李　欣，李中改，張小藝，周送桂，王玉坤，馮　將，易　瓊，王　魯*

(1.貴州大學 貴州省生化工程中心，貴陽 550025；2.貴州大學 動物科學學院，貴陽 550025；3.貴州大學 藥學院，貴陽 550025)

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金英黃歸湯對LPS介導乳腺上皮細胞TLR4信號通路中相關因子的影響

李欣1，2，李中改1，2，張小藝1，2，周送桂1，3，王玉坤1，2，馮將1，2，易瓊1，王魯1*

(1.貴州大學 貴州省生化工程中心，貴陽 550025；2.貴州大學 動物科學學院，貴陽 550025；3.貴州大學 藥學院，貴陽 550025)

摘要：為了評價金英黃歸湯抗LPS致炎的作用機制，作者采用ELISA法檢測金英黃歸湯對細胞分泌細胞因子TNF-α、IL-8的影響，采用qPCR法研究藥物對TLR4通路中IL-1受體相關激酶-1(IRAK-1)、腫瘤壞死因子受體6(TRAF-6)、轉化生長因子激活激酶(TAK-1)、NF-κB誘導激酶(NIK)、抑制性NF-κB(IκB) mRNA的轉錄影響。結果顯示，金英黃歸湯低劑量組(39.1 μg·mL-1)、中劑量組(391 μg·mL-1)、高劑量組(3 910 μg·mL-1)能顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)減少LPS介導的TNF-α和IL-8分泌；能顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)減少LPS介導的IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、IκB、NIKmRNA的轉錄。結果提示，金英黃歸湯通過抑制小鼠MECs 的TLR4/NF-κB信號通路中IRAK-1/TRAF-6/TAK-1/NIK途徑的活化來控制炎性因子的釋放而發(fā)揮抗炎作用，而不是通過IRAK-1/TRAF-6/TAK-1/IκB途徑實現的，這可能是金英黃歸湯的抗炎機制。

關鍵詞：金英黃歸湯；LPS；乳腺上皮細胞；TLR4信號；mRNA轉錄

在免疫細胞研究中Toll樣受體(TLRs)能啟動和調節(jié)機體炎癥和免疫反應[1]，且TLR4是TLRs家族中研究最多的一種，它在脂多糖(LPS)介導的TLR4的途徑中有激活髓樣分化因子88(MyD88)、IL-1受體相關激酶-1(IRAK-1)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF-6)、NF-κB抑制酶(IκB) 或NF-κB誘導激酶(NIK)相關因子參與信號的傳導[2]，最終使NF-κB轉移至核內啟動相關基因的轉錄，細胞分泌前炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-8、IL-6等。前期研究發(fā)現小鼠MECs細胞膜上存在TLR2和TLR4受體，TLR4是小鼠MECs上LPS介導細胞因子TNF-α、IL-8分泌的主要受體[3]。

近年來有大量研究報道中藥復方、中藥提取物及中藥有效成分對TLR4/NF-κB信號通路具有調節(jié)作用，并用以探討中藥對相關疾病治療的分子基礎[4-6]。前期研究發(fā)現金英黃歸湯具有良好的抗炎作用[7]，對金黃色葡萄球菌所致乳房炎家兔血清及乳汁中IL-6和TNF-α的分泌也有顯著的抑制作用[8]。在此基礎上，本試驗以LPS刺激小鼠MECs，研究金英黃歸湯對TLR4/NF-κB信號通路的IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、IκB、NIKmRNA轉錄的影響，旨在研究金英黃歸湯的抗炎機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

SPF級3月齡的妊娠中期昆明小白鼠，體重35 g±5 g，購自解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心[動物許可證號：SCXK(渝) 2012-0003]，在貴州大學貴州省生化工程中心SPF級動物實驗室[動物許可證號：SYXK(黔) 2013-0001]飼養(yǎng)。

