萬瑩瑩 王長福 王秋紅 肖陽 王知斌 匡海學(xué)

[摘要]該實(shí)驗(yàn)基于前期黑水纈草抗老年癡呆（AD）的作用，對其有效部位進(jìn)行化學(xué)成分研究，采用75%乙醇加熱回流的方法對黑水纈草藥材進(jìn)行提取，提取物經(jīng)萃取和大孔吸附樹脂柱色譜分離得到其抗AD的有效部位，采用硅膠、ODS柱色譜以及制備型HPLC等色譜法分離該有效部位并得到9個(gè)化合物（1～9），結(jié)合質(zhì)譜及核磁等波譜技術(shù)，分別鑒定為6hydroxy7（hydroxymethyl）4methylenehexahydrocyclopenta[c]pyran1（3H）one（1），suspensolide F（2），馬錢子苷（3），α莫諾苷（4），β莫諾苷（5），patrinovalerosidate（6），野花椒苷A（7），（-）angelicoidenol2OβDglucopyranoside（8）和citroside A（9），其中化合物6～9為首次從纈草屬植物中分離得到，進(jìn)一步對化合物1～9進(jìn)行體外抗AD活性研究發(fā)現(xiàn)化合物2和6對PC12神經(jīng)元細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]黑水纈草；老年癡呆；活性成分；結(jié)構(gòu)鑒定

[Abstract]In this study， the chemical constituentsfrom Valeriana amurensis ADeffective fraction were investigated based on the effect of Valeriana amurensis on Alzheimer′s disease（AD） in previous study Valeriana amurensis was extracted with 75% ethanol and the obtained extract were extracted and subjected to AB8 macroporous resin column to obtain the ADeffective fraction of Valeriana amurensis 9 compounds （19）were isolated with silica gel， ODS column chromatography and preparative HPLC The structures of these compounds were determined as 6hydroxy7（hydroxymethyl）4methylenehexahydrocyclopenta[c]pyran1（3H）one （1）， suspensolide F （2）， loganin（3）， αmorroniside（4）， βmorronisid （5）， partinovalerosidate （6）， zansiumloside A （7）， （-）angelicoidenol2OβDglucopyranoside （8）， citroside A （9）. Compounds 69 were isolated from the valerian genus for the first time and further investigated the antiAD effect of compounds 19 in vitro found that compound 2 and 6 protected the PC12 cells from injury significantly

[Key words]Valeriana amurensis； Alzheimer′s disease； active constituents； structure identification

doi：10.4268/cjcmm20160914

黑水纈草Valeriana amurensis Smir ex Kom為敗醬科纈草屬植物，在我國東北部以及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)分布較廣；其根及根狀莖入藥[1]，味辛、甘，性溫，具有安神，理氣，止痛的功效，傳統(tǒng)中醫(yī)臨床用于失眠，癔病，癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。前期的研究發(fā)現(xiàn)，黑水纈草主要含有揮發(fā)油、木脂素、倍半萜及環(huán)烯醚萜等類型的成分，并具有鎮(zhèn)靜安神、抗菌抗病毒以及抗腫瘤等藥理活性[25]。而本課題組前期研究首次發(fā)現(xiàn)黑水纈草具有抗老年癡呆（AD）的作用，并確定其有效部位為黑水纈草75%乙醇提取物的大孔吸附樹脂柱色譜的50%乙醇洗脫組分，該有效部位能夠抑制AD小鼠模型神經(jīng)元損傷[6]，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上對其活性成分進(jìn)行研究，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的揭示提供了理論依據(jù)。

1材料

反相ODS柱色譜（ODSAM） 采用日本YMC公司產(chǎn)品；大孔吸附樹脂（AB8）購于南開大學(xué)化工廠；制備型色譜柱（HypersilODSII）購買于大連依利特公司。

超導(dǎo)核磁共振光譜儀（Bruker400型 ）（TMS為內(nèi)標(biāo)）；HRESIMS（Xero QTOF）、HPLC（26952996型）及UPLC（ACQUITY型）均為Waters公司；GCMS（7890A5975C型）為Angilent公司。

