李祖成　亢澤春　李淑翠　王垣芳

(濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院，山東　煙臺　264032)

1濱州醫(yī)學院

咖啡因?qū)λ邉儕Z老齡小鼠學習記憶及海馬抗氧化能力和膽堿能系統(tǒng)的影響

李祖成亢澤春1李淑翠1王垣芳1

(濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院，山東煙臺264032)

〔摘要〕目的探討咖啡因?qū)淆g睡眠剝奪小鼠學習記憶及海馬抗氧化能力和膽堿能系統(tǒng)的影響。方法昆明種雄性小鼠50只隨機分為正常睡眠組、睡眠剝奪模型組和咖啡因低、中、高劑量組(5,10,20 mg/kg)，采用小平臺水環(huán)境法進行睡眠剝奪連續(xù)72 h，同時灌胃給藥2次/d，正常睡眠組和模型組小鼠在相同時間灌服等體積的生理鹽水；各組小鼠每天灌胃1 h后進行Morris水迷宮試驗測試學習記憶能力，睡眠剝奪72 h后測定海馬組織中和乙酰膽堿含量、和乙酰膽堿酯酶(AChE)的活力。結(jié)果與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠Morris水迷宮定位航行試驗逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，空間探索試驗穿越原平臺位置的次數(shù)顯著增多(P<0.05)，小鼠海馬組織中AChE含量增加、MDA含量降低(P<0.05，P<0.01)，AChE和SOD活力增強(P<0.05，P<0.01)，GSH-Px活力無明顯變化(P>0.05)。結(jié)論咖啡因可以改善睡眠剝奪小鼠的學習記憶功能，其機制可能與增強海馬抗氧化能力及膽堿能系統(tǒng)功能有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕咖啡因；睡眠剝奪；記憶；海馬；膽堿能系統(tǒng)；抗氧化能力

老年人睡眠障礙和記憶障礙的發(fā)生率都很高，而睡眠障礙又可導致學習記憶功能下降〔1〕。而在睡眠障礙時，人們通常飲用咖啡以振奮精神和維持警覺。咖啡因是咖啡中的主要活性成分，屬甲基黃嘌呤類生物堿，具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、助消化、強心利尿等作用。研究表明，長期攝入咖啡或咖啡因可以改善認知功能，并增強腦內(nèi)抗氧化酶的活性〔2,3〕。然而，關(guān)于咖啡因?qū)λ邉儕Z導致記憶障礙的影響及機制的研究尚鮮見報道。本實驗通過Morris水迷宮試驗觀察咖啡因?qū)λ邉儕Z24、48 h和72 h小鼠學習記憶功能的影響，并通過檢測海馬抗氧化能力及膽堿能系統(tǒng)功能，探討咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠學習記憶的影響及其機制。

1材料與方法

1.1動物、藥品、試劑及主要儀器昆明種雄性老齡小鼠(12個月齡)，體質(zhì)量(40±2)g ，由山東綠葉制藥有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2009 0009。無水咖啡因(山東新華制藥股份有限公司，批號09111449)，乙酰膽堿酯酶(AChE)測試盒(批號20110420)、乙酰膽堿(ACh)測試盒(批號20110423)，均購于南京建成生物工程研究所。Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所研制)；EL204電子分析天平(METTLER-TOLEDO儀器有限公司)；超低溫冰箱(美國Thermo公司)；XB 70型制冰機(GRANT公司)；5810R型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；微量加樣器(德國Eppendorf公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司)；SYNERGY HT型酶標儀(BIO-TEK公司)。

1.2分組、造模與給藥采用Morris水迷宮篩選出定位航行試驗成績相近的雄性小鼠50只，隨機分為5組：正常睡眠組、睡眠剝奪模型組和咖啡因高、中、低劑量組。采用小平臺水環(huán)境法〔4〕對模型組和咖啡因各劑量組小鼠進行睡眠剝奪，即在每個鼠籠中央設(shè)置一個直徑2.5 cm、高4.0 cm的平臺，鼠籠內(nèi)注水，水面低于平臺1 cm，水溫保持(20±0.5)℃。將1只小鼠放置在平臺上，小鼠可以在平臺上站立，也可自由攝取食物和水，但當進入快速眼動(REM)睡眠時，由于骨骼肌松弛可使小鼠掉入水中而驚醒，造成REM剝奪使小鼠不能入睡，連續(xù)72 h。正常睡眠組小鼠單籠喂養(yǎng)，自由睡眠，室內(nèi)溫度控制在(20±0.5)℃?？Х纫蚋?、中、低劑量組分別給予咖啡因20，10，5 mg/kg灌胃，正常睡眠組和睡眠剝奪模型組在相應時間點給予等容量的生理鹽水灌胃。

