楊立新 馮偉紅 夏伯候 林麗美 劉薇薇 苗婉清 甘國鋒 鄒濟(jì)高 李春

[摘要]該研究采用高效液相色譜法建立并分析了不同廠家生產(chǎn)醒腦靜注射液的特征圖譜。采用Thermo BDS Hypersil C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）進(jìn)行分離，流動相為乙腈002%甲酸水溶液，梯度洗脫，流速10 mL·min-1，檢測波長254 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。通過對29批醒腦靜注射液的HPLC特征圖譜研究，共標(biāo)定了11個特征峰。經(jīng)與對照品對比，指認(rèn)出其中7個特征峰的結(jié)構(gòu)，分別為優(yōu)香芹酮、樟腦、姜黃烯酮、莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)酮和吉馬酮。運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助相似性評價(jià)系統(tǒng)及主成分分析對所建29批醒腦靜注射液的HPLC 特征圖譜進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示不同廠家生產(chǎn)的醒腦靜注射液能明顯分為3類。該文所建立的HPLC 特征圖譜為科學(xué)評價(jià)和有效控制醒腦靜注射液質(zhì)量提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]醒腦靜注射液；特征圖譜；主成分分析；高效液相色譜法

[Abstract]To establish and analyze the HPLC specific chromatograms of Xingnaojing injection manufactured by different factories The separation was performed on a Thermo BDS Hypersil C18 column （46 mm×250 mm， 5 μm）， with the mobile phase consisting of acetonitrile002% formic acid aqueous solution for gradient elution The flow rate was 10 mL·min-1， and the column temperature was 35 ℃ The detection wavelength was set at 254 nm， and the sample size was 20 μL Eleven chromatographic peaks were identified as characteristic peaks of HPLC specific chromatograms of Xingnaojing injection， after analyzing 29 batches of Xingnaojing injection samples Compared with the reference substances， seven of them were identified as eucarvone， camphor， curcumenone， curcumenol， curdione， curzerenone and germacrone， respectively HPLC specific chromatograms of Xingnaojing injection manufactured by three factories could be easily classified into three categories after investigation with computeraided similarity evaluation system combined with principal component analysis The established HPLC specific chromatograms provide a basis for scientific evaluation and effective control of the quality of Xingnaojing injection

[Key words]Xingnaojing injection； specific chromatograms； principal component analysis （PCA）； highperformance liquid chromatography （HPLC）

doi：10.4268/cjcmm20160912

指紋圖譜技術(shù)在中藥注射劑標(biāo)準(zhǔn)提高中的應(yīng)用日趨成熟，對保障藥品的有效、均一具有重要的意義。2010 年版《中國藥典》實(shí)施后至2013 年，共新頒布實(shí)施了24 個中藥注射劑指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，1 個注射用原料標(biāo)準(zhǔn)[1]。2015年版《中國藥典》一部正文中明確增加了清開靈注射液和注射用雙黃連（凍干）的HPLC特征圖譜標(biāo)準(zhǔn)[2]?？梢?，增加指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)是所有中藥注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升中必不可少的內(nèi)容。醒腦靜注射液由麝香、冰片、郁金、梔子4味藥經(jīng)水蒸氣蒸餾提取而制成，具有清熱解毒，涼血活血，開竅醒腦之功，臨床上廣泛用于多種原因所致腦部疾病，如顱腦外傷、乙型腦炎、腦血管疾病等[3]。該品種現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3B3353982003[4]，標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定醒腦靜注射液中龍腦含量不得低于07 g·L-1，而未涉及指紋圖譜的內(nèi)容。有關(guān)醒腦靜注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的文獻(xiàn)報(bào)道中，幾乎全部是對麝香酮和/或龍腦的含量進(jìn)行測定，檢測方法包括氣相色譜法（GC）[512]、氣質(zhì)聯(lián)用法（GCMS）[13]和高效液相色譜法（HPLC） [14]，也未見任何關(guān)于其指紋圖譜的研究報(bào)道。因此，為全面了解醒腦靜注射液的化學(xué)成分信息并提升其質(zhì)量控制水平，本研究首次采用HPLC法建立了醒腦靜注射液的特征圖譜并比較了3個廠家生產(chǎn)醒腦靜注射液特征圖譜的異同，以為今后該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升奠定基礎(chǔ)。