2方法

21提取與分離將45 kg干燥的黑水纈草藥材，以75%乙醇（20∶1）加熱回流提?。? h×3次）得到的提取物（8 21196 g）以水混懸，采用石油醚萃取，將剩余水層萃取物（6 14460 g）經(jīng)AB8型大孔吸附樹脂柱色譜，H2O，50%乙醇和95%乙醇依次洗脫，獲得的50%乙醇洗脫組分（1 39190 g）即為黑水纈草抗AD有效部位；取該有效部位（800 g）經(jīng)二氯甲烷甲醇（15∶1，8∶1，4∶1，2∶1）梯度洗脫，共得7個(gè)組分（Fr1～Fr7），F(xiàn)r2（784 g）經(jīng)正相硅膠柱色譜二氯甲烷甲醇（40∶1）反復(fù)洗脫得到化合物1（54 mg），F(xiàn)r4（1482 g）經(jīng)反相ODS柱色譜甲醇水（25∶75）洗脫，并經(jīng)制備型反相HPLC乙腈水（15%）洗脫分離得到化合物4（23 mg），5（26 mg），8（25 mg），9（35 mg），F(xiàn)r6（1844 g）經(jīng)反相ODS柱色譜甲醇水（15∶85）洗脫，并經(jīng)制備型反相HPLC乙腈水（9：91）洗脫分離得到化合物2（33 mg），3（28 mg），6（41 mg）和7（53 mg）。

22抗AD活性化合物篩選采用MTT法對化合物1～9的抗AD活性進(jìn)行篩選[7]，采用酶標(biāo)儀檢測各濃度化合物（5，12，25 μmol·L-1）對Aβ142所致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，組細(xì)胞活力=A各組細(xì)胞/A空白對照組細(xì)胞×100%。

3結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色針狀結(jié)晶，HRESIMS m/z 199098 9 [M+H]+；1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：429（1H，br s，H3），156（1H，m，H5）， 205（1H，dd，J=132， 74 Hz，H5），462（2H，m，H6），231（1H，m，H7），291（1H，t，J=100 Hz，H8），337（1H，m，H9），377（1H，dd，J=48，108 Hz，H10）， 370（1H，t，J=81 Hz，H10），496（1H，s，H11）， 509（1H，s，H11）；13CNMR（CD3OD，100 MHz）δ：1775（C1），737（C3），1443（C4），415（C5），726（C6），522（C7），451（C8），411（C9），621（C10），1139（C11）。將上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]比較，鑒定化合物1為6hydroxy7（hydroxymethyl）4methylenehexahydrocyclopenta[c]pyran1（3H）one。

化合物2白色無定形粉末，ESIMS m/z 501 [M+Na]+；1HNMR （CD3OD，400 MHz）δ：609（1H，d，J=48 Hz，H1），632（1H，s，H3），298（1H，dd，J=84，167 Hz，H5），194（2H，dd，J=40，78 Hz，H6），431（1H，m，H7），215（1H，ddd，J=48，84，128 Hz，H8），228（1H，m，H9），373（1H，m，H10）， 352（1H，m，H10），442 （1H，d，J=126 Hz，H11）， 405（1H，d，J=126 Hz，H11），217（2H，m，H13），204（1H，m，H14），091（3H，d，J=68 Hz，H15），091（3H，d，J=68 Hz，H16），424（1H，d，J=80 Hz，Glc H1′），315（1H，m，Glc H2′），330（1H， m，Glc H3′），323（1H，m，Glc H4′），330（1H，m，Glc H5′），362（1H，dd，J=56 Hz，120 Hz，Glc H6′），381（1H，dd，J=20 Hz，120 Hz，GlcH6′）；13CNMR（CD3OD，100 MHz）δ：920（C1），1403（C3），1167（C4），331（C5），384（C6），796（C7），841（C8），449（C9），665（C10），699（C11），1733（C12），444（C13），269（C14），228（C15），228（C16），1036（Glc C1′），753（Glc C2′），782（Glc C3′），718（Glc C4′），780（Glc C5′），629（Glc C6′）。將上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]對照，鑒定化合物2為suspensolide F。

