馬長春　徐　平　魏　媛　虎　力　溫佩彤　張　潮

(上海中醫(yī)藥大學，上?！?01203)

預(yù)防性電針對不同月齡大鼠組織自由基及其骨骼肌中MyoD、Myogenin和eMyHC相關(guān)蛋白表達的影響

馬長春1徐平魏媛2虎力溫佩彤張潮

(上海中醫(yī)藥大學，上海201203)

〔摘要〕目的探討預(yù)防性電針干預(yù)后對不同月齡大鼠組織自由基的影響及機制。方法將30只雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組3個組和電針組3個組，各組分別為8MN組，14MC組，16MC組；14MEA6組，16MEA6組和16MEA8組。麻醉后快速取腓腸肌，Western印跡測定大鼠腓腸肌中MyoD、Myogenin和eMyHC相關(guān)蛋白表達。結(jié)果16MEA6組骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)活力明顯上升；14MEA6組骨骼肌丙二醛(MDA)值明顯下降，血清SOD活力顯著上升，血清MDA值明顯下降。14MEA6組MyoD值、Myogenin值、eMyHC值比14MC組均有明顯上升，16MEA6組MyoD值比16MC組有顯著上升，16MEA8組Myogenin值比16MC組有明顯上升。結(jié)論預(yù)防性電針干預(yù)增齡性大鼠后，顯著提高了機體的抗氧化能力，減輕自由基損傷，尤其在8月齡開始干預(yù)，較佳干預(yù)周期為6個月。此外，對衰老大鼠的預(yù)防性干預(yù)作用與IGF-1/AKT信號相關(guān)的骨骼肌再生有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕預(yù)防性電針；增齡衰老；低頻電針

骨骼肌萎縮與胰島素樣生長因子(IGF)-1信號通路關(guān)系密切〔1,2〕，目前研究〔3〕發(fā)現(xiàn)運動可以使IGF-1在局部骨骼肌組織內(nèi)表達增高。IGF-1的局部作用體現(xiàn)在肌細胞形成過程中,可促進肌細胞分化。嚴金慧等〔4〕發(fā)現(xiàn)吊尾去負荷模型的大鼠比目魚肌萎縮可能與內(nèi)源性IGF-1多肽下降有關(guān),隨后用小強度耐力練習對其進行干預(yù),發(fā)現(xiàn)比目魚肌恢復更快,這可能由IGF-1多肽表達增加實現(xiàn)。 本研究選用足三里及腎俞作為針刺的穴位，從先天腎精和后天脾胃的角度出發(fā)，對預(yù)防增齡性骨骼肌萎縮進行研究。

1材料與方法

1.1動物健康6月齡雄性SD大鼠，30只，體質(zhì)量(420±20)g，清潔級，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(滬)2013-0016。

1.2主要實驗試劑與藥品超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，MyoD、Myogenin、內(nèi)參GAPDH均購于美國abcam公司，eMyHC購于美國DSHB公司，ATP購于美國Fermentas公司。

蛋白定量采用Bradford法，波長595 nm測定蛋白濃度，用標準牛血清白蛋白繪制標準曲線，對制備樣品蛋白溶液定量。

1.3主要實驗儀器老年大鼠固定裝置(上海中醫(yī)藥大學自制)；針灸針(0.25 mm×25 mm，無錫佳健醫(yī)療器械公司)；分光光度計(UV-2000)，上海UNICO；離心機(MICRO 17TR)，韓國Hanil公司；搖床(TS-92)(其林貝爾)；電泳儀(MV-3)和轉(zhuǎn)膜儀(ST-2)(J-MAX)；PCR儀(2720型)(美國ABI公司)；電泳槽(Mupid 2plus)(日本TAKARA公司)；凝膠成像系統(tǒng)(EUV-LDUV)(韓國KoreaBiotech公司)。

