賈文超，劉亮亮，吳賢鋒，趙釗艷，王　珂，王　毛，高　靜，

王立強1，陳　宏1，潘傳英1，藍賢勇1*

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院/生命科學學院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室，楊凌 712100；2.江蘇科技大學 計算機科學與工程學院，鎮(zhèn)江 212003)

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山羊STAT3基因克隆、生物信息學分析及甲基化修飾研究

賈文超1#，劉亮亮2#，吳賢鋒1，趙釗艷1，王珂1，王毛1，高靜1，

王立強1，陳宏1，潘傳英1，藍賢勇1*

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院/生命科學學院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室，楊凌 712100；2.江蘇科技大學 計算機科學與工程學院，鎮(zhèn)江 212003)

摘要：本研究利用RT-PCR、TA克隆和重亞硫酸鹽測序(BSP)等方法，旨在克隆、分析山羊STAT3基因完整編碼區(qū)，并解析該基因甲基化修飾水平及其與體重的關系。結果表明，山羊STAT3基因編碼區(qū)全長2 313 bp，編碼770個氨基酸；與綿羊、牛、野豬、小鼠、大鼠和人的氨基酸序列一致性分別為99.7%、99.6%、99.4%、99.2%、99.4%和99.5%。山羊高體重組與低體重組之間甲基化差異研究發(fā)現(xiàn)，高體重組STAT3基因啟動子區(qū)甲基化水平顯著高于低體重組(P=0.020)，提示該基因甲基化修飾對體重具有顯著影響，可作為標記輔助選擇(MAS)的有效表觀遺傳標記。這些結果為研究山羊肉用性能的遺傳與表觀遺傳機制提供了科學資料。

關鍵詞：山羊；STAT3基因；分子克隆；序列分析；DNA甲基化

羊肉較豬肉更細嫩，而且脂肪與膽固醇含量更少，為此，近年來，羊肉越來越受到消費者的青睞。當前，進一步提升山羊產(chǎn)肉性能已成為現(xiàn)代養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的關鍵問題，故對山羊產(chǎn)肉調(diào)控機制進行研究顯得極其重要。目前，關于山羊產(chǎn)肉調(diào)控的表觀遺傳機制的研究很少，其中山羊重要基因表觀遺傳修飾的研究則更是鮮見報道[1]。

信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子(STATs)是一類活化后能轉(zhuǎn)入細胞核、并與相應DNA結合的蛋白家族，具有信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的雙重功能[2]。STATs家族包括7個成員，即STAT1-STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6，均含有SH2同源結構域和C端酪氨酸磷酸化位點[2]。作為STATs家族成員之一，STAT3 于1994年作為白細胞介素-6(IL-6)信號傳遞中的急性期反應因子(APRF) 被純化，它在調(diào)節(jié)肝急性期蛋白和抑制單核細胞生長等方面具有重要作用[3-5]，不僅能調(diào)節(jié)細胞自噬[6]，還能影響胚胎早期發(fā)育[7]。動物STAT3通過調(diào)控催乳素(PRL)和生長激素(GH)的表達來影響體重等生產(chǎn)性能[8-9]。據(jù)此推測，STAT3基因?qū)w重等生產(chǎn)性狀有重要遺傳效應，故該基因是研究現(xiàn)代山羊產(chǎn)業(yè)中影響產(chǎn)肉性能的重要候選基因。

所謂表觀遺傳就是指在DNA 序列不改變的情況下基因表達與調(diào)控的可遺傳變化，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA等。作為最主要的表觀遺傳修飾方式之一，DNA甲基化具有時空特異性的特點，常見于基因CpG島的CG二核苷酸位點[1，10]。盡管DNA甲基化不涉及DNA序列的改變，但它卻能影響基因的表達調(diào)控，它可以通過有絲分裂和減數(shù)分裂穩(wěn)定地將DNA甲基化信息傳遞給后代，是一種新的表觀遺傳標記[10]。目前，關于山羊STAT3基因甲基化修飾及其與產(chǎn)肉性能關系的研究尚未見報道。

因山羊STAT3基因編碼區(qū)未被克隆，其氨基酸信息未知，故不利于其功能的深入解析；同時，因山羊STAT3基因甲基化模式未知，故其甲基化功能研究也無法深入。為此，本研究旨在克隆STAT3基因編碼區(qū)(CDS)，并分析其序列特征，同時還解析該基因啟動子區(qū)甲基化修飾對體重的影響，期望為山羊產(chǎn)肉調(diào)控的遺傳與表觀遺傳機制研究提供科學資料。

