劉黎明　張建軍　胡東輝

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北　武漢　430065)

抗纖軟肝膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

劉黎明張建軍1胡東輝1

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢430065)

〔摘要〕目的探討抗纖軟肝膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。方法66只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)數(shù)字表法中選取66個(gè)數(shù)字依大小排列，前12個(gè)為正常組，中36個(gè)為模型組，后18個(gè)為干預(yù)組，通過腹腔注射四氯化碳(CCl4)法制備大鼠肝纖維化模型，應(yīng)用蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson三色染色觀察肝組織形態(tài)變化，免疫組化法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果三組羥脯氨酸(Hyp)含量差異顯著(P<0.05)，其中模型組和干預(yù)組高于正常組，模型組高于干預(yù)組(P<0.05)。免疫組化染色顯示Bax蛋白主要分布在肝細(xì)胞質(zhì)、Bcl-2蛋白主要分布在肝纖維間隔和匯管區(qū)。三組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)差異顯著(P<0.05)，其中正常組和干預(yù)組低于模型組，正常組低于干預(yù)組(P<0.05)，三組Bax/Bcl-2比值統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論抗纖軟肝膠囊可能降低肝細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)，減輕肝損傷。

〔關(guān)鍵詞〕抗纖軟肝膠囊；肝纖維化；Bax；Bcl-2蛋白

肝纖維化是各種慢性肝病的病理基礎(chǔ)，由各種致病因子導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，文獻(xiàn)顯示肝纖維化嚴(yán)重程度與肝細(xì)胞凋亡增加，星狀細(xì)胞活化增加、凋亡減少相關(guān)聯(lián)〔1〕。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)、Bax蛋白的表達(dá)變化決定了肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞(HSC)凋亡，進(jìn)而影響纖維化的進(jìn)程〔2〕?？估w軟肝膠囊是一種中藥制劑，研究發(fā)現(xiàn)可能在肝纖維化治療方面具有一定效果〔3〕。本文旨在研究抗纖軟肝膠囊對(duì)肝纖維化大鼠肝組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。

1資料與方法

1.1動(dòng)物及分組選取清潔級(jí)Wistar雄性大鼠66只，購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證書：醫(yī)動(dòng)字第09-012號(hào)，體重180～200〔平均(190.58±2.35)〕g，同時(shí)購(gòu)買配套大鼠飼料4袋。將所有大鼠用數(shù)字編號(hào)，隨機(jī)數(shù)字表法選取66個(gè)數(shù)字，按照大小排列，前12個(gè)為正常組，中36個(gè)為模型組，后18個(gè)為干預(yù)組。

1.2試劑及藥物500 ml精制四氯化碳(CCl4)試劑購(gòu)自歐陸科儀(中國(guó))有限公司，橄欖油購(gòu)自中國(guó)蘇格拉蒂橄欖油有限公司，Bcl-2抗體和Bax 抗體均購(gòu)自英國(guó)艾美捷科技有限公司，SASC(Strept Avidin-Biotin Complex)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物制品公司，大鼠羥脯氨酸(Hyp)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物研究所?？估w軟肝膠囊購(gòu)自湖北省中醫(yī)院(鄂藥制字Z20113151，成分：土鱉蟲10 g，鱉甲10 g，茵陳蒿20 g，丹參30 g，三七6 g，桃仁10 g，當(dāng)歸10 g，莪術(shù)10 g，炮山甲6 g，白術(shù)10 g，薏苡仁20 g，黃芪10 g。

