作用[14-16]，也能通過蛋白質(zhì)之間的相互作用抑制T淋巴細(xì)胞在炎癥過程中的活化，其中包括對(duì)NFAT等途徑的抑制作用[16]，NF-κB、NFAT等炎癥活化因子調(diào)控著單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌相關(guān)炎性細(xì)胞因子并在靶組織發(fā)揮作用[17-18]。本試驗(yàn)通過構(gòu)建豬肺炎支原體體外感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)PPAR-γ在不同CYP1A1表達(dá)水平情況下的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明CYP1A1的表達(dá)能夠影響PPAR-γ的表達(dá)，而PPAR-γ的表達(dá)又抑制了炎癥反應(yīng)，因此推測(cè)在炎癥反應(yīng)過程中，CYP1A1對(duì)PPAR-γ表達(dá)水平的影響會(huì)間接對(duì)炎癥反應(yīng)構(gòu)成調(diào)控。但也不排除CYP1A1通過上游通路AhR(芳香烴受體)途徑影響炎癥活化因子MAPK等的活化[19-20]，使它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的活化水平發(fā)生變化，并通過核內(nèi)的競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)節(jié)間接調(diào)控PPAR-γ的表達(dá)。由于涉及的信號(hào)通路較為復(fù)雜，且相關(guān)介導(dǎo)途徑的信號(hào)級(jí)聯(lián)、反饋機(jī)制尚不清楚，具體的調(diào)控機(jī)制還有待研究。

通過構(gòu)建豬肺炎支原體細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，作者推測(cè)在豬肺炎支原體感染過程中CYP1A1基因可能通過調(diào)控PPAR-γ來發(fā)揮抑炎作用。

作為機(jī)體藥物代謝功能酶，細(xì)胞色素P450酶在炎癥過程中的活性變化會(huì)直接影響到炎癥程度、炎癥臨床用藥的代謝率、毒性、安全性及臨床診斷效果，因此研究細(xì)胞色素P450酶活性與炎癥之間的關(guān)系，能為控制炎癥臨床反應(yīng)及治療提供一定的科學(xué)啟示，也能夠揭示細(xì)胞色素酶在炎癥反應(yīng)過程的活性變化導(dǎo)致底物的代謝異常從而誘導(dǎo)其他疾病的機(jī)制，深入分析疾病與疾病之間的關(guān)聯(lián)。

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(編輯白永平)

Interaction Effect ofCYP1A1 andPPAR-γin the Regulation of Inflammation of Mycoplasma Pneumonia in Swine

XU Jie1，2，ZHAO Wei-min2，REN Shou-wen2，ZHAO Fang2，ZHOU Yan-hong1，2，LI Hui-xia1*，F(xiàn)ANG Xiao-min2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnolgy，NanjingAgricultureUniversity，Nanjing210095，China；2.TheKeyLaboratoryofAnimalBreedImprovementandReproduction，InstituteofAnimalScience，JiangsuAcademyofAgricultureSciences，Nanjing210014，China)

Abstract:In order to study the effect ofCYP1A1 expression change inMycoplasmahyopneuminiaeinfection and to investigate the association betweenCYP1A1 and peroxisome proliferator-activated receptors associated-γ (PPAR-γ)，we obtained the full-length coding sequence ofCYP1A1 by means of cloning and eukaryotic expression vector construction method，established PAMs cell lines that stably expressedCYP1A1 by method of cell-transfection and resistance screening techniques，constructed cell experimental model infection withMycoplasmahyopneuminiaeand analyzed the relationship of the expression level ofPPAR-γandCYP1A1.The results show that the expression level ofPPAR-γis positively correlated withCYP1A1 and is involved in the regulation of inflammation，which suggest thatCYP1A1 may play a role in suppressing inflammation by regulatingPPAR-γ.

Key words:pig；CYP1A1；PPAR-γ；mycoplasma pneumonia；inflammatory

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.021

收稿日期：2015-05-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301953)；國(guó)家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-36)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20131332)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX(14)5033]

作者簡(jiǎn)介：徐杰(1990-)，男，湖北黃岡人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，Tel：025-84391941，E-mail：940872282@qq.com *通信作者：方曉敏，副研究員，主要從事豬抗病育種方面的科研及技術(shù)推廣工作，E-mail：fxmw2000@163.com；李惠俠，副教授，主要從事家畜遺傳育種與繁殖研究，E-mail：lihuixia@njau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S852.62

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)03-0574-07