1材料

日本島津LC20AT高效液相色譜儀（包括SIL20A自動進(jìn)樣器，CTO10AS 柱溫箱和SPDM20A檢測器），Labsolutions色譜工作站；1/10萬電子分析天平（梅特勒托利多儀器有限公司，瑞士）。

莪術(shù)二酮（批號E009110603）和吉馬酮（批號111665201103）購自成都彼斯特生物科技有限公司。樟腦（批號Z018140801）購自成都瑞芬思生物科技有限公司。優(yōu)香芹酮（2，6，6三甲基2，4環(huán)庚烯1酮）、姜黃烯酮、莪術(shù)烯醇和莪術(shù)酮均由本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)NMR和MS 確定結(jié)構(gòu)。以上對照品經(jīng)HPLC測定純度>98%。甲醇、乙腈為色譜純（Fisher公司產(chǎn)品），水為娃哈哈純凈水，其他試劑為分析純。

21批醒腦靜注射液由無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司提供，其他8批醒腦靜注射液樣品從市場購得。樣品信息見表1。

2方法與結(jié)果

21色譜條件

采用Thermo BDS Hypersil C18 色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）002%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，40%A； 5～50 min，40%～60%A；50～60 min，60%～100%A；60～65 min，100%A；6501～75 min，40%A），流速10 mL·min-1，檢測波長254 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

22混合對照品溶液的制備

分別精密稱取干燥至恒質(zhì)量的優(yōu)香芹酮、樟腦、莪術(shù)二酮、吉馬酮、姜黃烯酮、莪術(shù)酮和莪術(shù)烯醇對照品適量，置于同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成一定濃度的混合對照品溶液。

23供試品溶液的制備

取醒腦靜注射液3～5支，傾出內(nèi)容物，混勻，精密吸取5 mL，通過C8固相萃取小柱（100 g·L-1），C8小柱先用無水乙醇浸泡，再用水20 mL預(yù)洗），流出液棄去，用1 mL甲醇洗脫，收集洗脫液約08 mL，置1 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

24方法學(xué)考察

241穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一批號醒腦靜注射液（120107）供試品溶液，按21項(xiàng)下色譜條件分別于制樣后0，2，4，6，12，24 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3% （n=6），結(jié)果說明供試品的穩(wěn)定性良好。

242精密度試驗(yàn)精密吸取同一批號醒腦靜注射液（120107）供試品溶液，按照21項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），結(jié)果說明儀器的精密度良好。

243重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號醒腦靜注射液（120107）供試品溶液，各精密吸取6份，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），結(jié)果說明方法重復(fù)性良好。

25特征圖譜的建立和主成分分析

251醒腦靜注射液HPLC特征圖譜的建立分別精密吸取29批醒腦靜注射液供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，采集75 min 的HPLC圖。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A）”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，按照生產(chǎn)廠家的不同對無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)生產(chǎn)醒腦靜注射液（S1～S21）、大理藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)醒腦靜（S22～S24）和河南天地藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)醒腦靜（S25～S29）進(jìn)行分別分析，見圖1。①設(shè)定S1為參照圖譜，將S2～S21與參照圖譜進(jìn)行自動匹配，生成無錫濟(jì)民可信生產(chǎn)醒腦靜注射液的HPLC特征圖譜及21批醒腦靜注射液HPLC對比圖，計(jì)算得到S1～S21供試品與對照特征圖譜的相似度分別為0972，0948，0978，0967，0982，0909，0970，0934，0936，0966，0982，0972，0969，0903，0943，0957，0959，0947，0951，0965，0963。各批醒腦靜注射液與HPLC特征圖譜之間的相似度均大于090，表明相似度良好。②設(shè)定S22為參照圖譜，將S23～S24與參照圖譜進(jìn)行自動匹配，生成大理藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)醒腦靜注射液的HPLC特征圖譜及3批醒腦靜HPLC對比圖，計(jì)算得到S22～S24供試品與對照特征圖譜的相似度分別為0995，099，0999。大理藥業(yè)股份有限公司的醒腦靜注射液與HPLC特征圖譜之間的相似度均大于099，表明相似度極好。③設(shè)定S25為參照圖譜，將S26～S29與參照圖譜進(jìn)行自動匹配，生成河南天地藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)醒腦靜注射液的HPLC特征圖譜及5批醒腦靜HPLC對比圖，計(jì)算得到S25～S29供試品與對照特征圖譜的相似度分別為0968，092，074，0934，0979。這5批樣品中的4批與對照圖譜的相似度較好（相似度大于09），說明生產(chǎn)工藝基本穩(wěn)定，但S27號樣品（批號為140705）與對照圖譜的相似度僅為074，推測可能是該批產(chǎn)品所用藥材與其他批所用藥材差別較大所致。