檢測骨骼肌組織SOD活力和MDA含量結(jié)果顯示：(1)與8MN組相比，14MC組和16MC組骨骼肌SOD活力顯著降低(P<0.01)；與14MC組相比，14MEA6組骨骼肌SOD活力升高，但差異不顯著；與16MC組相比，16MEA6組骨骼肌SOD活力明顯升高(P<0.05)。(2)與8MN組相比，14MC組骨骼肌MDA值明顯上升(P<0.01)；16MC組骨骼肌MDA值明顯上升(P<0.05)；與14MC組相比，14MEA6組骨骼肌MDA值明顯下降(P<0.05)；與16MC組相比，16MEA6組和16MEA8組骨骼肌MDA含量降低，但沒有明顯差異，見表2。

1.4.5Western印跡測定大鼠腓腸肌中蛋白表達取腓腸肌組織50 mg，粉碎后高速離心，按照BCA蛋白定量試劑盒說明測定蛋白濃度。用分光光度計測定蛋白濃度，加入6倍藍色電泳上樣緩沖液60 μl，將蛋白在沸水中煮5 min后，以20 μl的量上樣至SDS-PAGE膠加樣孔。用PVDF膜，電壓100 V，置于冰浴中進行轉(zhuǎn)膜2 h。將5 g脫脂奶粉加入到100 ml TBS緩沖液配置5%封閉液，將膜置于封閉液中搖擺30 min后，用封閉液將膜立即放入稀釋好的MyoD、Myogenin和eMyHc一抗，并置于搖床上均勻搖擺，4℃過夜，用TBS-T洗3次，每次5 min。用封閉液將膜立即放入稀釋好的二抗( 1∶1 500的比例)中，放置在搖床上室溫內(nèi)均勻搖擺2 h，用TBS-T洗3次，每次5 min。將膜置于紅外熒光掃描成像系統(tǒng)上掃描。以GAPDH作為內(nèi)參，校正并計算蛋白灰度值。

1.4.1動物分組和造模大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為正常對照組3個組(分別從6月齡飼養(yǎng)至8、14、16月齡)：8個月正常組(8MN組)，14個月正常組(14MC組)和16個月正常組(16MC組)；電針組分為3個組(分別從8月齡電針干預(yù)至14、16月齡和從10月齡電針6個月)：14月齡電針6個月組(14MEA6組)，16月齡電針6個月組(16MEA6組)和16月齡電針8個月組(16MEA8組)。各組大鼠均自由飲水和飲食，室溫(25±1)℃，光照明暗各12 h(7∶00～19∶00開燈，19∶00～7∶00熄燈)。

1.4.4大鼠血清、骨骼肌SOD活力和MDA含量將大鼠比目魚肌與0.1 mol/L PBS(pH7.4)按1 g∶9 ml比例在冰浴條件下用電動勻漿機勻漿后，以3 500 r/min離心5 min，取上清、分裝，置于-80℃恒溫冰箱內(nèi)保存，集中檢測。從低溫冰箱中取出事先分離好的血清和組織勻漿上清液，嚴格依試劑盒說明檢測骨骼肌和血清中SOD活力及MDA含量。

1.5統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS19.0軟件，多組計量資料使用單因素方差分析法(one-way ANOVA)。

1.4.2動物干預(yù)方法采用自制老年大鼠固定裝置固定，電針組參照《實驗針灸學》對足三里和腎俞定位。用0.25 mm×25 mm毫針針刺雙側(cè)足三里和腎俞穴，接華佗牌G6805-Ⅱ型電針儀，采用疏密波，頻率2 Hz，以大鼠四肢輕微抖動為度，通電時間15 min，每周3次，隔日1次，3 w后休息1 w為1個療程。正常對照組不進行電針，但與電針組一樣固定。

1.4方法

1.4.3標本采集末次電針48 h后，用2%戊巴比妥鈉麻醉，迅速完整剝離SD大鼠腓腸肌和比目魚肌，將腓腸肌和比目魚肌分別用錫紙包裹并標記后立即置于液氮中，待所有標本收集結(jié)束后立即將標本放置在-80℃超低溫冰箱保存以備用，分別用于Western印跡和定量PCR檢測。打開腹腔，腹主動脈采血，用臺式離心機分離血清后備用，與取出的比目魚肌一同用于檢測SD大鼠血清和骨骼肌中SOD活力和MDA含量。

