李　珊　胡　華　　周德生（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙40007；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙40007）

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活血榮絡(luò)片對(duì)AD模型小鼠AchE和ChAT表達(dá)的影響*

李珊1胡華2△周德生2
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

【摘要】目的觀察活血榮絡(luò)片對(duì)阿爾茨海默病（AD）小鼠腦組織乙酰膽堿酯酶（AchE）和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）表達(dá)的影響。方法將50只APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量活血榮絡(luò)片組、中劑量活血榮絡(luò)片組、高劑量活血榮絡(luò)片組、多奈哌齊組，每組10只。同期將同月齡的10只KM小鼠作為正常組。每天灌胃1次，連續(xù)治療2個(gè)月。治療結(jié)束后，取各組小鼠腦組織，采用Western Blot檢測(cè)AchE和ChAT蛋白含量。結(jié)果與正常組相比，AD模型組小鼠腦組織AchE蛋白表達(dá)提高、ChAT蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組相比，低中高劑量活血榮絡(luò)片組、多奈哌齊組腦組織AchE蛋白表達(dá)降低、ChAT蛋白表達(dá)增高（P＜0.01）；與多奈哌齊組比較，中、高劑量活血榮絡(luò)片組降低AchE蛋白表達(dá)的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而高劑量活血榮絡(luò)片組提高ChAT蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論活血榮絡(luò)片可一定程度上抑制AD模型小鼠腦組織AchE蛋白的表達(dá)并促進(jìn)ChAT蛋白的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】活血榮絡(luò)片阿爾茨海默病乙酰膽堿酯酶乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶

阿爾茨海默?。ˋD）極大地影響著人群的健康。近年來，隨著急性腦卒中發(fā)病率的增加，也增加了AD的發(fā)病率，加快了疾病的進(jìn)展，使AD成為腦血管意外后的主要后遺癥之一［1］。目前AD確切病機(jī)尚不明確，暫無特效治療方法，乙酰膽堿的缺失被認(rèn)為是重要的病因。研究表明［2］AD患者腦內(nèi)乙酰膽堿（Ach）水平下降迅速，乙酰膽堿的缺乏與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。本課題組前期研究顯示，活血榮絡(luò)片可一定程度上改善患者學(xué)習(xí)及記憶能力，并抑制AD小鼠腦組織β淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，從乙酰能代謝角度探討活血榮絡(luò)片對(duì)AD模型小鼠腦組織乙酰膽堿酯酶（AchE）和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物KM小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，SPF級(jí)，鼠齡5月，雌雄各半，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，SPF級(jí)，鼠齡5個(gè)月，雌雄各半，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK（京）2008-0025。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠隨年齡的增加會(huì)出現(xiàn)類似AD的病理改變，是公認(rèn)的研究AD防治的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型［3］。小鼠均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫24～26℃，濕度55%～60%，光照時(shí)間8∶00～20∶00。自由飲水進(jìn)食，定期更換墊料，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑與儀器主要試劑包括鼠抗AchE單克隆抗體，鼠抗ChAT單克隆抗體，羊抗鼠二抗，RIPA蛋白裂解液（圣克魯斯生物技術(shù)有限公司）；彩色預(yù)染蛋白marker，超敏化學(xué)放光顯色試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司）；羊抗鼠二抗（美國vazyme公司）。主要儀器包括手術(shù)器械；-80℃冰箱；灌胃針、燒杯、量筒等；AE-240精密分析天平（瑞士Mettler公司）；MIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)（北航公司）；LEICADMLBZ型雙目顯微鏡（德國LEICA公司）；DYY-6C電泳儀、DYCZ-24D垂直板電泳槽、DYCP-40C水平電轉(zhuǎn)槽、WD-9405B水平搖床均購自于北京六一儀器廠；THZ-82A恒溫?fù)u床（金壇公司）；SP-752紫外可見分光光度計(jì)（上海spectrum公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物活血榮絡(luò)片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科提供，湘藥制字Z20080472，規(guī)格：0.35 g/片，100片/瓶，每片含生藥量0.14 g。將藥片放入蒸餾水中溶解，低、中、高劑量組分別配成0.275 g/kg（相當(dāng)于生藥量0.11 mg/kg）、0.55 g/kg（相當(dāng)于生藥量0.22mg/kg）、1.10g/kg（相當(dāng)于生藥量0.44 mg/kg）的藥液。多奈呢齊片：陜西方舟制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字號(hào)H20030583，生產(chǎn)批號(hào)：130901，規(guī)格：5 mg/片，7片/盒。將藥片放入蒸餾水中溶解，配成0.65 mg/kg的藥液。以上藥液放入冰箱中保存，給藥前在室溫下放置30min，搖勻后灌胃。

