徐小萍　賴瑞聯(lián)　林玉玲　賴鐘雄

摘 要 為探討真菌誘導(dǎo)子對龍眼胚性愈傷組織生長及多糖含量的影響。以龍眼胚性愈傷組織為材料，采用單因素分析法探究了真菌誘導(dǎo)子種類、誘導(dǎo)時間和濃度對龍眼胚性愈傷組織生長和多糖積累的影響。結(jié)果表明，不同真菌誘導(dǎo)子處理下龍眼胚性愈傷組織中多糖含量由高到低排序分別為：龍眼擬莖點霉>膠孢鐮刀菌>尖孢鐮刀菌；采用100 mg/L濃度的龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子誘導(dǎo)15 d，龍眼胚性愈傷組織多糖含量最高，比對照提高了61.34%，且不同處理間存在顯著差異。但真菌誘導(dǎo)子處理下龍眼胚性愈傷組織生長狀態(tài)較差，且增殖率顯著下降。龍眼擬莖點霉作為龍眼病原內(nèi)生菌，其活性誘導(dǎo)物能促進(jìn)龍眼胚性愈傷組織中多糖積累，從而一定程度上提高植物的免疫防御能力。研究結(jié)果為探究真菌誘導(dǎo)子對龍眼多糖合成和代謝機理的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 龍眼；真菌誘導(dǎo)子；多糖；胚性愈傷組織；增殖

中圖分類號 S667.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是中國南方熱帶亞熱帶名貴果樹。研究表明，龍眼果肉、果皮及枝葉等各組織器官中含有大量多糖[1-3]，尤其是龍眼果肉多糖成分具有較高的生物藥理活性，其含量高達(dá)64.27%，極具開發(fā)前景。多糖是生物體中重要初生代謝物質(zhì)，具有清除自由基、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗癌抗菌和抑制酪氨酸酶等生化功能[4-5]。作為一種重要活性成分，多糖還能增強神經(jīng)功能、治療神經(jīng)損傷、降血糖和抗腫瘤作用[6-8]。然而，以果肉等組織器官為原材料提取龍眼多糖易受季節(jié)、氣候等因素限制，開發(fā)一種高效多糖生產(chǎn)技術(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。

龍眼胚性愈傷組織具有較強的增殖和體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力，為龍眼藥用活性成分的研究生產(chǎn)提供了有效平臺[9-10]。且大量研究表明，植物愈傷組織在多糖生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用前景[11-13]。因此，筆者認(rèn)為研究龍眼胚性愈傷組織中的多糖積累有重要意義。真菌誘導(dǎo)子是來自微生物的生物活性物質(zhì)，能使植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)，并誘導(dǎo)植物積累特定的次生代謝產(chǎn)物[14]，提高植物的防御抗病能力。植物多糖在特定條件下參與某些次生代謝物合成，多糖合成代謝可能受真菌誘導(dǎo)子影響[15-16]，探究龍眼的致病內(nèi)生真菌與非龍眼內(nèi)生菌分別制備的誘導(dǎo)子對提高龍眼胚性愈傷組織多糖積累的影響有重要意義。研究表明龍眼果肉中可分離獲得龍眼擬莖點霉、鐮刀菌和炭疽菌，其中龍眼擬莖點霉分離率最高，達(dá)44%，其他2種分離率較低[17]。筆者推測真菌誘導(dǎo)子對龍眼胚性愈傷組織多糖誘導(dǎo)具有重要作用。因此，本試驗以龍眼胚性愈傷組織為材料，以3種真菌制備的誘導(dǎo)子為處理因子。采用單因素分析方法研究不同真菌誘導(dǎo)子種類、誘導(dǎo)時間和處理濃度對胚性愈傷組織生長和多糖積累的影響，并通過相關(guān)性和顯著性分析，為真菌誘導(dǎo)子對龍眼多糖合成代謝、信號識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用機理的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

龍眼‘紅核子（Dimocarpus longan Loμr. cv.Honghezi）胚性愈傷組織由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供[18]。3種真菌分別是龍眼擬莖點霉（Phomopsis longanae Chi）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、膠孢鐮刀菌（Fusarium subglutinans Wollenw. et Reinking），均由福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院贈送。