1.3Morris水迷宮法測試小鼠學習記憶能力〔5〕

1.3.1Morris水迷宮測試裝置Morris水迷宮由直徑120 cm的圓形水池、高50 cm的平臺和記錄系統(tǒng)三部分組成。水池水深25 cm(高出平臺1 cm)，水溫控制在(23±0.5)℃，在水池邊緣上等距離設(shè)東、西、南、北四個標記點，將水池等分為4個象限，平臺置于第一象限。攝像機安置于水池上方1.5 m 處并與計算機連接，利用記錄系統(tǒng)對小鼠的活動進行全程跟蹤，并記錄游泳軌跡、游泳路徑長度、找到平臺所需時間(即逃避潛伏期)。實驗室掛窗簾避光，每次試驗保持水迷宮外所有參照物保持不變。

1.3.2定位航行試驗(PNT)各組小鼠在每天給藥1 h后進行定位航行試驗。按第Ⅰ至第Ⅳ象限的順序?qū)⑿∈竺姹诜湃胨刂?，每次入水間隔時間為20 min。系統(tǒng)自動錄像記錄小鼠入水后找到并爬上平臺(停留時間>3 s)的游泳時間即逃避潛伏期(LE)、游泳路程和游泳速度。每次觀察時間為60 s，如果在60 s內(nèi)動物未能找到平臺，則由實驗者將其引導至平臺，并在站臺上停留10 s，潛伏期記為60 s。將每天4個象限的逃避潛伏期和游泳路程的平均數(shù)分別作為當天的成績。逃避潛伏期越短，表明學習記憶獲得和鞏固的能力越強。

1.3.3空間搜索試驗(SPT)各組小鼠最后一次PNT后撤除平臺，將小鼠從最后一次入水點面向池壁放入水中，使其在水迷宮中連續(xù)游泳，記錄小鼠的游泳路程和60 s內(nèi)穿越原平臺所在位置的次數(shù)作為空間搜索試驗的成績。穿越原平臺的次數(shù)越多，表明小鼠對空間位置的短期記憶和判斷能力(即空間探索能力)越強。

1.4海馬膽堿能系統(tǒng)功能檢測水迷宮測試結(jié)束后，將小鼠迅速斷頭取腦，于冰面上分離兩側(cè)海馬，稱重，按重量/體積比1∶9加入試劑盒指定的溶液液，制成約10%勻漿，3 000 r/min 4℃離心10 min，留上清液，采用化學比色法測定ACh含量和AChE活力。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2結(jié)果

2.1咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠逃避潛伏期的影響與正常睡眠組比較，模型組小鼠睡眠剝奪24 h、48 h和72 h后PNT逃避潛伏期均延長(P<0.05)；與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠睡眠剝奪24 h、48 h和72 h后逃避潛伏期均縮短(P<0.05)。見表1。

2.2咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠游泳路程的影響 與正常睡眠組比較，模型組小鼠睡眠剝奪24 h、48 h和72 h后定位航行試驗游泳路程延長(P<0.05)；與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠睡眠剝奪48 h和72 h后游泳路程均縮短(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1　咖啡因?qū)π∈驧orris水迷宮試驗逃避潛伏期及對定位航行試驗游泳路程的影響±s)

與正常睡眠組比較：1)P<0.05；與睡眠剝奪模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.01，下表同

2.3咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠空間探索能力的影響 與正常睡眠組比較，模型組小鼠睡眠剝奪72 h后空間探索試驗穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)；與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠睡眠剝奪72 h后空間探索試驗穿越平臺次數(shù)增多(P均<0.05)，以咖啡因高、中劑量組為明顯(P<0.01)。與正常睡眠組比較，模型組小鼠睡眠剝奪72 h后游泳路程縮短(P<0.05)；與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠睡眠剝奪72 h后游泳時間均延長(P均<0.05)，以咖啡因高、中劑量組為明顯(P<0.01)。見表2。

表2　咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠空間探索能力的影響±s)

2.4咖啡因?qū)λ邉儕Z小海馬ACh含量及AChE活力的影響與正常睡眠組比較，模型組小鼠睡眠剝奪72 h后海馬組織ACh含量降低、AChE活力增高(P<0.05)。與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠海馬組織ACh含量增加、AChE活力降低(P均<0.05)，以咖啡因高劑量組更為顯著。見表3。

表3　咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠海馬ACh含量及

3討論

研究表明，長時間的睡眠缺失或睡眠剝奪對人和動物的短時記憶、記憶的保持和鞏固、長時記憶的形成均有不良影響〔6,7〕。小平臺水環(huán)境法是研究SD的常用方法，該方法主要剝奪動物的(REM)睡眠〔4〕。REM睡眠對記憶的獲得具有重要意義，REM睡眠剝奪可損害學習記憶功能〔8〕。本實驗結(jié)果表明小鼠睡眠剝奪24～72 h后學習記憶能力下降。在睡眠剝奪的同時應用咖啡因5～20 mg/kg，可使小鼠睡眠剝奪24 h、48 h和72 h后定位航行試驗逃避潛伏期縮短、游泳路程縮短，且空間探索試驗穿越平臺次數(shù)增加，表明咖啡因可以改善睡眠剝奪小鼠的學習記憶功能。