1.4分組與給藥50只APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠，隨機(jī)分為模型組、低劑量活血榮絡(luò)片組、中劑量活血榮絡(luò)片組、高劑量活血榮絡(luò)片組、多奈哌齊組，每組10只。同期將同月齡的10只KM小鼠作正常組。正常組、模型組予蒸餾水灌胃，低、中、高劑量活血榮絡(luò)片組予相應(yīng)劑量活血榮絡(luò)片藥液灌胃。多奈哌齊組予多奈哌齊藥液灌胃。灌胃量按0.1 mL/10g給予，每天灌胃1次，下午4～5時(shí)執(zhí)行，連續(xù)處理2個(gè)月（相當(dāng)于AD早中期）。

1.5標(biāo)本采集與檢測(cè)治療結(jié)束后取材，各組小鼠腦組織用液氮冰凍保存。組織勻漿后，BCA法測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，配制12%分離膠，3%的濃縮膠，80V恒壓電泳30min后，電壓增加至120V恒壓電泳60min；電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，條件電壓80V轉(zhuǎn)膜2.5 h；5%脫脂奶粉封閉1 h；一抗4℃孵育過夜；二抗室溫下孵育1～2h；洗膜4次，每次10min；向膜上均勻滴加ECL液，平穩(wěn)地將顯色板放入Image Quant 350化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，曝光顯色；Image J軟件分析灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示。所有資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布者，多組比較采用單因素方差分析。不符合正態(tài)分布者，采用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組小鼠腦組織中AchE的含量比較見表1，圖1。與正常組比較，模型組小鼠腦組織AchE/β-actin相對(duì)灰度值明顯增高（P＜0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量活血榮絡(luò)片組和多奈哌齊組小鼠腦組織AchE/β-actin相對(duì)灰度值降低（P＜0.01）；與多奈哌齊組比較，低劑量活血榮絡(luò)片組小鼠腦組織AchE/βactin相對(duì)灰度值增加（P＜0.05），而中、高劑量活血榮絡(luò)片組AchE/β-actin相對(duì)灰度值變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　各組小鼠腦組織AchE/β-actin相對(duì)灰度值的比較（±s）

表1　各組小鼠腦組織AchE/β-actin相對(duì)灰度值的比較（±s）

與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與多奈哌齊組比較，#P＜0.05。下同。

組別　n正常組　10模型組　10低劑量活血榮絡(luò)片組　10AchE/β-actin相對(duì)灰度值0.122±0.1031.520±0.132**1.186±0.217**△△#中劑量活血榮絡(luò)片組　10　0.416±0.161**△△高劑量活血榮絡(luò)片組　10　0.332±0.121**△△多奈哌齊組　10　0.460±0.263**△△