化合物3白色無定形粉末，ESIMS m/z 391 [M+H]+；1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：517（1H，d，J=44 Hz，H1），729（1H，s，H3），301（1H，dd，J=84，160 Hz，H5），213（1H，m，H6）， 151（1H，m，H6），311（1H，m，H7），177（2H，m，H8），193（1H，m，H9），086（3H，d，J=68 Hz，H10），359（3H，s，H12），456（1H，d，J=80 Hz，Glc H1′），320～400（4H，m，Glc H4′），376（1H，dd，J=20，120 Hz，Glc H6′）， 353（1H，dd，J=56，120 Hz，Glc H6′）；13CNMR（CD3OD，100 MHz）δ：978（C1），1522（C3），1141（C4），322（C5），428（C6），751（C7），422（C8），466（C9），154（C10），1696（C11），518（C12），1002（Glc C1′），755（Glc C2′），782（Glc C3′），717（Glc C4′），781（Glc C5′），619（Glc C6′）。將上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對照，鑒定化合物3為馬錢子苷。

化合物4白色無定形粉末，ESIMS m/z 429 [M+Na]+；1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：579（1H，d，J=93 Hz，H1），748（1H，s，H3），278（1H，dt，J=127 Hz，45 Hz，H5），199（1H，m，H6）、115（1H，m，H6），478（1H，d，J=32 Hz，H7），392（1H，m，H8），173（1H，m，H9），135（3H，d，J=70 Hz，H10），367（3H，s，H12），478（1H，d，J=80 Hz，Glc H1′），320～400（6H，m，Glc H4′）；13CNMR（CD3OD，100 MHz）δ：972（C1），1546（C3），1110（C4），321（C5），374（C6），960（C7），742（C8），400（C9），200（C10），1688（C11），520（C12），1002（Glc C1′），751（Glc C2′），785（Glc C3′），717（Glc C4′），781（Glc C5′），629（Glc C6′）。綜上，將上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對照，鑒定化合物4為α莫諾苷（αmorroniside）。

萬瑩瑩等：黑水纈草抗老年癡呆活性成分研究化合物5白色無定形粉末，ESIMS m/z 429 [M+Na]+；1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：583（1H，d，J=92 Hz，H1），747（1H，s，H3），309（1H，dt，J=128 Hz，46 Hz，H5），186（1H，dt，J=45 Hz，138 Hz，H6）， 147（1H，dt，J=37 Hz，134 Hz，H6），520（1H，d，J=32 Hz，H7），451（1H， m，H8），178（1H，m，H9），128（3H，d，J=70 Hz，H10），366（3H，s，H12），478（1H，d，J=80 Hz，Glc H1′），320～400（6H，m，Glc H4′）；13CNMR（CD3OD，100 MHz）δ：958（C1），1546（C3），1118（C4），276（C5），347（C6），925（C7），660（C8），406（C9），199（C10），1689（C11），519（C12），1002（Glc C1′），751（Glc C2′），785（Glc C3′），717（Glc C4′），781（Glc C5′），629（Glc C6′）。將上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對照，鑒定化合物5為β莫諾苷（βmorroniside）。

化合物6白色無定形粉末，ESIMS m/z 4492 [M+H]+；1HNMR （CD3OD，400MHz）δ：409（1H，dd，J=73，111 Hz，H1），421（1H，dd，J=64，111 Hz，H1），535（1H，br s，H3），517（1H，br s，H3），322（1H，m，H5），223（1H，m，H6），180（1H，m，H6），383（1H，br d，J=45 Hz，H7），238（1H，m，H9），138（3H，s，H10），434（1H，d，J=121 Hz，H11），417（1H，d，J=121 Hz，H11），219（2H，d，J=74 Hz，H13），208（1H，m，H14），097（3H，d，J=66 Hz，H15），097（3H，d，J=66 Hz，H16），431（1H，d，J=81 Hz，Glc H1′），324（1H，m，Glc H2′），337（1H，m，Glc H3′），332（1H，m，Glc H4′），326（1H，m，Glc H5′），371（1H，dd，J=56，120 Hz，Glc H6′），390（1H，dd，J=20 Hz，120 Hz，Glc H6′）；13CNMR（CD3OD，100 MHz）δ：642（C1），1154（C3），1472（C4），416（C5），391（C6），813（C7），828（C8），482（C9），232（C10），737（C11），1752（C12），446（C13），269（C14），229（C15），229（C16），1031（Glc C1′），753（Glc C2′），783（Glc C3′），718（Glc C4′），781（Glc C5′），630（Glc C6′）。將上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對照，鑒定該化合物6為patrinovalerosidate。