2結(jié)果

測定血清、肌肉中SOD、MDA水平可以推測機體整體和肌肉中自由基生成和抗氧化能力，有效推斷機體整體和肌肉衰老的程度。目前多數(shù)研究者證明〔5，6〕，人體血清的SOD值與年齡增長呈負相關(guān)，MDA的產(chǎn)生與年齡增長呈正相關(guān)，這就提示機體的衰老程度可以通過體內(nèi)血清的SOD和MDA值來判定〔7,8〕。與這一結(jié)果一致，本研究中，14月齡和16月齡SD大鼠抗氧化能力急劇下降，氧自由基過量積聚，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物增多，增齡性氧化應(yīng)激增強。提示8月齡大鼠通過預(yù)防性電針6個月后，改善了衰老，降低了肌肉MDA值。

工程機械電氣自動化維護技術(shù)包含電氣設(shè)備的監(jiān)測、故障維修，完善的維護制度是確保工程機械電氣自動化維護技術(shù)實施一個重要因素，它確保了自動化設(shè)備維護工作的正常運行，而且保證了電氣設(shè)備的監(jiān)測和故障維修的科學性。同時，嚴格要求維護人員詳細的記錄設(shè)備日常的運行情況，根據(jù)設(shè)備運行狀況有針對性的制度方案，預(yù)防設(shè)備可能出現(xiàn)。

2.2預(yù)防性電針干預(yù)對MyoD、Myogenin和eMyHC蛋白表達的影響與8MN組相比，14MEA6組eMyHC值明顯上升(P<0.05)；與14MC組相比，14MEA6組MyoD值、Myogenin值、eMyHC值均明顯上升(P<0.05)，見圖1。與8MN組相比，16MEA8組eMyHC值明顯上升(P<0.05)；與16MC組相比，16MEA6組MyoD值顯著上升(P<0.01)，16MEA8組Myogenin值顯著上升(P<0.05)，見圖2。

表1　各組大鼠血清、骨骼肌SOD活力、MDA含量比較

與8MN組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與14MC組比較：3)P<0.05,4)P<0.05；與16MC組比較：5)P<0.05

與14MC組比較：1)P<0.05；與8MN組比較：2)P<0.05圖1　預(yù)防性電針后14月齡大鼠骨骼肌信號蛋白MyoD、Myogenin和eMyHC表達變化

與16MC組比較：1)P<0.01；與8MN組比較：2)P<0.05圖2　預(yù)防性電針后16月齡大鼠骨骼肌信號蛋白MyoD、Myogenin和eMyHC表達變化

3討論

2.1預(yù)防性電針干預(yù)對大鼠血清、骨骼肌SOD活力和MDA含量的影響檢測血清SOD活力和MDA含量結(jié)果顯示：(1)與8MN組相比，14MC組和16MC組血清SOD活力顯著降低(P<0.01)，與14MC組相比，14MEA6組血清SOD活力顯著上升(P<0.01)；與16MC相比，16MEA8組血清SOD活力明顯上升(P<0.05)，16MEA6組升高，但不明顯。(2)與8MN組相比，14MC組和16MC組血清MDA值顯著升高(P<0.01)；與14MC組相比，14MEA6組血清MDA值明顯下降(P<0.05)；與16MC組相比，16MEA6組、16MEA8組血清MDA含量有不同程度降低，但不明顯，見表1。

Current situation and suggestion for the product standard of the detergent for fabric 5 42

在傳統(tǒng)高中語文作文教學中，教師作為教學主體，學生只能被動接受。學生寫好作文后，由教師一一審閱，教師雖是教學的引導者，但是教師作為一個個體，思想也有局限性，因此站在教師的角度和立場去評判所有學生的作文，未免太過片面，而不同的學生有不同的思想，不同思想的碰撞，會發(fā)出耀眼的光芒，所以應(yīng)該開展學生之間的互相評審和自評，讓學生在自評和互評的過程中認識自己的不足。通過學生的探討，學習別人的長處，認識自己的短處，做到優(yōu)勢互補，共同進步。最后，教師和學生進行共同總結(jié)，為了以后更好地寫作。

