湯小康　李　敏　應(yīng)　航　盧　敏（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙40007；.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州30053）

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兩種軟骨終板細(xì)胞體外培養(yǎng)方法效果的比較研究*

湯小康1△李敏2應(yīng)航2盧敏1
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州310053）

【摘要】目的比較原代椎間盤軟骨終板細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中Ⅰ型與Ⅱ型膠原酶消化效率的差異。方法提取新西蘭大白兔椎間盤軟骨終板組織，將其剪碎并隨機(jī)分成2等份，標(biāo)記為Ⅰ型膠原組和Ⅱ膠原型組；用0.25%的胰蛋白酶預(yù)消化后，分別用0.02%Ⅰ型膠原酶和0.02%Ⅱ型膠原酶在37℃消化3次，每次1 h；將3次消化所得的細(xì)胞懸液混勻后離心，獲取細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)與傳代；對(duì)兩組軟骨終板細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞增殖情況檢測(cè)等處理，比較兩組軟骨終板細(xì)胞數(shù)目、形態(tài)及增殖情況的差異。結(jié)果1）細(xì)胞計(jì)數(shù)：Ⅰ型膠原組細(xì)胞3次細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分別為5.75×104個(gè)/mL、5.50×104個(gè)/mL、6.25×104個(gè)/mL，獲得軟骨終板數(shù)目（5.83±0.31）×104個(gè)/mL；Ⅱ膠原型組細(xì)胞3次細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分別為8.75×104個(gè)/mL、9.50×104個(gè)/mL、8.25×104個(gè)/mL，獲得軟骨終板數(shù)目（8.83±0.51）×104個(gè)/mL，Ⅰ型膠原組細(xì)胞總量明顯少于Ⅱ膠原型組；2）細(xì)胞形態(tài)：兩組軟骨終板細(xì)胞多呈多角形，胞核大而圓，形態(tài)無(wú)明顯差異。3）細(xì)胞增殖：Ⅰ型膠原組細(xì)胞MTT讀數(shù)OD值為（0.561±0.003），Ⅱ膠原型組細(xì)胞MTT讀數(shù)OD值為（0.562±0.002），組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論Ⅱ型膠原酶較Ⅰ型膠原酶更適用于原代椎間盤軟骨終板細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

【關(guān)鍵詞】軟骨終板細(xì)胞Ⅰ型膠原酶Ⅱ型膠原酶細(xì)胞培養(yǎng)

椎間盤源性腰痛臨床患病率較高，病情典型者嚴(yán)重影響患者日常生活，其屬于中醫(yī)學(xué)“腰痛”范疇，益氣補(bǔ)腎是中醫(yī)治療腰痛的基本方略之一［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，椎間盤的退變與頸、腰椎疾病的發(fā)生密切相關(guān)［2］，軟骨終板退變是導(dǎo)致椎間盤退變的始動(dòng)因素［3］。隨著對(duì)脊柱退行性疾病研究的深入，針對(duì)軟骨終板細(xì)胞的研究也日益豐富。如何在實(shí)驗(yàn)室高效獲得椎間盤軟骨終板細(xì)胞，對(duì)研究中藥干預(yù)“腰痛”的具體機(jī)制有著極為重要的意義。有研究指出Ⅱ型膠原是椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的特征性產(chǎn)物［4］，因此有理由相信Ⅱ型膠原酶在原代椎間盤軟骨終板細(xì)胞分離培養(yǎng)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。為驗(yàn)證Ⅱ型膠原酶在軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)中的效率優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)選取了實(shí)驗(yàn)室常用于細(xì)胞消化分離培養(yǎng)的Ⅰ型膠原酶作為參照，進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡新西蘭大白兔4只，雌雄各2只，體質(zhì)量0.5～0.75 kg，清潔級(jí)，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：XL202081、室溫飼養(yǎng)。

1.2主要試劑、儀器和材料胰蛋白酶（Gbico）、Ⅰ型膠原酶（Sigma）、Ⅱ型膠原酶（Sigma）、PBS緩釋液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）、DMEM培養(yǎng)液（吉諾）、胎牛血清（四季青）、潔凈工作臺(tái)（Airtech）、普通手術(shù)器械、眼科手術(shù)器械、電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、天枰、計(jì)數(shù)板及計(jì)數(shù)器、6孔培養(yǎng)板（NEST）、96孔培養(yǎng)板（NEST）、培養(yǎng)箱（Thermo）、倒置相差顯微鏡（Olympus）、BioTek 800酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）等。

1.3椎間盤軟骨終板細(xì)胞體外的分離與培養(yǎng)