海馬是與學習記憶有關(guān)的重要腦區(qū)，多年來已經(jīng)成為研究學習記憶機制的重要解剖結(jié)構(gòu)。研究證實，腦內(nèi)投射至海馬結(jié)構(gòu)的膽堿能系統(tǒng)與學習記憶有關(guān)，海馬內(nèi)豐富的ACh遞質(zhì)是促進學習記憶的重要遞質(zhì)〔9,10〕，AChE是ACh的水解酶，其活性直接影響海馬ACh水平。本實驗結(jié)果表明睡眠剝奪導致了小鼠海馬膽堿能系統(tǒng)功能減弱，這與文獻報道一致〔11〕。在睡眠剝奪的同時應用咖啡因5～20 mg/kg，可使小鼠海馬ACh含量增加、AChE活力降低，提示咖啡因可以使睡眠剝奪小鼠海馬膽堿能系統(tǒng)的功能增強。

目前認為，睡眠剝奪作為一種高強度的應激可對大腦皮質(zhì)和海馬產(chǎn)生氧化應激損傷〔12，13〕。本實驗結(jié)果提示咖啡因?qū)λ邉儕Z引起的小鼠海馬氧化應激反應具有抑制作用。

綜上，適量的咖啡因可以改善睡眠剝奪老齡小鼠的學習記憶能力，其機制可能與增強海馬膽堿能系統(tǒng)的功能有關(guān)。

4參考文獻

1Jeffrey M,Ellenbogen MD.Cognitive benefits of sleep and their loss due to sleep deprivation〔J〕.Neurology,2005;1(2):25-7．

2Abreu RV,Silva-Oliveira EM,Moraes MF,etal.Chronic coffee and caffeine ingestion effects on the cognitive function and antioxidant system of rat brains〔J〕.Pharmacol Biochem Behav,2011;99(4):659-64.

3Li Z,Lu G,Yang X,etal.Single and combined effects of selected pharmaceuticals at sublethal concentrations on multiple biomarkers in Carassius auratus〔J〕.Ecotoxicology,2012;21(2):353-61.

4Youngblood BD,Zhou J,Smagin GN,etal.Sleep deprivation by the “flower pot” technique and spatial reference memory〔J〕.Physiol Behav,1997;61(2):249-56.

5陳雅慧,李寶莉,符兆英,等.復方酸棗仁梔子油膠囊對大鼠空間學習記憶能力的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(3):612-4.

6Diekelmann S,Landolt HP,Lahl O,etal.Sleep loss produces false memories〔J〕.PLoS One,2008;3(10):e3512.

7劉芳娥,劉利兵,化前珍,等.褪黑素對睡眠剝奪大鼠記憶的影響〔J〕.中國心理衛(wèi)生雜志,2006;20(3):147-9.

8李訓軍,嚴家川,潘峰,等.REM 睡眠剝奪對大鼠額葉皮質(zhì)5-HT的含量及學習記憶的影響〔J〕.重慶醫(yī)學，2009;38(10):1151-4.

9Wang XB,Zeng YM,Duan SM,etal.M1 and M2 muscarinic receptors in the hippocampus and fear activated memory and the content of glutamate in amygdale〔J〕.Chin Pharmacol Bull,2006；22(2):244-7.

10趙爽,張勝昌,王淑秋.靈芝孢子粉對戊四氮慢性點燃大鼠學習記憶及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿酯酶活性的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(2):354-6.

11Kalonia H,Bishnoi M,Kumar A.Possible mechanism involved in sleep deprivation-induced memory dysfunction〔J〕.Methods Find Exp Clin Pharmacol，2008；30(7):529-35.

12Kumar A,Singh A,Kumar P.Possible involvement of GABAergic mechanism in protective effect of melatonin against sleep deprivation-induced behavior modification and oxidative damage in mice〔J〕.Indian J Exp Biol,2011;49(3):211-8.

13Kumar A,Garg R.Possible role of trazodone and imipramine in sleep deprivation-induced anxiety-like behavior and oxidative damage in mice〔J〕.Methods Find Exp Clin Pharmacol,2009;31(6):383-7.

〔2014-12-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：山東省自然科學基金項目(No.ZR2011HM059)；煙臺市科學技術(shù)發(fā)展計劃(No.2009168)

通訊作者：王垣芳(1963-)，女，教授，碩士，主要從事合成藥物與天然藥物生物學活性研究。

〔中圖分類號〕R743

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2583-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.008

第一作者：李祖成(1962-)，男，副教授，碩士，主要從事神經(jīng)生理學研究。