1.3研究方法

1.3.1動(dòng)物肝纖維化模型制備和肝標(biāo)本制備Wistar雄性大鼠66只,正常喂養(yǎng)1 w，正常組等滲鹽水腹腔注射(0.2 m1/100 g)，2次/w，共8 w，同時(shí)按每100 g體質(zhì)量2 ml給予等滲鹽水灌胃，1次/d，共8 w，觀察至14 w；模型組和干預(yù)組以30%CCl4橄欖油溶液(0.2 ml/100 g)腹腔注射，2次/w，共8 w，CCl4造模同時(shí)按每100 g體質(zhì)量2 ml給予等滲鹽水灌胃，1次/d，共8 w，停CCl4觀察至14 w(逆轉(zhuǎn)6 w)，其中干預(yù)組造模同時(shí)按大鼠體質(zhì)量2 ml/100 g給予含抗纖軟肝膠囊生藥0.046 g/ml藥液灌胃，1次/d，共8 w。干預(yù)組分別于第4、6、8周末隔夜空腹處死大鼠各6只；正常組和模型組分別于第4、6、8、10周(逆轉(zhuǎn)2 w)、12 w(逆轉(zhuǎn)4 w)、14 w(逆轉(zhuǎn)6 w)末隔夜空腹處死正常組各2只、模型組各6只大鼠，留取血清；迅速取部分肝組織以4%中性甲醛固定，用于肝組織病理及免疫組織化學(xué)染色觀察。

1.3.2肝組織Hyp測(cè)定和組織學(xué)觀察精確稱取肝臟組織濕重30～100 g放入試管中，加入水解液1 ml，混勻加蓋后95℃水解20 min，配置肝組織水解液，調(diào)節(jié)pH值6.0～6.8，同時(shí)設(shè)定空白管、標(biāo)準(zhǔn)管等，嚴(yán)格按照試劑盒要求步驟操作。

取適量大鼠肝組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，制作肝臟組織切片，利用蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson三色染色，倒置顯微鏡10倍下觀察細(xì)胞形態(tài)或者改變等，并且觀察肝纖維化情況。

1.3.3Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)測(cè)定將經(jīng)過石蠟包埋肝組織進(jìn)行切片，厚度5 μm，然后進(jìn)行Bax和Bcl-2免疫組化染色和SABC法顯示Bax和Bcl-2蛋白分布，按照SABC試劑盒要求步驟嚴(yán)格進(jìn)行。光鏡下觀察肝組織病變、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)分布，免疫組化染色陽(yáng)性出現(xiàn)棕黃色顆粒和線性沉積于細(xì)胞質(zhì)、間隔等，Bax和Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)以已確診Bcl組織為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)為一抗陰性對(duì)照，每張切片選取5個(gè)視野(400倍)，利用形態(tài)分析軟件分析陽(yáng)性面積所占比例，取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1肝組織Hyp測(cè)定和組織學(xué)觀察正常組Hyp為(0.23±0.08)μg/ml，模型組為(0.45±0.21)μg/ml，干預(yù)組為(0.32±0.06)μg/ml，差異顯著(F=3.565，P=0.035)，其中模型組和干預(yù)組均高于正常組(t=4.564、3.342,P=0.021、0.038)，模型組高于干預(yù)組(t=3.876，P=0.032)。

組織學(xué)觀察：HE染色顯示正常組織結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞形態(tài)完整，無明顯凋亡現(xiàn)象；模型組組織結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞脂質(zhì)變性，具有明顯纖維組織增生；干預(yù)組組織結(jié)構(gòu)受到破壞，肝細(xì)胞脂質(zhì)變性，纖維組織增生，但是均無模型組嚴(yán)重。Masson三色染色顯示正常組僅顯示少量藍(lán)色纖維；模型組藍(lán)色纖維明顯增加，并且相互交織形成纖維間隔；干預(yù)組藍(lán)色纖維有所減少，纖維多分布與血管周圍和匯管區(qū)。

2.2Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)免疫組化染色顯示Bax在正常組肝組織中央靜脈以及肝竇少量表達(dá)，為淺棕黃色；模型組主要在肝細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)深棕黃色，在肝纖維間隔和匯管區(qū)淺黃色。Bcl-2在正常組細(xì)胞質(zhì)、中央靜脈底表達(dá)，為淺棕黃色；在肝纖維間隔和匯管區(qū)高表達(dá)，為深棕黃色。三組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)差異顯著(P<0.05)，其中正常組和干預(yù)組均低于模型組，正常組低于干預(yù)組(P<0.05)，三組Bax/Bcl-2比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　三組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