1.3.1椎間盤軟骨終板的取材及預(yù)消化兔耳緣靜脈水合氯醛過(guò)量給藥處死新西蘭大白兔，背部備皮，75%酒精消毒后鋪巾，沿后正中線切開(kāi)皮膚，分離椎旁肌肉，取下頸胸腰段脊柱；在超凈臺(tái)中剔除脊柱周圍肌肉組織及筋膜，用0.01 mol/L PBS沖洗至無(wú)明顯血跡，分離椎間盤軟骨終板組織，置于PBS溶液中，待所有軟骨終板取好后用培養(yǎng)液洗兩遍，分別用眼科剪剪成1 mm×1 mm的小塊，用天枰將其分為兩等份，并分別轉(zhuǎn)移入50mL無(wú)菌離心管中，加入15 mL 0.25%胰蛋白酶進(jìn)行預(yù)消化，37℃水浴中放置30min，1000r/min離心5 min，保留組織塊及沉淀，去上清液。

1.3.2Ⅰ型膠原酶與Ⅱ型膠原酶的干預(yù)將兩組椎間盤軟骨終板組織隨機(jī)標(biāo)記為Ⅰ型膠原組與Ⅱ膠原型組，分別以5 mL 0.02%Ⅰ型膠原酶和0.02%Ⅱ型膠原酶37℃水浴中消化1 h，將含細(xì)胞的消化液以1000r/min離心8 min，棄上清液，沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊用DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）吹打混勻。剩余骨片再加入5 mL新的同類膠原酶繼續(xù)消化1 h，重復(fù)以上步驟3次。

1.4細(xì)胞接種與傳代將3次消化所得的兩組軟骨終板細(xì)胞各自充分混勻并進(jìn)行3次計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)束后將其接種于2塊6孔培養(yǎng)板中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并換液1次，此后每隔36h換液1次。顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)至皿底的60%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)后將兩組軟骨終板細(xì)胞稀釋至5.0×105個(gè)/mL，均勻接種于6孔和96孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)。

1.5指標(biāo)觀察1）細(xì)胞計(jì)數(shù)：原代軟骨終板細(xì)胞混懸液接種前，分別從兩組充分混勻的細(xì)胞混懸液中吸取適量細(xì)胞懸液，置于清潔計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)3次。細(xì)胞數(shù)（個(gè)/mL）=4個(gè)大格細(xì)胞數(shù)/4×10000。2）細(xì)胞形態(tài)：原代軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，將兩組盛有軟骨終板細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板置于倒置相差顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照。第2代軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，將兩組盛有軟骨終板細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板置于倒置相差顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察并拍照。3）細(xì)胞增殖：第2代軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，從盛有兩組盛有軟骨終板細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中各選6個(gè)培養(yǎng)孔，分別加入10mL MTT溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h后吸棄培養(yǎng)液，再加入100μL MTT溶解劑，于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定兩組軟骨終板細(xì)胞的光密度（OD）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。兩組軟骨終板細(xì)胞OD值組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1兩組軟骨終板細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果比較見(jiàn)表1。3次細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，Ⅱ型膠原組軟骨終板細(xì)胞數(shù)明顯多于Ⅰ型膠原組。

表1　兩組軟骨終板細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果比較（個(gè)/mL）

2.2兩組細(xì)胞形態(tài)比較見(jiàn)圖1。圖A中Ⅰ型膠原組原代軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)48 h可見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，大部分細(xì)胞懸浮，貼壁細(xì)胞為多角形，胞核大而圓，有2～3個(gè)核仁（400倍）；圖B中Ⅱ型膠原組原代軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)48 h部分細(xì)胞貼壁，可見(jiàn)懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)多角形，胞核大而圓，有2～3個(gè)核仁（400倍）。圖C中Ⅰ型膠原組第2代軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)48 h大部分細(xì)胞貼壁，少許細(xì)胞懸浮，貼壁細(xì)胞為多角形（200倍）；圖D中Ⅱ型膠原組第2代軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)48 h大部分細(xì)胞貼壁，少許細(xì)胞懸浮，貼壁細(xì)胞呈多角形（200倍）。兩組原代軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，外觀呈多角形，胞核大而圓，有2～3個(gè)核仁，胞漿豐富，含少許分泌顆粒，兩組軟骨終板細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異；兩組第2代軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察見(jiàn)大部分細(xì)胞貼壁，外觀呈多角形，胞核大而圓，有2～3個(gè)核仁，胞漿豐富，含分泌顆粒，兩組軟骨終板細(xì)胞形態(tài)亦無(wú)明顯差異。

2.3細(xì)胞增殖Ⅰ型膠原組第2代軟骨終板細(xì)胞MTT讀數(shù)OD值為（0.561±0.003）與Ⅱ型膠原組第2代軟骨終板細(xì)胞OD值（0.562±0.002）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖1　兩組原代、第2代軟骨終板細(xì)胞比較