圖1　小鼠腦組織AchE蛋白表達(dá)情況

2.2各組小鼠腦組織中ChAT的含量比較見表2，圖2。與正常組比較，模型組小鼠腦組織ChAT/β-actin相對(duì)灰度值明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量活血榮絡(luò)片組和多奈哌齊組小鼠腦組織ChAT/β-actin相對(duì)灰度值增高（P＜0.01）；與多奈哌齊組比較，高劑量活血榮絡(luò)片組小鼠腦組織ChAT/βactin相對(duì)灰度值增加（P＜0.05），而低、中劑量活血榮絡(luò)片組ChAT/β-actin相對(duì)灰度值變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2　各組小鼠腦組織ChAT/β-actin相對(duì)灰度值的比較（±s）

表2　各組小鼠腦組織ChAT/β-actin相對(duì)灰度值的比較（±s）

組別　n正常組　10模型組　10低劑量活血榮絡(luò)片組　10ChAT/β-actin相對(duì)灰度值1.224±0.414 0.453±0.162**0.755±0.208**△△中劑量活血榮絡(luò)片組　10　0.865±0.225**△△高劑量活血榮絡(luò)片組　10　0.943±0.280**△△#多奈哌齊組　10　0.865±0.167**△△

圖2　小鼠腦組織ChAT蛋白表達(dá)情況

3　討　論

阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因尚不明確，但目前大多學(xué)者支持膽堿能假說，認(rèn)為Ach的缺失是致病的關(guān)鍵原因［4］。研究顯示［5］腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元退變是造成AD最重要的病理因素之一，膽堿能系統(tǒng)與記憶的形成、存儲(chǔ)有關(guān)，與學(xué)習(xí)記憶能力亦密切相關(guān)，膽堿能系統(tǒng)的損傷能引起學(xué)習(xí)、記憶的減退。Ach作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，與AD患者的癡呆嚴(yán)重程度緊密相關(guān)。大多數(shù)學(xué)者的研究表明［6］Ach活性在AD患者的大腦中明顯降低，同時(shí)在AD早期也發(fā)現(xiàn)了膽堿能缺少的臨床表現(xiàn)，并且增加腦內(nèi)Ach水平能夠有效改善記憶功能。

研究顯示［7］，機(jī)體通過多方面的調(diào)節(jié)方式對(duì)學(xué)習(xí)、記憶進(jìn)行調(diào)控，中樞膽堿能系統(tǒng)作為重要的通路發(fā)揮重要作用，與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)，該通路的核心便是Ach這一重要的神經(jīng)遞質(zhì)。Ache對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是雙向的，既有興奮作用也有抑制作用，但以興奮作用為主，參與皮層喚醒、情緒和運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)等生理過程，特別是學(xué)習(xí)記憶方面被認(rèn)為是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Ach在腦內(nèi)分布廣泛，其合成與代謝分解與ChAT和AchE密切相關(guān)，兩者共同作用維持Ach含量的動(dòng)態(tài)平衡，同時(shí)兩者的活性也反映了Ach的合成和代謝速率。患者腦內(nèi)AchE和ChAT活性變化被認(rèn)為是AD的重要生化特征。多項(xiàng)研究表明［8-9］，Ach分解加速，嚴(yán)重影響學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力；同時(shí)發(fā)現(xiàn)老年性癡呆患者Ach合成明顯減少，ChAT的活性下降，與癡呆的嚴(yán)重程度相關(guān)。所以選取AchE和ChAT作為研究對(duì)象，間接評(píng)價(jià)Ach含量變化。