1材料與方法

1.1試驗材料

山羊樣品包括兩類：一類是用于基因克隆的組織樣品，另一類是用于DNA甲基化分析的耳組織樣品。其中，組織樣品來源于6只健康的2～3歲左右布爾山羊和海南黑山羊肝組織，用于山羊STAT3基因的克隆研究；耳組織樣品來源于284只成年海南黑山羊，用于DNA甲基化修飾研究。在DNA甲基化研究中，基于數(shù)理統(tǒng)計的概率知識，參考C.Y.Pan等[11]和趙海諭[12]的方法，對收集的海南黑山羊群體的體重進行分類，將高于群體均值1.96倍標準差(Mean+1.96SD)的個體設為高體重組(H)，而低于群體均值1.96倍標準差(Mean-1.96SD)的個體設為低體重組(L)。

1.2主要試劑

Trizol 購自 Invitrogen 公司(USA)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、DNA重亞硫酸氫鹽處理試劑盒EZ?DNA Methylation-GoldTM Kit、ZYMO RESEARCH試劑盒和DNA柱式膠回收試劑盒購于康寧生命科學有限公司；T-easy載體購自Promega 公司(USA)；iQTMSYBR?Green Supermix 購自 Bio-Rad公司(USA)；2×TaqPCR Master Mix 購自天根生化科技有限公司(中國北京)；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞(Trans-5α)為本實驗室保存。

1.3方法

1.3.1山羊STAT3基因的分子克隆

1.3.1.1總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成：采用Trizol 法提取肝組織的總RNA[12-13]；利用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA質(zhì)量；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書獲得cDNA：5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)2.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，RT Primer Mix 0.5 μL，除基因組DNA的反應液 1.0 μL，RNase Free dH2O 10.0 μL。反應條件：37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min→85 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活5 s →反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，-20 ℃?zhèn)溆?；根?jù)反轉(zhuǎn)錄cDNA的質(zhì)量和濃度構建cDNA池，并以此cDNA池為模板克隆STAT3基因。1.3.1.2克隆引物的設計與PCR擴增：參考NCBI的基因序列(NM_001012671)，利用Primer Premier軟件(5.0)設計克隆山羊STAT3基因CDS區(qū)的PCR引物1對(上游：5′-AGCAGCAGTTGTGACCCCT-GATTC-3′；下游:5′-TGTAAGGGCTGGTGGGACATGGGT-3′)，其預期擴增片段長度為2 410 bp。在 PCR過程中，總反應體系20 μL：上、下游引物各0.4 μL，RNase-Free ddH2O 7.4 μL，2×PowerTaqPCR MasterMix 11 μL，cDNA模板0.8 μL；PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸150 s，36個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，10 ℃保存。

1.3.1.3PCR產(chǎn)物的回收與單克隆的測序：利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，再根據(jù)凝膠回收試劑盒回收目的片段；質(zhì)檢合格純化后PCR產(chǎn)物與 T-easy載體4 ℃過夜連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至25 μL Trans-5α感受態(tài)細胞，經(jīng)復蘇、平板培養(yǎng)后，通過藍、白斑篩選挑取白色單克隆菌落，用LB(Amp+)培養(yǎng)液37 ℃擴大培養(yǎng)，之后利用菌液PCR 鑒定陽性克隆，并送南京金斯瑞公司測序。

1.3.2生物信息學分析利用DNAMAN 軟件(6.0)對測序所獲得的山羊STAT3序列進行開放閱讀框(ORF)和氨基酸(aa)序列預測；采用 MEGA軟件(5.0)構建系統(tǒng)進化樹；利用 EXPASY(http://www.expasy.org)對山羊STAT3蛋白進行理化性質(zhì)研究；跨膜結構預測采用 TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進行；利用NetPhos 2.0(http://cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對STAT3 進行磷酸化位點預測，利用NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分析蛋白質(zhì)糖基化位點；利用在 線 程序Hopfield(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html) 對蛋白質(zhì)二級結構進行預測；亞細胞定位采用 PsortⅡ(http://psort.hgc.jp/)進行[14-21]。

1.3.3山羊STAT3基因甲基化修飾研究

1.3.3.1基因組DNA的提取與重亞硫酸鹽處理：采用標準的苯酚-氯仿方法提取來源于高體重組和低體重組個體的耳組織基因組DNA[11-12，18-19]；嚴格按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit試劑盒說明書對基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理。