與模型組相比：1)P<0.05，與正常組相比：2)P<0.05

3討論

肝纖維化是一個(gè)病理生理過程，是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生〔4〕。任何肝臟損傷在肝臟修復(fù)愈合的過程中都有肝纖維化的過程，如果損傷因素長(zhǎng)期不能去除，纖維化的過程長(zhǎng)期持續(xù)就會(huì)發(fā)展成肝硬化，嚴(yán)重?fù)p傷肝臟功能〔4〕。肝纖維化是肝臟損傷、肝臟炎癥、肝細(xì)胞壞死、HSCs激活等的中心環(huán)節(jié)〔5〕。HSCs是肝臟的一種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，位于Disse間隙內(nèi)，是肝纖維化時(shí)大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及膠原過多產(chǎn)生的主要來源細(xì)胞，其激活和增殖在肝纖維化發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用〔6〕；靜止的HSCs被激活后大量增殖，表達(dá)各種細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白〔7〕；分泌大量細(xì)胞因子、產(chǎn)生金屬蛋白酶抑制物，誘導(dǎo)生成〔8〕；若病因持續(xù)存在，導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)和血液循環(huán)異常，誘發(fā)肝硬化發(fā)生。目前肝移植是嚴(yán)重肝病唯一有效的治療措施，但肝纖維化在某種程度上可逆轉(zhuǎn)，抑制HSCs 激活、促進(jìn)其凋亡，是肝纖維化恢復(fù)的主要機(jī)制。

肝細(xì)胞凋亡主要有內(nèi)源性途徑和外源性途徑〔9〕，這兩種途徑都伴隨著線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要蛋白為Bcl-2家族。Bcl-2和Bax分別作為Bcl-2家族中抗凋亡和促凋亡的代表蛋白，在細(xì)胞凋亡機(jī)制中起著重要作用〔10〕。Bax誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡表達(dá)與定位改變相關(guān)，正常細(xì)胞中Bax主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)〔11〕，受到損傷后，Bax將重新定位，促使線粒體孔道形成，引起細(xì)胞色素C的釋放，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡時(shí)，Bax通過破壞線粒體膜的完整性發(fā)揮作用，而Bcl-2則在線粒體外膜發(fā)揮作用，以維持膜的完整性。

Hyp在膠原蛋白中占13.4%，在彈性蛋白中含量極少，其他蛋白中基本不存在，膠原蛋白大多分布在皮膚、腱、軟骨、血管等處，因此Hyp可以較好反映結(jié)締組織疾病的膠原代謝情況。本研究結(jié)果說明給予干預(yù)大鼠抗纖軟肝膠囊后大鼠肝細(xì)胞過度凋亡情況有所改善，并且Bcl-2蛋白表達(dá)降低，可以誘導(dǎo)HSCs凋亡等?？估w軟肝膠囊進(jìn)入可能激活線粒體依賴凋亡途徑，促使線粒體膜電位降低，促使Bcl-2家族蛋白活化，通過導(dǎo)致Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)降低發(fā)揮作用?？估w軟肝膠囊可能通過降低肝細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)途徑，尤其是在肝細(xì)胞質(zhì)、纖維間隔、匯管區(qū)等區(qū)域Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax表達(dá)水平動(dòng)態(tài)變化的影響，減少肝細(xì)胞凋亡和促進(jìn)HSC細(xì)胞凋亡，減輕肝損傷，為研究抗肝纖維化的作用機(jī)制、臨床治療提供理論依據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-06-24修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項(xiàng)目：湖北省2011年度科研項(xiàng)目(No.JX5B39)

通訊作者：胡東輝(1984-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合肝病方面的研究。

〔中圖分類號(hào)〕R57

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2615-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.021

1湖北省中山醫(yī)院肝病科

第一作者：劉黎明(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合肝病方面的研究。