張　濤　宋慶嬌　榮光影　柳朝陽　汪　悅

(佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江　佳木斯　154007)

川芎嗪對宮頸癌Hela細胞磷酸化Bad蛋白和Survivin蛋白表達的影響

張濤宋慶嬌榮光影1柳朝陽2汪悅3

(佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江佳木斯154007)

〔摘要〕目的研究川芎嗪(TMP)對Hela細胞磷酸化Bad(p-Bad)蛋白和Survivin蛋白表達的影響。方法四甲基偶氮唑藍比色(MTT)法檢測TMP對Hela細胞增殖的抑制作用；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率；Western印跡法檢測p-Bad和Survivin蛋白的表達。結(jié)果與對照組相比TMP可抑制Hela細胞的增殖(P<0.01)；增加Hela細胞的凋亡率(P<0.05，P<0.01)；降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表達(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論TMP可抑制Hela細胞增殖，誘導(dǎo)Hela細胞凋亡，降低p-Bad蛋白和Survivin蛋白的表達，這可能是TMP誘導(dǎo)Hela細胞凋亡的機制之一。

〔關(guān)鍵詞〕川芎嗪；宮頸癌；細胞凋亡；磷酸化Bad蛋白；Survivin蛋白

川芎嗪(TMP)是中藥川芎根莖中的生物堿單體，臨床上主要用于治療多種心血管疾病〔1，2〕。目前報道，TMP的抗腫瘤〔3～7〕作用主要見于對肺癌、白血病、黑色素細胞瘤和胃癌的抑制作用，TMP對宮頸癌的抑制及其作用機制國內(nèi)外暫無報道。本實驗旨在探討TMP誘導(dǎo)Hela細胞凋亡的作用機制。

1材料與方法

1.1材料細胞株：Hela細胞株購于中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所細胞庫。 藥物和試劑：TMP純品購于Sigma-Aldrich公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)購于北京拜爾迪生物技術(shù)公司。AV-FITC凋亡檢測試劑盒、兔抗人Survivin抗體和抗人β-actin抗體、Bad蛋白磷酸化(p-Bad)抗體購于艾美捷科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)Hela細胞復(fù)蘇后，RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5% CO2培養(yǎng)，選對數(shù)生長期時的細胞進行實驗。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖胰酶消化調(diào)整細胞濃度為1×104/ml，接種于96孔板，100 μl/孔，培養(yǎng)24 h，分別給予不同濃度的TMP(0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/ml)處理，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔。分別處理(24、48、72)后進行檢測，加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl培養(yǎng)4 h，每孔加入200 μl DMSO，于490 nm處檢測吸光度(OD)值。同時設(shè)空白對照組，有細胞，無藥物。細胞增殖抑制率(IR)=(1-實驗組OD均值/對照組OD均值)×100%。

1.2.3膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V FITC)染色流式細胞儀觀察Hela細胞凋亡Hela細胞接種于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，24 h后加入TMP(0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/ml)，培養(yǎng)24 h。根據(jù)試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測，利用FCSExpress 3.0軟件分析細胞凋亡。

1.2.4Western印跡法檢測Survivin及p-Bad蛋白表達收集對照組及TMP(1.0，1.5，2.0 mg/ml)處理的Hela細胞，提取總蛋白，用Bradford法測定各組蛋白質(zhì)含量。蛋白上樣后，進行凝膠電泳，移膜，4℃用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入兔抗人抗體(1∶100)，過夜，加二抗(1∶10 000)，雜交1 h。采用ECL法分析檢測結(jié)果，以β-actin為對照蛋白，各組蛋白條帶進行灰度分析，計算Survivin和p-Bad蛋白表達水平。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS11.3軟件進行單因素方差分析及LSD檢驗。

2結(jié)果

2.1TMP抑制Hela細胞增殖MTT法結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度的TMP作用于Hela細胞可明顯抑制細胞的增殖(P<0.01)；各時間點均以2.0 mg/ml濃度的抑制率最高，具有劑量依賴性和時間依賴性。見表1。