1.2主要藥物

金英黃歸湯中金銀花、蒲公英、連翹、大黃、黃芪、當歸、瓜萎、芙蓉花8味中藥，購于貴陽市同濟堂藥店(中藥GMP認證號：黔J0190)，按文獻[8]制備成生藥濃度為1 g·mL-1，0.22 μm濾膜過濾除菌。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清，Thermo scientific公司；小鼠表皮生長因子，SAB公司；胰島素、霍亂毒素CT、L-谷氨酰胺、LPS，Sigma公司；Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶，Solarbio公司；Trypsin-EDTA，Invitrogen公司；Mouse TNF-α and IL-8 ELISA試劑盒，IBL公司。TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒，北京TIANGEN生物技術有限公司；動物組織/細胞RNA提取試劑盒，2×EsTaq MasterMix，北京康為世紀生物科技有限公司；Power SYBR Green PCR Master Mix，AB公司；注射用青霉素鈉和硫酸鏈霉素，華北制藥股份有限公司；氫化可的松，天津藥業(yè)焦作有限公司；無水乙醇、氯仿、甲醛、異丙醇，均為國產化學純試劑。

1.4主要實驗儀器

ThermoFisher 8000儲水型CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermo公司；MultiskanGo型全波段酶標儀，Thermo公司；qTOWER實時熒光定量RT-PCR儀，德國jena公司；T100 Thermal Cycler溫度梯度PCR儀，GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD公司。

1.5金英黃歸湯對LPS介導小鼠MECs分泌IL-8和TNF-α的影響

參照文獻方法[3]制備小鼠MECs，將500 μL 5×104·mL-1的細胞懸液加入24孔板中，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，及時換液，當MECs生長融合成單層細胞時，隨機分為5組：空白對照組、LPS刺激組、金英黃歸湯低劑量組、金英黃歸湯中劑量組、金英黃歸湯高劑量組。各組分別以下列方法干預：空白對照組：只加MECs培養(yǎng)液500 μL。LPS刺激組：含有10 μg·mL-1LPS(終質量濃度)MECs培養(yǎng)液500 μL。金英黃歸湯低劑量組：加入含有10 μg·mL-1LPS+39.1 μg·mL-1(終質量濃度)金英黃歸湯的MECs培養(yǎng)液500 μL。金英黃歸湯中劑量組：加入含有10 μg·mL-1LPS+391 μg·mL-1(終質量濃度)金英黃歸湯的MECs培養(yǎng)液500 μL，金英黃歸湯高劑量組：加入含有10 μg·mL-1LPS+3 910 μg·mL-1(終質量濃度)金英黃歸湯的MECs培養(yǎng)液500 μL。在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細胞。取每孔上清液，按照ELISA試劑盒說明書方法分別測定其IL-8和TNF-α的分泌量。

1.6金英黃歸湯對LPS介導小鼠MECs中IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK、IκBmRNA轉錄的影響

按上述方法制備細胞及給藥，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細胞。使用動物組織/細胞RNA提取試劑盒提取各組細胞的RNA，并檢測其純度與濃度，檢測合格后，盡快用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒將提取的RNA逆轉錄，并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩RAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK、IκB基因序列從GenBank獲得，使用Primer 5.0設計引物(表1)，由上海生工合成。以GAPDH為內參基因，采用梯度PCR技術檢測各基因的最佳退火溫度(表1)。

10 μL反應體系中，加入5 μL SYBR Green，2 μL模板cDNA，0.8 μL引物，用無RNase的水補充體積至10 μL。然后進行PCR反應和熒光測定。熒光定量RT-PCR反應程序：95 ℃預熱5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度(表1)30 s，72 ℃延伸30 s，自變性開始三步為一個循環(huán)，共設40個循環(huán)；72 ℃延伸2 min，使產物延伸完全。反應結束后自50 ℃至95 ℃繪制熔解曲線。測定結果用2-ΔΔCt的方法計算得到各組mRNA的轉錄量。