1.3.3.2山羊STAT3基因甲基化引物的設計與擴增：利用在線軟件Methprimer(http://www.urogene.org/methprimer/)篩選山羊STAT3基因CpG島，并針對CpG島設計了1對位于啟動子區(qū)的甲基化引物(上游Methprimer-STAT3-M1-F：5′-GTATTGTTTTTTTATTTTTTTGAAT-3′；下游STAT3-M1-R:5′-CCTACTTTAAACTTCAATT-TCTAC-3′)，擴增片段為191 bp(-807～-617 bp)，包括10個CpG位點。25 μL PCR反應體系：50 ng·μL-1的重亞硫酸鹽處理后的基因組DNA 1.0 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各0.5 μL，2×Reaction Mix(含Buffer、TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs等) 12.5 μL，滅菌超純水10.5 μL。Touch-Down PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，68～54 ℃(每兩循環(huán)降2 ℃)30 s，72 ℃延伸30 s，14個循環(huán)；94 ℃變性30 s，51 ℃復性30 s 72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3.3.3重亞硫酸鹽處理后測序(BSP)和DNA甲基化模式分析：參考1.3.1.3中描述的方法進行TA克?。浑S機挑選10～15個陽性克隆送南京金斯瑞公司測序，并利用T7正向或M13反向測序；根據(jù)DNA甲基化測序結果，分析陽性克隆中甲基化的CpG二核苷酸位點的百分數(shù)[11-13，15，17-19]；分析高體重組與低體重組STAT3基因啟動子區(qū)CpG島的整體甲基化率[17-19，22-24]；分析高體重組與低體重組STAT3基因啟動子區(qū)甲基化差異與體重的關系：根據(jù)甲基化位點的甲基化差異數(shù)據(jù)特征，利用SPSS(18.0)軟件中Fisher精確概率檢驗法分析高體重組與低體重組的DNA甲基化差異[11-12，16]。

2結果

2.1山羊STAT3基因CDS的分子克隆及氨基酸序列分析

利用RT-PCR方法獲得一條長度為2 410 bp左右的條帶(圖1)，與預期結果一致。經(jīng)TA克隆、測序，成功地獲得了山羊STAT3基因CDS序列；ORF finder分析表明，山羊STAT3基因CDS全長2 313 bp，編碼770個氨基酸(圖2)。

圖1　山羊STAT3基因的RT-PCR電泳結果Fig.1　The RT-PCR electrophoresis results of the goat STAT3 gene

2.2山羊STAT3氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹構建

將山羊STAT3氨基酸序列與牛(NP_001012689)、人(AAS66986)、小鼠(AAA19452)、大鼠(AAH87025)、野豬(ABF21150)、綿羊(XP_004012974)氨基酸序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)它們高度同源；在氨基酸同源性分析中(圖3)，山羊STAT3基因氨基酸序列與牛、綿羊、小鼠、大鼠、野豬和人氨基酸序列的相似性分別為99.6%、99.7%、99.2%、99.4%、99.4%和99.5%。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖4)，山羊與牛的親緣關系最為接近，與人類、大鼠、小鼠和綿羊親緣關系較遠。

圖2　山羊STAT3基因CDS與氨基酸序列Fig.2　The CDS and amino acid sequence of the goat STAT3 gene

2.3山羊STAT3蛋白結構與功能預測

2.3.1山羊STAT3蛋白理化性質(zhì)分析山羊STAT3蛋白由770個氨基酸殘基組成，其分子式為：C3909H6161N1063O1171S41，其分子量為88 099.8D，其理論等電點(pI)為5.94；該蛋白的氨基酸組成及其比例分別為：Ala(5.8%)、Arg(4.7%)、Asn(4.9%)、Asp(4.2%)、Cys(1.8%)、Gln(7.8%)、Glu(7.7%)、Gly(4.9%)、His(1.7%)、Ile(5.3%)、Leu(10.6%)、Lys(6.0%)、Met(3.5%)、Phe(3.9%)、Pro(4.3%)、Ser(6.8%)、Thr(6.1%)、Trp(1.9%)、Tyr(2.7%) 和Val(5.3%)。其不穩(wěn)定系數(shù)為49.58，且預計在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞內(nèi)半衰期為30h；脂溶指數(shù)為83.58，總平均疏水指數(shù)-0.400，屬親水蛋白。

圖4　不同物種STAT3基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　Phylogenetic tree of STAT3 gene among various species