1.2 方法

1.2.1 不同種類誘導(dǎo)子處理龍眼胚性愈傷組織

參考Wang等[19]、林艷君等[20]的方法，獲得3種真菌誘導(dǎo)子。往龍眼胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基L1分別添加100 mg/L的3種真菌誘導(dǎo)子處理龍眼胚性愈傷組織，暗培養(yǎng)20 d，通過多糖含量測定篩選最適宜的誘導(dǎo)子類型。

1.2.2 不同誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)子濃度處理龍眼胚性愈傷組織 試驗進(jìn)一步采用單因素法分別探究處理15、20、25 d后龍眼胚性愈傷組織多糖積累情況，并設(shè)置對照試驗；其次在最適宜天數(shù)處理試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合前人研究報道[20]，分別采用0、50、100、200 mg/L濃度的誘導(dǎo)子進(jìn)行最佳濃度篩選。每個處理進(jìn)行3個重復(fù)，分別采用苯酚硫酸法進(jìn)行多糖含量測定[21]、愈傷組織狀態(tài)觀察和增殖系數(shù)統(tǒng)計。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及多糖測定 稱取0.1 g蔗糖干樣作為標(biāo)準(zhǔn)品，溶解定容至1 000 mL，依次稀釋成不同倍數(shù)的濃度，以紫外分光光度計在485 nm波長下測定的吸光值為縱坐標(biāo)，以糖濃度為橫坐標(biāo)，利用吸光值與總糖量成線性關(guān)系，制作多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，線性回歸方程為y=0.018 3x+0.004 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

多糖提取測定，采用苯酚硫酸法。稱取龍眼胚性愈傷組織干樣0.03 g，加1 mL的雙蒸水，沸水浴30 min，7 800 r/min常溫離心10 min，取上清液后重復(fù)該步驟2次，雙蒸水漂洗殘渣，離心，定容至10 mL；加5 mL石油醚，臺式恒溫振蕩器常溫200 r/min，10 min；靜置分層，棄上層溶液，下層溶液加2 mL氯仿 ∶ 正丁醇（5 ∶ 1）溶液，混勻至乳濁狀，靜置分層；取50 μL上層溶液，雙蒸水定容至2 mL；加1 mL 9%苯酚溶液，搖勻，加5 mL濃硫酸，搖勻。室溫下冷卻靜置30 min，紫外分光光度計485 nm波長測定吸光值。多糖含量計算公式：多糖含量（%）=X/（M/V1）*V2/V3×100%。其中X：樣品中多糖濃度（mg/mL），M：樣品質(zhì)量g，V1：首次樣品定容的體積10 mL，V2：稀釋時吸取的樣品體積50 μL，V3：稀釋后定容的體積2 mL，見圖1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖表制作，并采SPSS20.0進(jìn)行相關(guān)分析、方差分析和顯著性測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌誘導(dǎo)子對多糖含量的影響

2.1.1 真菌誘導(dǎo)子種類對多糖含量的影響 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗、單因素分析結(jié)合Duncan法進(jìn)行兩兩比較，如表1，結(jié)果表明3種真菌誘導(dǎo)子中龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子對龍眼胚性愈傷組織中多糖含量的影響達(dá)到極顯著性水平（α=0.01），多糖含量高達(dá)15.29%，尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子不利于胚性愈傷組織多糖積累，膠孢鐮刀菌誘導(dǎo)子對多糖積累誘導(dǎo)效果不顯著。因此，選用龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子對龍眼胚性愈傷組織進(jìn)行不同誘導(dǎo)天數(shù)和不同濃度的處理，進(jìn)一步探究多糖含量的積累情況。

2.1.2 誘導(dǎo)時間對龍眼胚性愈傷組織多糖含量的影響

篩選出最適的誘導(dǎo)子種類后，試驗進(jìn)一步對最適誘導(dǎo)時間進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子處理15 d時，最能促進(jìn)胚性愈傷組織多糖積累，處理25 d時對多糖積累也有促進(jìn)作用，但積累量最少。經(jīng)方差齊性檢驗、單因素方差分析、F檢驗及LSD多重比較數(shù)據(jù)分析表明，與對照相比，α=0.05顯著性水平下，龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子誘導(dǎo)不同時間對愈傷組織多糖積累具有顯著性影響。結(jié)合圖2分析，龍眼胚性愈傷組織在相同濃度不同誘導(dǎo)天數(shù)的龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子處理下，多糖含量隨誘導(dǎo)天數(shù)增加而減少，其中15 d時的多糖含量達(dá)到最高為17.99%，其次是20 d（14.27%），25 d時最低，僅為7.22%；與對照相比，多糖含量分別提高了61.34%、42.56%、12.04%?？梢?，龍眼胚性愈傷組織多糖積累與誘導(dǎo)時間密切相關(guān)，而15 d為最佳處理時間。