活血榮絡(luò)片為周德生教授經(jīng)驗(yàn)方。癡呆病位在腦絡(luò)，發(fā)病與腎虛、氣虛、氣滯、肝郁、痰濁相關(guān)，但不論那種皆可“致瘀”，故“祛瘀通絡(luò)”是治療關(guān)鍵?；钛獦s絡(luò)片含石菖蒲、雞血藤、玄參、黃精、生地黃、乳香、川芎、沒藥等，重在祛瘀通絡(luò)。方中川芎、雞血藤、乳香、沒藥、石菖蒲活血行氣，化痰解毒，使腦髓純凈，腦絡(luò)通暢；輔以黃精、玄參、生地黃健脾益腎，滋養(yǎng)陰氣，化生腦髓，腦絡(luò)得養(yǎng)。現(xiàn)代藥理已證明上述藥物多具有改善循環(huán)、促智的作用［10］。同時(shí)，相關(guān)研究還顯示［11-12］活血類方劑能明顯增高AD大鼠的AchE的含量，提高ChAT活性，降低腦內(nèi)AchE活性，從而增加Ach含量，保護(hù)大腦學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)中樞膽堿能損害有一定的修復(fù)作用，從而達(dá)到改善學(xué)習(xí)記憶的目的。

本研究中，模型組大幅度提高小鼠腦組織AchE的表達(dá)量，降低了ChAT的表達(dá)。低、中、高劑量活血榮絡(luò)片組、多奈哌齊組均能不同程度的降低腦組織中AchE的含量并提高ChAT的含量，從而一定程度上促進(jìn)Ach蓄積，進(jìn)而具有延緩癡呆病程的可能，且中、高劑量活血榮絡(luò)片組降低AchE表達(dá)量的效果與多奈哌齊組相當(dāng)，高劑量活血榮絡(luò)片組提高ChAT的含量優(yōu)于多奈哌齊組。近年來，多項(xiàng)研究亦顯示［13-15］，通過一定的干預(yù)手段對(duì)AD模型動(dòng)物膽堿能系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)，即提高腦組織中ChAT活性，抑制AchE活性，增加Ach的含量，可減輕大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，改善癡呆癥狀，進(jìn)而減輕對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用。本次實(shí)驗(yàn)中，通過不同劑量活血榮絡(luò)片灌胃處理，影響了AD模型小鼠體內(nèi)AchE和ChAT蛋白的表達(dá)，進(jìn)而起到提高Ach含量的作用，可能與活血榮絡(luò)片影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化有關(guān)。由于本研究僅從膽堿能遞質(zhì)途徑的表達(dá)入手，為活血榮絡(luò)片的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，仍需進(jìn)一步研究。

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中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）03-0393-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.006

*基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金（14JJ6038）；湖南省科技廳課題（2014sk3037）

通信作者△（電子郵箱：hh201201201＠163.com）

收稿日期（2015-11-28）

Effect of Huoxue Rongluo Tablets on the Expression of ChAT and AchE in AD Model Mice

LI Shan，HU Hua，ZHOU Desheng.
Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

【Abstract】Objective：To investigate the effect of Huoxue Rongluo Tablets on the expression of acetylcholinesterase（AchE）and acetylcholine transferase（ChAT）in brain tissue of mice with Alzheimer′s disease （AD）.Methods：50APP/PS1 transgenic AD model mice were randomly divided into five groups，with10rats in each.10KM mice with the same age were chosen as the normal group.The stomach was filled once a day，and continuous treatment lasted for 2months.After treatment，the brain tissues of mice were taken to detect the content of AchE and ChAT with Blot Western.Results：Compared with the normal group，the expression of AchE protein in brain tissue of mice in AD model group increased，and the expression of ChAT protein decreased（P＜0.01）.Compared with the model group，AchE protein expression in brain tissue of low，middle and high dose of Huoxue Rongluo Tablets group and donepezil group decreased and the expression of choline acetyltransferase protein increased（P＜0.01）.Compared with Donepezil group，the reduce of AchE protein expression in middle and high dose of Huoxue Rong luo decoction group had no statistical significance（P＞0.05），and high dose of Huoxue Rongluo Tablets group improved ChAT protein expression（P＜0.05）.Conclusion：The expression of AchE protein in brain tissue of AD model mice can be inhibited to a certain extent and ChAT protein can be promoted with Huoxue Rongluo Tablets.

【Key words】Huoxue Rongluo Tablets；Alzheimer disease；Acetylcholinesterase；Acetylcholine transferase