2.3.2山羊STAT3蛋白結構預測山羊STAT3蛋白主要由α-螺旋(46.62%)、β折疊(18.18%)、β轉(zhuǎn)角(7.40%)及無規(guī)則卷曲(27.79%)構成。采用SWISS-MODEL和PyMol軟件對山羊STAT3建模獲得二級結構模型及結構域的預測(圖5，圖6)。

圖5　山羊STAT3蛋白質(zhì)二級結構分析Fig.5　The secondary structure analysis of goat STAT3 protein

圖6　山羊STAT3蛋白質(zhì)結構域Fig.6　Protein domains of goat STAT3

2.3.3山羊STAT3亞細胞定位、蛋白磷酸化和糖基化位點預測山羊STAT3蛋白在細胞質(zhì)、細胞核、線粒體基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、膜泡分泌系統(tǒng)及質(zhì)膜中的分布比例分別為34.8%、30.4%、17.4%、8.7%、4.3%和4.3%，在細胞質(zhì)中分布最多。磷酸化分析顯示(圖7a)，山羊STAT3蛋白存在較多的絲氨酸(Ser)磷酸化位點，而酪氨酸(Tyr)和蘇氨酸(Thr)磷酸化位點較少。糖基化位點分析表明，山羊STAT3蛋白存在3個糖基化修飾位點，分別位于氨基酸序列的第192、401和538位(圖7b)。

2.4山羊STAT3基因甲基化修飾分析

山羊STAT3基因啟動子區(qū)CpG島的PCR片段長度為191bp(圖8)，共包括了10個CpG二核苷酸位點(圖9，圖10)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，高體重組(H)和低體重組(L)的整體甲基化率分別為42.86%和0。利用獨立卡方χ2進行檢驗，發(fā)現(xiàn)H組和L組之間DNA甲基化修飾程度存在顯著差異(P=0.020)(圖11)。

3討論

圖7　山羊STAT3蛋白的磷酸化位點(a)和糖基化位點(b)Fig.7　Phosphorylation site(a) and glycosylation site(b) analyses of goat STAT3 protein

圖8　山羊STAT3-M1 PCR電泳結果Fig.8　PCR electrophoresis results of the goat STAT3-M1

STAT3作為一種重要轉(zhuǎn)錄因子，是胞漿中信息的傳遞者，是胞核中轉(zhuǎn)錄因子的激活者，還是乳腺癌細胞中多種細胞因子信號傳導途徑的匯聚點，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)[20]。研究表明，STATs家族基因?qū)w重具有顯著遺傳效應，其中STAT5a、STAT3和STAT1等蛋白參與GH與PRL的信號轉(zhuǎn)導，從而對山羊體重均有重要影響；H.W.Davey等[21]發(fā)現(xiàn)，STAT5a與脂肪細胞增生密切相關；過表達動物IL-6將導致脂肪分解基因的mRNA水平升高，從而觸發(fā)作為IL-6傳遞中的STAT3磷酸化水平，從而導致體重下降。本課題組最新研究表明，山羊STAT5a和STAT3基因遺傳變異對生長性狀有顯著影響[22-23]；STAT5a和STAT3為同一基因家族成員，且同源性較高、功能相似。因此，研究STAT3基因的功能對理解山羊體重和產(chǎn)肉性能具有重要意義。

本研究成功克隆了山羊STAT3基因CDS全長(2 313bp，編碼770個氨基酸)，為該基因的功能研究奠定了基礎。不同各物種STAT3氨基酸序列比對結果提示該基因較為保守。生物信息學預測表明，第600～700位氨基酸具有SH2結構域，而且該區(qū)域中還存在較多的絲氨酸、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)的磷酸化位點，這些為該基因深入的功能驗證提供了科學參考。

研究表明，基因啟動子區(qū)DNA甲基化修飾會抑制基因的表達[24]，當基因啟動子區(qū)被甲基化后，甲基化結合蛋白會抑制SP1轉(zhuǎn)錄因子介導的轉(zhuǎn)錄激活[25]。STAT3基因在JAK-STAT信號途徑中發(fā)揮著重要功能[26]。E.Kim等[27]指出，組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(EZH2)與STAT3的結合會使STAT3甲基化，進而增強STAT3的活性。為此，本研究還分析了STAT3基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及其與山羊體重的關系。結果發(fā)現(xiàn)，低體重組STAT3基因啟動子區(qū)是非甲基化的，而高體重組STAT3基因啟動子區(qū)為中度甲基化水平；統(tǒng)計分析揭示，低體重組與高體重組的STAT3基因甲基化修飾程度之間存在顯著差異，提示該基因甲基化修飾對體重有顯著影響，同時，還提示該基因的DNA甲基化修飾可以作為體重性狀篩選的有效表觀遺傳標記。為此，建議將STAT3基因作為影響山羊產(chǎn)肉性能的重要候選基因，并有必要進行深入研究。