2.1.3 龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子濃度對多糖含量的影響

繼不同誘導(dǎo)天數(shù)處理后，進(jìn)一步探究誘導(dǎo)子濃度對龍眼胚性愈傷組織多糖含量影響。結(jié)果表明100 mg/L龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子最能促進(jìn)龍眼胚性愈傷組織多糖積累，其次是200 mg/L，多糖含量分別達(dá)到20.40%和19.92%，二者無顯著差異；而添加濃度為50 mg/L時對多糖積累作用不明顯（圖3），其他處理間的差異顯著性較為明顯。

2.2 龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子對龍眼胚性愈傷組織生長的影響

2.2.1 誘導(dǎo)時間對龍眼胚性愈傷組織生長的影響

用相同濃度100 mg/L龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子處理不同時間后，龍眼胚性愈傷組織生長情況如圖4、5所示。從形態(tài)上看，誘導(dǎo)20 d時胚性愈傷組織形態(tài)較松散淡黃，顆粒較小，15 d時愈傷組織形態(tài)松散淺黃，顆粒較小，可能是龍眼胚性愈傷組織正處于旺盛生長階段，25 d時形態(tài)較為緊實，出現(xiàn)顆?；F(xiàn)象；25 d增殖系數(shù)最高，15 d時增殖系數(shù)較小，20 d時增殖系數(shù)相對較高處于中間水平。SPSS20.0分析可知，不同誘導(dǎo)天數(shù)的誘導(dǎo)子對龍眼胚性愈傷組織增殖生長均具有顯著性影響，且經(jīng)誘導(dǎo)子處理后的龍眼胚性愈傷組織增殖系數(shù)整體較低，說明龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子明顯抑制龍眼胚性愈傷組織增殖生長。

2.2.2 誘導(dǎo)子濃度對龍眼胚性愈傷組織生長的影響

對不同濃度誘導(dǎo)子處理15 d時的龍眼胚性愈傷組織生長狀態(tài)和增殖系數(shù)進(jìn)行分析（圖6和圖7）。從總體上看，與對照相比，不同濃度誘導(dǎo)子對龍眼胚性愈傷組織生長均有抑制作用。而50 mg/L的誘導(dǎo)子有利于龍眼胚性愈傷組織正常形態(tài)維持，200 mg/L的誘導(dǎo)子不利于龍眼胚性愈傷組織正常生長，100 mg/L的誘導(dǎo)子處理下龍眼胚性愈傷組織雖顆粒稍大，但色澤較為正常。方差齊次性檢驗得p=0.11，大于0.05，單因素方差分析的F檢驗中p=0，小于0.05，說明不同濃度誘導(dǎo)子對龍眼胚性愈傷組織增殖生長具有顯著性影響，且添加100和200 mg/L的誘導(dǎo)子對龍眼胚性愈傷組織增殖生長均有極顯著性差異，但100 mg/L誘導(dǎo)子相對抑制作用最小，增殖系數(shù)為4.94，與對照相比減小40.48%?？梢?，50～200 mg/L的誘導(dǎo)子對龍眼胚性愈傷組織增殖生長均有抑制作用，而均衡多糖含量與龍眼胚性愈傷組織生長情況，選擇添加100 mg/L龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子，暗培養(yǎng)誘導(dǎo)15 d作為本試驗龍眼胚性愈傷組織多糖積累的最佳條件。