表1　qPCR 的引物序列及退火溫度

1.7統(tǒng)計學處理

2結果

2.1金英黃歸湯對LPS介導小鼠MECs分泌IL-8和TNF-α的影響

試驗結果顯示，與空白組相比，LPS刺激組的IL-8分泌量極顯著升高(P<0.01)，金英黃歸湯低、中、高劑量組IL-8的分泌量差異不顯著(P>0.05)；與LPS刺激組比較，金英黃歸湯低、中、高劑量組IL-8的分泌量分別顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)降低，且細胞分泌IL-8的分泌量與中藥濃度呈一定的量效關系，隨著中藥濃度的增加而減少，并回到空白組水平，結果見圖1。

**.與空白組相比，P<0.01； #，##.與LPS組相比，P<0.05，P<0.01。下同**.Compared with control，P<0.01; #，##. Compared with LPS，P<0.05，P<0.01.The same as below圖1　金英黃歸湯對MECs分泌IL-8的影響Fig.1　Influence of JYT on IL-8 of MECs culture supernatants

試驗結果顯示，與空白組相比，LPS刺激組TNF-α的分泌量顯著升高(P<0.05)，金英黃歸湯低、中、高劑量組TNF-α的分泌量差異不顯著(P>0.05)；與LPS刺激組比較，金英黃歸湯低、中、高劑量組TNF-α的分泌量則分別極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)降低，且也回到空白組水平，結果見圖2。

圖2　金英黃歸湯對MECs分泌TNF-α的影響Fig.2　Influence of JYT on TNF-α of MECs culture supernatants

2.2金英黃歸湯對LPS導致小鼠MECs中IRAK-1 mRNA轉錄的影響

與空白組相比，LPS刺激組IRAK-1 mRNA轉錄量極顯著上升(P<0.01)，金英黃歸湯低劑量組的轉錄量也顯著上升(P<0.05)，但金英黃歸湯中、高劑量組的轉錄量下降，且差異不顯著(P>0.05)；與LPS刺激組相比，金英黃歸湯各劑量組均極顯著下調IRAK-1的轉錄(P<0.01)，IRAK-1 mRNA的轉錄量與中藥濃度呈一定的量效關系，隨著中藥濃度的增加而減少，且回到空白組水平，結果見圖3。

圖3　金英黃歸湯對MECs IRAK-1 mRNA轉錄的影響Fig.3　Influence of JYT on IRAK-1 mRNA expression in MECs

2.3金英黃歸湯對LPS導致小鼠MECs中TRAF-6 mRNA轉錄的影響

圖4　金英黃歸湯對MECs TRAF-6 mRNA轉錄的影響Fig.4　Influence of JYT on TRAF-6 mRNA expression in MECs

與空白組相比，LPS刺激組TRAF-6 mRNA轉錄量極顯著上升(P<0.01)，金英黃歸湯低濃度組的轉錄量也極顯著上升(P<0.01)，但金英黃歸湯中、高濃度組的轉錄量差異不顯著(P>0.05)；與LPS刺激組相比，金英黃歸湯各劑量組均極顯著下調TRAF-6的轉錄(P<0.01)，TRAF-6 mRNA的轉錄量與中藥濃度呈一定的量效關系，隨著中藥濃度的增加而減少，且回到空白組水平，結果見圖4。

2.4金英黃歸湯對LPS導致小鼠MECs中TAK-1 mRNA轉錄的影響

與空白組相比，LPS刺激組TAK-1 mRNA轉錄量極顯著上升(P<0.01)，金英黃歸湯低劑量組的轉錄量差異不顯著(P>0.05)，但金英黃歸湯中、高濃度組的轉錄量極顯著下調(P<0.01)；與LPS刺激組相比，金英黃歸湯各劑量組均極顯著的下調TAK-1的轉錄(P<0.01)，TAK-1 mRNA的轉錄量與中藥濃度呈一定的量效關系，結果見圖5。