化合物7白色無定形粉末，HRESIMS m/z 463217 2 [M-H]-；1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：385（1H，br d，J=83 Hz，H2），245（1H，m，H3），157（1H，m，H3），157（1H，m，H4），197（1H，m，H5），164（1H，m，H5），197（1H，m，H6），162（1H，m，H6），111（3H，s，H7），128（3H，s，H9），119（3H，s，H10），431（1H，d，J=77 Hz，Glc H1′），313（1H，t，J=84 Hz，Glc H2′），336（1H，m，Glc H3′），326（1H，t，J=93 Hz，Glc H4′），338（1H，m，Glc H5′），397（1H，br d，J=90 Hz，Glc H6′），361（1H，t，J=62，51 Hz，Glc H6′），502（1H，d，J=18 Hz，Api H1″），389（1H，d，J=18 Hz，Api H2″），394（1H，d，J=95 Hz，Api H4″），375（1H，d，J=95 Hz，Api H4″），358（2H，s，Api H5″）；13CNMR （CD3OD，100 MHz）δ：737（C1），768（C2），326（C3），354（C4），229（C5），270（C6），250（C7），753（C8），290（C9），294（C10），1019（Glc C1′），751（Glc C2′），783（Glc C3′），720（Glc C4′），771（Glc C5′），688（Glc C6′），1110（Api C1″），781（Api C2″），807（Api C3″），752（Api C4″），659（Api C5″）。將上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]比較，鑒定化合物7為野花椒苷A。

化合物8白色無定形粉末，HRESIMS m/z 331175 1 [M-H]-；1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：385（1H，br d，J=111 Hz，H2），249（1H，dd，J=89，129 Hz，H3），170（1H，d，J=44 Hz，H3），218（1H，m，H4），404（1H，br d，J=99 Hz，H5），132（1H，br d，J=136 Hz，H6）、102（1H，br d，J=138 Hz，H6），085（3H，s，H7），108（3H，s，H9），092（3H，s，H10），422（1H，d，J=78 Hz，Glc H1′），315（1H，t，J=84 Hz，Glc H2′），333（1H，m，Glc H3′），322（1H，t，J=93 Hz，Glc H4′），328（1H，m，Glc H5′），385（1H，br d，J=111 Hz，Glc H6′），367（1H，dd，J=117 Hz，52 Hz，Glc H6′）；13CNMR（CD3OD，100 MHz）δ：512（C1），832（C2），344（C3），538（C4），761（C5），399（C6），215（C7），489（C8），205（C9），135（C10），1031（Glc C1′），753（Glc C2′），784（Glc C3′），719（Glc C4′），780（Glc C5′），630（Glc C6′）。將上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]比較，鑒定該化合物為（-）angelicoidenol2OβDglucopyranoside。

化合物9白色無定形粉末，HRESIMS m/z 409183 3 [M+Na]+；1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：134 （1H，brd，J=117 Hz，H2），193（1H，br d，J=117 Hz，H2），433（1H，m，H3）， 249（1H，dd，J=18 Hz，135 Hz，H4），138（1H，dd，J=18，135 Hz，H4），590（1H，s，H8），220（3H，s，H10），148（3H，s，H11），138（3H，s，H12），116（3H，s，H13），453（1H，d，J=77 Hz，Glc H1′），315（1H，t，J=83 Hz，Glc H2′），335（1H，t，J=86 Hz，Glc H3′），326（1H，t，J=96 Hz，Glc H4′），322（1H，m，Glc H5′），382（1H，dd，J=21，117 Hz，Glc H6′）， 363（1H，dd，J=52，117 Hz，Glc H6′）；13CNMR（CD3OD，100 MHz）δ：372（C1），500（C2），640（C3），482（C4），789（C5），1193（C6），2131（C7），1015（C8），2008（C9），268（C10），267（C11），302（C12），326（C13），988（Glc C1′），754（Glc C2′），788（Glc C3′），719（Glc C4′），779（Glc C5′），631（Glc C6′）。將上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]比較，鑒定該化合物為citroside A。

4化合物抗AD活性

體外實(shí)驗(yàn)研究表明，5，12，25 μmol·L-1的化合物2和6的細(xì)胞活力與模型組比較差異顯著（P<005或P<001），因此，化合物2和6對Aβ142所致的PC12神經(jīng)元細(xì)胞損傷具有顯著地保護(hù)作用，見表1。

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