3 討論與結(jié)論

3.1 龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子促進(jìn)龍眼胚性愈傷組織多糖積累

本試驗研究認(rèn)為，龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子半活體營養(yǎng)型龍眼內(nèi)生真菌，其活性誘導(dǎo)物能促進(jìn)龍眼胚性愈傷組織中多糖含量的積累。白樺懸浮細(xì)胞中三萜系化合物會受擬莖點霉誘導(dǎo)子的影響[22]，進(jìn)一步證實了真菌誘導(dǎo)子能有效促進(jìn)植物次生代謝物合成。真菌誘導(dǎo)子能通過信號識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及信號轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的胞內(nèi)應(yīng)答等途徑，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而影響植物次生代謝物積累。龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子來源于龍眼果肉致病內(nèi)生菌-龍眼擬莖點霉[15]，該霉能產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶，降解細(xì)胞壁多糖，誘發(fā)龍眼果腐病[23-24]。陳藝輝等[25]研究發(fā)現(xiàn)龍眼擬莖點霉可以促進(jìn)酚類物質(zhì)積累使果皮褐變，病原菌侵染早期能引起果實細(xì)胞氧化迸發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)，增強植物體免疫防御能力；多糖作為初生代謝產(chǎn)物，也是植物細(xì)胞壁主要成分，不僅能作為眾多植物次生代謝物合成前體，還具有免疫、防御及抗逆等相關(guān)功能[26]。龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子可能通過誘導(dǎo)調(diào)控龍眼胚性愈傷組織中某些病原抗性基因，在病原侵染初期通過合成多糖來提高植物自身的免疫防御能力，這與江曙等[27]研究的明黨參內(nèi)生真菌能顯著促進(jìn)明黨參多糖積累一致。

研究表明，生物誘導(dǎo)子具有高效、專一及濃度效應(yīng)等特點[28-29]。本試驗認(rèn)為龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子較其他2種非龍眼內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子更能顯著提高龍眼胚性愈傷組織多糖含量。尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子對龍眼胚性愈傷組織多糖積累有一定抑制作用，與劉長軍等[30]的研究結(jié)論并不一致，可能由于同種誘導(dǎo)子響應(yīng)植物中同種次生代謝物合成的細(xì)胞受體的結(jié)合位點存在差異。也可能通過鈣調(diào)素、磷酸肌醇、G蛋白等誘導(dǎo)信號，以IP3-DAG-Ca2+/PKC系統(tǒng)、腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)的cAMP/PKA胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的第二信使傳遞系統(tǒng)，影響次生代謝物合成相關(guān)基因的表達(dá)，改變次生代謝通路，從而調(diào)節(jié)次生代謝物積累[31]。因此，研究龍眼本身致病內(nèi)生菌的生物活性物質(zhì)適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)時間、濃度及添加時間對龍眼本身多糖和次生代謝物的積累具有重要意義。

3.2 龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子抑制龍眼胚性愈傷組織生長

試驗中，添加100 mg/L龍眼擬莖點霉誘導(dǎo)子時發(fā)現(xiàn)，龍眼愈傷組織增殖生長抑制率達(dá)40.48%，這與陶金華等[32]研究的100 mg/L內(nèi)生真菌抑制茅蒼術(shù)細(xì)胞生長結(jié)果類似。誘導(dǎo)子對次生代謝物調(diào)節(jié)具有特異性，同時由于誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗毒素對細(xì)胞自身大多具有毒性，濃度過高有可能抑制細(xì)胞生長。且粗誘導(dǎo)物中誘導(dǎo)子的活性成分和拮抗成分相互制約，加量少時拮抗作用小，誘導(dǎo)作用也小，反之亦然。

在前人的研究中，劉長軍等[30]研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子在西洋參懸浮細(xì)胞培養(yǎng)前期能促進(jìn)細(xì)胞生長，而Zhu等[33]發(fā)現(xiàn)蛋白類誘導(dǎo)子在促進(jìn)靈芝酸合成的同時抑制了細(xì)胞生長。可見，誘導(dǎo)子促進(jìn)細(xì)胞生長與次生代謝物合成還可能和誘導(dǎo)子本身的活性成分種類有關(guān)，其可能和細(xì)胞間信號傳導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控等機制有關(guān)，這與添加非生物因子如激素、光質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)等因素對次生代謝物的誘導(dǎo)有所不同[34]。試驗研究結(jié)果可為在龍眼細(xì)胞組織培養(yǎng)生產(chǎn)中提高多糖含量提供科學(xué)依據(jù)。

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