252特征峰的標(biāo)定根據(jù)29批醒腦靜的HPLC特征圖譜檢測結(jié)果，選擇醒腦靜中主要成分、單峰面積占總峰面積大于08%、出峰穩(wěn)定且分離度良好的色譜峰作為特征峰，共標(biāo)定了11個特征峰，見圖1。經(jīng)與對照品比對，4號峰為優(yōu)香芹酮（1052 min），5號峰為樟腦（1507 min），6號峰為姜黃烯酮（1711 min），7號峰為莪術(shù)烯醇（1798 min），8號峰為莪術(shù)二酮（2470 min），9號峰為莪術(shù)酮（3092 min），11號峰為吉馬酮（4579 min）。

253主成分分析采用主成分分析（PCA）方法對3組樣品建模，以共有峰的峰面積為自變量（X）（以出峰時間標(biāo)記峰的歸屬），以不同廠家生產(chǎn)的醒腦靜注射液為因變量（Y）。設(shè)定Y為1/3的矩陣（無錫濟(jì)民可信生產(chǎn)醒腦靜設(shè)為1，大理藥業(yè)股份有限公司設(shè)為2，河南天地藥業(yè)股份有限公司設(shè)為3）。所有的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到simcap軟件進(jìn)行聚類分析，利用其前3個主成分（PC1，PC2和PC3）進(jìn)行畫圖區(qū)分，3個主成分對于方差的總貢獻(xiàn)度為8769%。主成分分析的得分圖見圖2，無錫濟(jì)民可信生產(chǎn)醒腦靜注射液單獨(dú)位于右側(cè)，大理藥業(yè)股份有限公司和河南天地藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的醒腦靜注射液分別位于左上角和左下角，3者完全分類，說明本文建立的HPLC特征圖譜能有效區(qū)分3個廠家生產(chǎn)的醒腦靜注射液。主成分分析載荷圖見圖3，本研究所

A以S1醒腦靜注射液樣品為參照的共有模式；BS1～S21醒腦靜注射液供試品特征模式；C以S22 醒腦靜注射液樣品為參照的共有模式；DS22～S24醒腦靜注射液供試品特征模式；E以S25醒腦靜注射液樣品為參照的共有模式；FS25～S29 醒腦靜注射液供試品特征模式；4優(yōu)香芹酮；5樟腦；6姜黃烯酮；7莪術(shù)烯醇；8莪術(shù)二酮；9莪術(shù)酮；11吉馬酮。

建立的特征變量（共有特征峰）對不同廠家的分類模型總體方差影響均較大（各指標(biāo)離遠(yuǎn)點(diǎn)距離均較遠(yuǎn)），說明本研究選擇的共有峰均具有明顯的特征性，可作為不同廠家生產(chǎn)醒腦靜注射液HPLC特征圖譜的特征變量。

3討論

31色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中分別考察了3種色譜儀器（美國Waters e2695 高效液相色譜儀，美國HP1100高效液相色譜儀和日本島津LC20AT高效液相色譜儀）和5種色譜柱（Thermo BDS Hypersil C18，TopsilTM C18 ，Dikma spursil C18，Waters xtcrra C18和Wonda Sil C18）對醒腦靜注射液HPLC 特征圖譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同儀器對醒腦靜注射液HPLC特征圖譜影響不大，但色譜柱對其分離度有較大影響，其中Thermo BDS Hypersil C18（46 mm×250 mm，5 μm）和TopsilTM C18