圖5　金英黃歸湯對MECs TAK-1 mRNA轉錄的影響Fig.5　Influence of JYT on TAK-1 mRNA expression in MECs

2.5金英黃歸湯對LPS導致小鼠MECs中NIKmRNA轉錄的影響

與空白組相比，LPS刺激組NIKmRNA轉錄量極顯著上升(P<0.01)，金英黃歸湯低劑量組的轉錄量也極顯著上升(P<0.01)，但金英黃歸湯中、高濃度組的轉錄量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)下調；與LPS刺激組相比，金英黃歸湯低濃度組則極顯著上調NIK的轉錄(P<0.01)，而中、高濃度組均極顯著下調NIK的轉錄(P<0.01)。NIKmRNA的轉錄量與中藥濃度呈一定的量效關系，結果見圖6。

圖6　金英黃歸湯對MECs NIK mRNA轉錄的影響Fig.6　Influence of JYT on NIK mRNA expression in MECs

2.6金英黃歸湯對LPS導致小鼠MECs中IκBmRNA轉錄的影響

與空白組相比，LPS刺激組、金英黃歸湯各濃度組IκBmRNA轉錄呈極顯著下調(P<0.01)，與LPS刺激組相比，金英黃歸湯各濃度組均顯著或極顯著的下調IκB的轉錄(P<0.05，P<0.01)。結果詳見圖7。

3討論

MECs在病原微生物侵入乳腺時，能分泌細胞調節(jié)因子，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α[9-10]，這些活性成分對乳腺炎的發(fā)生與病程發(fā)展起重要作用，它們能趨化中性粒細胞進入乳腺感染區(qū)，抵抗病原菌的感染[11]，這對疾病的控制是有利的，但細胞受致炎因子刺激，機體過度活化后影響了其正常的功能，從這角度來說對機體是不利的，所以減少致炎因子所致細胞因子分泌更具有科學意義。本試驗結果進一步證實了LPS可以導致小鼠MECs分泌IL-8和TNF-α[3]，更重要的是發(fā)現適宜濃度的金英黃歸湯可抑制LPS所致小鼠MECs分泌IL-8和/或TNF-α，這為金英黃歸湯對抗LPS的生物活性提供了數據，為進一步研究金英黃歸湯在LPS導致信號通路的研究打下基礎。

LPS是TLR4的天然配體，在免疫細胞上的TLR4接受LPS刺激后，將信號轉到細胞內，可激活MyD88依賴和非依賴的TLR4信號通路[2]，MyD88依賴途徑是MyD88和MyD88樣接頭蛋白(MAL)聚集到TLR4形成受體復合體。IRAK-1和IRAK-4與該受體復合物結合后，引起IRAK-1的磷酸化，使其從受體復合體上解離，并結合活化TAK-1結合蛋白1(TAB1)和TAB2以及TRAF-6并使其活化。活化的TRAF-6激活NF-κB轉移至核內啟動相關基因的轉錄最終細胞分泌前炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-8、IL-6等。前期研究發(fā)現金英黃歸湯能降低LPS刺激小鼠MECs后TLR4、MyD88的mRNA的轉錄[12]。為了進一步研究金英黃歸湯對TLR4信號通路中從MyD88之后起至NF-κB段相關因子的影響，設計了本試驗。試驗結果顯示，LPS刺激小鼠MECs后，IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK都極顯著的升高，IκB極顯著的降低，說明小鼠MECs的TLR4信號傳導與免疫細胞的信號傳導途徑是一致的，這為TLR4信號通路的研究增加了MECs的研究數據。結果還顯示，金英黃歸湯能降低LPS刺激小鼠MECs后IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK的mRNA的轉錄，這說明金英黃歸湯抑制LPS所致小鼠MECs分泌IL-8和/或TNF-α的機制之一可能是抑制TLR4信號通路中IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK的轉錄。