由于油墨清洗廢水色度較高，色度由油墨等難生化降解物質(zhì)構(gòu)成，因此，必須對該廢水進行預(yù)處理，防止廢水難降解污染物含量過高影響生物反應(yīng)，因此，需采用混凝沉淀裝置進行脫色預(yù)處理。

衰老性的肌萎縮與肌衛(wèi)星細胞肌肉激活、增殖和分化能力逐漸降低有關(guān)。肌衛(wèi)星細胞是位于肌纖維肌膜和基底層的肌源性祖細胞〔9〕，肌源性祖細胞作為肌組織的干細胞，能轉(zhuǎn)化為成肌細胞，促進骨骼肌細胞的再生。大量研究表明，衛(wèi)星細胞的激活與MyoD和Pax7的上調(diào)往往是同步進行的，上調(diào)MyoD會使骨骼肌基因表達并啟動肌生成程序〔10〕，促進肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化。調(diào)控骨骼衛(wèi)星細胞分化的MRFs包括初級生肌因子和次級生肌因子〔11，12〕。初級因子中包含MyoD等，其中MyoD主要功能是促進成肌細胞轉(zhuǎn)化為成熟的肌纖維，被稱為骨骼肌形成的最早標志物，阻止肌萎縮的發(fā)生〔13〕，被認為是激活肌衛(wèi)星細胞的標記蛋白〔14〕。8月齡預(yù)防性電針6個月可激活生肌調(diào)節(jié)因子，加速MyoD的生成。次級生肌因子包括Myogenin和MRF4，Myogenin可作為細胞分化的標志。本實驗結(jié)果顯示，8月齡SD大鼠預(yù)防性電針干預(yù)8個月對生肌調(diào)節(jié)因子中次級因子有調(diào)節(jié)作用。IGF-1主要是通過誘導骨骼肌生長調(diào)節(jié)因子家族MRFs中的MyoD、MyoG基因表達來完成。此外，MRFs能夠調(diào)節(jié)肌生成過程中的肌肉特異性蛋白，如胚胎肌球蛋白重鏈(eMyHC)的轉(zhuǎn)錄〔15，16〕。本實驗結(jié)果顯示，8月齡SD大鼠預(yù)防性電針干預(yù)6個月和8個月有可能開啟 IGF-1/AKT通路，誘導生肌調(diào)節(jié)因子MyoD、Myogenin、eMyHC，完成衛(wèi)星細胞增殖和成熟肌纖維的形成。同時從另一方面也提示IGF-1/AKT通路誘導生肌調(diào)節(jié)因子MyoD、Myogenin、eMyHC的表達與預(yù)防性電針干預(yù)效果的正相關(guān)性。早期預(yù)防性電針干預(yù)后IGF-1/AKT通路誘導的生肌調(diào)節(jié)因子MyoD表達活躍，衛(wèi)星細胞增殖促進再生，8月齡起始預(yù)防性電針干預(yù)6個月同時還出現(xiàn)Myogenin、 eMyHC明顯升高，衛(wèi)星細胞增殖、分化和肌管融合各階段有完整表現(xiàn)。

綜上所述，預(yù)防性電針干預(yù)對自由基代謝及抗氧化酶均產(chǎn)生了不同程度的干預(yù)作用，其中14MEA6組顯著提高了機體的抗氧化能力，明顯減輕自由基損傷，改善骨骼肌細胞功能，延緩衰老進程。此外，對衰老大鼠的預(yù)防性干預(yù)作用與IGF-1/AKT信號相關(guān)的骨骼肌再生有關(guān)。

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〔2016-01-17修回〕

(編輯李相軍)

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81373755)；國家自然科學基金青年科學基金項目(81403470)

通訊作者：徐平(1952-)，女，教授，博士生導師，主要從事針灸與骨骼肌代謝性疾病、中醫(yī)教育研究。

〔中圖分類號〕R2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2571-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.002

1長春中醫(yī)藥大學2東營市勝利油田中心醫(yī)院

第一作者：馬長春(1973-)，男，副教授，博士，主要從事針灸與骨骼肌代謝性疾病研究。