2.2TMP對Hela細胞凋亡率的影響不同濃度的TMP作用于Hela細胞24 h后，與對照組相比，隨著藥物濃度的增加，早期凋亡率、晚期凋亡率或壞死細胞逐漸上升(P<0.05，P<0.01)(0.25 mg/ml組除外)，具有濃度依賴性，見表2。

2.3TMP對Hela細胞p-Bad蛋白及Survivin蛋白表達的影響與對照組相比，不同濃度的TMP作用于Hela細胞48 h后，可見隨藥物濃度的增高，p-Bad蛋白及Survivin蛋白的表達逐漸降低，呈一定的濃度依賴性，見表3。

表1　不同濃度的TMP對Hela細胞增殖的影響

與對照組比較:1)P<0.01

表2　TMP對Hela細胞凋亡的影響

與對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

表3　TMP對Hela細胞磷酸化Bad蛋白和Survivin

與對照組比較:1)P<0.01；與TMP 0.25 mg/ml組比較:2)P<0.01；與TMP 1.0 mg/ml組比較:3)P<0.05

3討論

宮頸癌是嚴重威脅婦女生命健康的惡性腫瘤之一，死亡率占女性癌癥的第二位〔8〕。研究證明，500 mg/L TMP對人胃低分化腺癌有一定殺傷作用，抑制率約為24.4%～28.5%〔3〕；TMP能輕度抑制敏感性白血病K562細胞的DNA合成〔4〕；≥250 mg/L的TMP對體外培養(yǎng)的B16-FIO黑色素瘤細胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成具有抑制作用，并存在劑量依賴關(guān)系〔5〕；TMP對肺癌A549細胞有明顯的增殖抑制作用，機制可能是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來實現(xiàn)的〔6〕；TMP通過誘導(dǎo)Bel-7402肝癌細胞株分化抑制細胞增殖〔7〕。本實驗結(jié)果顯示，TMP能夠抑制Hela細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡。

Bad是 Bcl-2家族中的促凋亡基因。Bad在多種細胞中表達，研究表明Bad可通過與Caspase家族成員的相互作用和作用于細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細胞凋亡全過程。接受細胞凋亡信號刺激后，鈣調(diào)磷酸酶可誘導(dǎo) Bad去磷酸化，去磷酸化的游離 Bad 通過易位等細胞活動促進凋亡的發(fā)生〔9〕。

Bad蛋白對凋亡的調(diào)控與其磷酸化-去磷酸化修飾有關(guān)，生理狀態(tài)下，p-Bad一方面與 14-3-3 蛋白結(jié)合成復(fù)合物穩(wěn)定存在于胞質(zhì)中發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)；另一方面，p-Bad與bcl-2解聚，而游離的bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用〔10〕。

Survivin是抗凋亡蛋白家族(IAP)中最小的一個抗凋亡基因，在正常組織(子宮內(nèi)膜等少數(shù)組織除外)不表達，而在多種腫瘤組織中呈周期依賴性的表達〔11〕。

Survivin通過抑制細胞色素C從線粒體的釋放從而在上游就阻斷了凋亡信號的傳導(dǎo)；Survivin能夠阻止Caspase-9前體構(gòu)象的改變，進而阻止下游Caspases分子前體蛋白的分解，且Survivin可與Caspase-3和Caspase-7結(jié)合并抑制其活性，進而抑制細胞凋亡〔12〕。本研究結(jié)果提示TMP誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡、抑制其增殖，與其降低抗凋亡蛋白p-Bad和Survivin表達有關(guān)。

4參考文獻

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〔2015-10-25修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

基金項目：黑龍江省自然科學基金資助項目(H2015074)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目(2009-336)；黑龍江省普通高等學校青年學術(shù)骨干支持計劃項目(1252G059)；佳木斯大學科技重點項目(Sz2011-009)；佳木斯大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510222026)

通訊作者：柳朝陽(1971-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤干細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌免疫研究。

〔中圖分類號〕R285.5;R73-36

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2605-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.016

1佳木斯大學醫(yī)政管理處2佳木斯大學附屬第一醫(yī)院

3佳木斯大學2014級免疫學碩士

第一作者：張濤(1971-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中草藥抗腫瘤及腫瘤免疫機制方面的研究。