2種色譜柱的分離效果最好，而其他3種色譜柱不能對各色譜峰進(jìn)行有效分離，因此實(shí)驗(yàn)中應(yīng)固定色譜柱為Thermo BDS Hypersil C18（46 mm×250 mm，5 μm）或TopsilTM C18（46 mm×250 mm，5 μm）。

實(shí)驗(yàn)中曾考察了不同比例甲醇水、乙腈水、甲醇甲酸水和乙腈甲酸水的洗脫效果，結(jié)果顯示乙腈甲酸水梯度洗脫效果最好，最終優(yōu)選流動相為乙腈002%甲酸水梯度洗脫。

32指紋圖譜分析

麝香酮和龍腦是醒腦靜注射液的主要成分和活性成分，因此，無論是醒腦靜注射液現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)還是圍繞其開展的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究都是針對這2個成分進(jìn)行定性定量分析，而對醒腦靜注射液中含有的其他微量成分鮮有涉及。但是，郁金中含有大量的倍半萜類成分如莪術(shù)二酮、莪術(shù)酮、吉馬酮、姜黃烯酮、莪術(shù)烯醇等，這些成分一樣可經(jīng)過水蒸氣蒸餾而被提取出來，而且這些成分具有明確的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血栓和改善血液循環(huán)等作用[1516]，這些作用與醒腦靜注射液的功能主治完全吻合，因此它們應(yīng)該是醒腦靜注射液的活性成分。同樣，梔子中也含有一定量的揮發(fā)性成分，如優(yōu)香芹酮、異佛爾酮、反、反2，4癸二烯醛等，而梔子揮發(fā)油具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥等作用，這些作用也與醒腦靜注射液的功能主治相吻合，因此也應(yīng)該是其活性成分[17]。當(dāng)采用GC或GCMS方法進(jìn)行研究時，由于麝香酮和龍腦的色譜峰過高，醒腦靜中這些微量成分的信息幾乎完全被掩蓋掉。但是，由于紫外吸收很弱，麝香酮和龍腦在HPLCUV檢測中則幾乎看不到色譜峰。因此本研究首次采用HPLCUV建立了醒腦靜注射液的特征圖譜，有效顯示了醒腦靜中除麝香酮和龍腦之外其他微量成分的信息，進(jìn)一步闡釋了醒腦靜注射液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，利用對照品指認(rèn)了其中7個主要色譜峰的結(jié)構(gòu)，為提升其質(zhì)量控制水平提供了依據(jù)。

醒腦靜注射液共有3個廠家生產(chǎn)，分別對21批無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)，3批大理藥業(yè)股份有限公司，5批河南天地藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的醒腦靜注射液進(jìn)行了HPLC 特征圖譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個廠家生產(chǎn)的醒腦靜注射液化學(xué)成分的整體輪廓基本一致，而且同一廠家生產(chǎn)的不同批次的醒腦靜注射液的相似度較高，但是不同廠家生產(chǎn)醒腦靜注射液中主要色譜峰的含量及不同色譜峰之間的比例有很大的不同。例如無錫濟(jì)民可信生產(chǎn)的醒腦靜注射液中9號峰（莪術(shù)酮）很明顯，相對峰面積均值為342 725，而其他廠家生產(chǎn)醒腦靜的9號峰的相對峰面積均值僅為74 675，相差近5倍。又如21批濟(jì)民可信和5批河南天地藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)醒腦靜注射液的HPLC圖譜中2個主要色譜峰6號（姜黃烯酮）和7號峰（莪術(shù)烯醇）的相對峰面積均值之比為08左右，而大理藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的二者之比則為305。以上化學(xué)成分含量和成分間比例的變化是否會導(dǎo)致藥效的改變值得深入探討。

市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，市場流通的醒腦靜注射液90%為無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)生產(chǎn)，因此收集其他廠家的醒腦靜注射液非常困難，本研究中僅僅收集到8批非濟(jì)民可信生產(chǎn)的醒腦靜注射液（大理藥業(yè)股份有限公司的3個批次，河南天地藥業(yè)股份有限公司的5個批次），樣本量較少，還不足以全面評估其他廠家生產(chǎn)醒腦靜樣品的質(zhì)量。今后研究中應(yīng)積累多批樣品進(jìn)行分析測定，以進(jìn)一步明確不同廠家生產(chǎn)醒腦靜樣品的異同，為合理制定該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]