NF-κB激活的經典途徑是抑制IκB而實現，NF-κB激活的非經典途徑通過NIK實現的[13]。試驗結果證實了LPS能導致小鼠MECs的IκB的mRNA轉錄極顯著下降，NIK的mRNA轉錄極顯著上升，這可推斷LPS是通過IκB途徑和或NIK途徑活化NF-κB。試驗結果發(fā)現金英黃歸湯能顯著促進LPS介導小鼠MECs的IκB的mRNA轉錄下降，極顯著抑制的NIKmRNA轉錄上升，我們推測金英黃歸湯可能是從NIK途徑而不是從IκB途徑減少NF-κB活化，最終降低細胞分泌細胞因子。NF-κB是核轉錄因子，由于影響其活性及活化有多條途徑，金英黃歸湯對NF-κB活性及活化如何有待進一步深入研究。

4結論

MECs在病原微生物侵入乳腺時，能分泌細胞調節(jié)因子，如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α，這對乳腺炎的發(fā)生與病程發(fā)展起重要作用，中藥復方金英黃歸湯可抑制LPS所致小鼠MECs分泌IL-8和/或TNF-α，其機制是抑制LPS介導的TLR4信號通路中IRAK-1、TRAF-6、TAK-1、NIK的mRNA轉錄。并可能從NIK途徑而不是從IκB途徑減少NF-κB活化，最終降低細胞分泌細胞因子。

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(編輯白永平)

Effects of Jin-Ying-Tang on Correlated Molecules of Toll-like Receptor 4 Signaling of LPS-Induced Mouse Mammary Epithelial Cellsinvitro

LI Xin1，2，LI Zhong-gai1，2，ZHANG Xiao-yi1，2，ZHOU Song-gui1，3，WANG Yu-kun1，2，FENG Jiang1，2，YI Qiong1，WANG Lu1*

(1.BiochemistryEngineeringCenterofGuizhouProvince，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.CollegeofAnimalScience，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；3.CollegeofPharmacy，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China)

Abstract:The study was conducted to investigate the effects of Jin-Ying-Tang (JYT) on correlated molecules of TLR4/NF-κB signaling of LPS-stimulated mouse mammary epithelial cells(MECs)invitroand explore its underlying molecular mechanisms.ELISA was performed to detect changes of the content of IL-8 and TNF-α in the culture supernatants.The mRNA transcription of TLR4-NF-κB signaling molecules such as IL-1 receptor-associated kinase-1(IRAK-1)，tumour necrosis factor receptor associated factor 6(TRAF-6)，Transforming Growth Factor activated kinase 1(TAK-1)，NF-κB inducing kinase(NIK)，Inhibitor of κB(IκB) were determined by qRT-PCR.The results showed that JYT could significantly decrease the expression of IL-8 and TNF-α in LPS-stimulated MECs(P<0.05，P<0.01)；what’s more，JYT could down-regulate the expression ofIRAK-1，TRAF-6，TAK-1，IκB，NIKmRNA activated by LPS(P<0.05，P<0.01).It is concluded that JYT attenuates LPS-induced inflammatory response in MECs by inhibiting the activitation of IRAK-1/TRAF-6/TAK-1/NIK pathway，but not of IRAK-1/TRAF-6/TAK-1/IκB pathway.

Key words:Jin-Ying-Tang；LPS；mammary epithelial cells；TLR4/NF-κB signaling；mRNA expression

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.026

收稿日期：2015-08-12

基金項目：國家自然科學基金項目(31260618；31470128)；北京農學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室開放課題

作者簡介：李欣(1991-)，男，吉林通化人，碩士生，主要從事中藥藥理學研究，E-mail：690079602@qq.com *通信作者：王魯(1970-)，教授，博士，主要從事中獸醫(yī)學及中藥藥理學研究，E-mail：wanglu7007@163.com

中圖分類號：S853.9

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0609-06