上方數(shù)字代表源序列，下方數(shù)字代表重亞硫酸鹽處理后序列比對所用的模式序列。CG或YG代表各CpG二核苷酸位點，橫線指示引物位置The upward side sequence indicated origin sequence，while the downward side sequence indicated the bisulfite treatment sequence；CG or YG represented the location of CpG dinucleotide；the line indicated the location of primers圖9　STAT3-M1的 CpG位點的甲基化模式圖Fig.9　Methylated CpG sites mode of STAT3-M1 region

測序圖中帶框的字母CG或TG表示各CpG二核苷酸位點的位置；橫線指示引物位置CG or TG represented the location of CpG dinucleotide in sequence map；the line indicated the location of primers圖10　山羊STAT3基因的重亞硫酸鹽處理后測序圖Fig.10　The bisulfite sequencing results of goat STAT3 gene

圖11　不同體重組的山羊STAT3基因啟動子區(qū)CpG島整體甲基化率比較Fig.11　Overall methylation percentage in the CpG island of the STAT3 gene promoter region between the high body weight group and the low body weight group

總之，本研究成功克隆了山羊STAT3基因CDS序列，并發(fā)現(xiàn)該基因啟動子區(qū)甲基化修飾顯著影響山羊體重性狀，可作為體重性狀選擇的有效表觀遺傳標記，這將有助于進一步解析山羊產(chǎn)肉調(diào)控的遺傳與表觀遺傳機制，為未來山羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科學資料。

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(編輯郭云雁)

Molecular Cloning，Bioinformatics Analysis and Methylation Modification of GoatSTAT3 Gene

JIA Wen-chao1#，LIU Liang-liang2#，WU Xian-feng1，ZHAO Zhao-yan1，WANG Ke1，WANG Mao1，GAO Jing1，WANG Li-qiang1，CHEN Hong1，PAN Chuan-ying1，LAN Xian-yong1*

(1.ShaanxiKeyLaboratoryofMolecularBiologyforAgriculture，CollegeofAnimalScienceandTechnology/CollegeofLifeSciences，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.ComputerScienceandEngineeringSchoolofJust，JiangsuUniversityofScienceandTechnology，Zhenjiang212003，China)

Abstract:The aim of this study was to clone and analyze the entire coding sequence of goatSTAT3 gene as well as to detect theSTAT3 gene methylation modification and analyze its association with goat body weight using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)，TA cloning，bioinformatics and bisulfite sequencing(BSP) methods.The results showed that the entire coding sequence of goatSTAT3 gene was 2 313 bp in length，and encoded 770 amino acids.The shared amino acid sequence consistency between goat(caprahircus) and sheep(Ovisaries)，bovine(BosTaurus)，boar(Susscrofa)，mouse(Musmusculus)，rat(Rattusnorvegicus)，human(Homosapiens) were 99.7%，99.6%，99.4%，99.2%，99.4%，99.5%，respectively.The analysis of the methylation difference in the promoter region of goatSTAT3 gene between high body weight group and low body weight group demonstrated that the goats with high body weight had higher methylation level than those goats with low body weight(P=0.020).This finding indicated that the methylation modification ofSTAT3 gene had significant effect on body weight in goat，which could become the epigenetic marker in marker-assisted selection(MAS).These results would provide scientific data for studying genetic and epigenetic mechanism for meat production in goat.

Key words:goat；STAT3 gene；molecular cloning；sequence analysis；DNA methylation

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.006

收稿日期：2015-03-30

基金項目：國家自然科學基金(31172184)；陜西省留學人員科技活動擇優(yōu)資助項目(2014-14)；西北農(nóng)林科技大學大學生創(chuàng)新性實驗計劃(2013)

作者簡介：賈文超(1990-)，男，土族，青海門源人，碩士生，主要從事動物遺傳學研究，E-mail：jiawenchaozyq@163.com；劉亮亮(1979-)，男，江西萍鄉(xiāng)人，博士，講師，主要從事計算機軟件與信息分析，E-mail：lingyun79626@126.com。賈文超和劉亮亮為并列第一作者 *通信作者：藍賢勇，博士，副教授，碩士生導師，主要從事動物遺傳育種與表觀遺傳修飾研究，E-mail：lanxianyong79@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號：S827；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0457-10