3　討　論

椎間盤源性腰痛多為椎間盤退行性改變，進(jìn)而刺激椎間盤軟骨終板、髓核及纖維環(huán)等組織，引起椎間盤內(nèi)痛覺(jué)感受器變化進(jìn)而產(chǎn)生，用藥宜從氣血入手，兼之補(bǔ)腎，以此治療各種椎間盤源性腰痛［5］。椎間盤可分為髓核、纖維環(huán)和軟骨終板，每種組織均含有豐富的細(xì)胞外基質(zhì)和不同形態(tài)的細(xì)胞，其自身無(wú)血管分布，營(yíng)養(yǎng)主要通過(guò)滲透作用送達(dá)［6-7］。軟骨終板是椎間盤主要的營(yíng)養(yǎng)滲透介質(zhì)，同時(shí)也是維持脊柱生物力學(xué)的重要組成部分，因此椎間盤的病變過(guò)程往往伴有軟骨終板的異常變化。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究生長(zhǎng)因子注射、轉(zhuǎn)基因干預(yù)、細(xì)胞移植等方法促進(jìn)基質(zhì)再生從而修復(fù)受損的椎間盤已成為脊柱基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［8］，針對(duì)中藥及相關(guān)成分干預(yù)軟骨終板進(jìn)而治療椎間盤源性腰痛的研究也日益增多［9-10］。軟骨終板作為椎間盤組織中的重要組成部分，建立穩(wěn)定的軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)體系，有助于系統(tǒng)的研究各種手段干預(yù)脊柱疾病的機(jī)理。本研究在實(shí)驗(yàn)中成功的應(yīng)用胰蛋白酶與Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化分離培養(yǎng)軟骨終板細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)原代軟骨終板細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后仍未完全貼壁，因此軟骨終板細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，其貼壁的時(shí)間較其他種類細(xì)胞時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡量避免早期的移動(dòng)培養(yǎng)容器，防止細(xì)胞不貼壁，這將為今后同類的研究工作提供借鑒。

軟骨終板的生物化學(xué)成分主要包括蛋白多糖、膠原和水。蛋白多糖是維持椎間盤正常結(jié)構(gòu)、代謝和生物力學(xué)性能的生化基礎(chǔ)；膠原纖維平行于椎體的上下面排列，纖維上附著蛋白多糖分子，纖維相互間的交叉構(gòu)成有通透性的彈力網(wǎng)；水分是軟骨終板的重要組成成分，其含量的變化與蛋白多糖的含量密切相關(guān)［11］。蛋白聚糖和Ⅱ型膠原同為椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的特征性產(chǎn)物，目前認(rèn)為上調(diào)蛋白聚糖、Ⅱ型膠原基因表達(dá)能有效減少軟骨終板細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到減輕椎間盤損傷的病理發(fā)展的目的［12］。在同一組織中，常同時(shí)存在幾種類型的膠原，但常有一種類型占優(yōu)勢(shì)，而軟骨周圍基質(zhì)中則主要為Ⅱ型膠原。膠原酶有多種同工酶，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型及肝細(xì)胞專用酶，Ⅰ、Ⅱ型膠原酶屬同工酶，均可消化各型膠原，但軟骨終板周圍基質(zhì)中主要為Ⅱ型膠原，因此Ⅱ型膠原酶在軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)中具有潛在優(yōu)勢(shì)。本研究通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞增殖測(cè)定等實(shí)驗(yàn)方法，研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原酶在相同條件下較Ⅰ型膠原酶能獲得更多的軟骨終板細(xì)胞，但兩者在酶消化獲得細(xì)胞的增殖活性上不存在顯著差異，以此供研究者合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案提供參考。

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中圖分類號(hào)：R274

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）03-0397-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.007

*基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2110928）

通信作者△（電子郵箱：tangxk＠yeah.net）

收稿日期（2015-11-13）

Comparison Study of Two Different Type of Collagenases′Digestion Efficiency on Cartilage Endplates Culture

TANG Xiaokang，LI Min，YING Hang，et al.
The First Affiliated Hospital of Hunan Chinese Medicine University，Hunan，changsha 410007，China.

【Abstract】Objective：To evaluate the different efficiency of cartilage endplates obtained by Type-Ⅰcollagenase digestion and Type-Ⅱcollagenase digestion.Methods：The New Zealand White Rabbits were used for cartilage endplates tissue obtained.The tissue fragments were equally divided into 2parts，and marked as group of Type-Ⅰcollagenase and group of Type-Ⅱcollagenase.Both of them were digested by trypsin for15 minutes.Then they were digested by typeⅠcollagenase and typeⅡcollagenase separately for three times，each time lasting about1hours.The cells suspension got from the three-time digestions mixed the cells were cultured.The cells in 2groups were respectively counted.Their shapes were observed and their proliferation were assayed.The differences between the two groups of cell counted，shapes and proliferation were compared.Results：The results of cell counting showed that the cell number of Type-Ⅰcollagenase group was smaller than Type-Ⅱcollagenase.Both of cells had polygon shapes.Type-Ⅰcollagenase group′s OD was（0.561±0.003），and Type-Ⅱcollagenase group′s OD was（0.562±0.002）.There was no statistical difference in optical density between them（P > 0.05）.Conclusion：The efficiency of cartilage endplates obtained in typeⅡgroup is higher Type-Ⅰcollagenase.

【Key words】Cartilage endplates；TypeⅠcollagenase；TypeⅡcollagenase；Cell culture