武　婷，張　洪，趙小珍（山西省分析科學研究院，山西太原　030006）

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超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定果蔬中三唑酮的方法研究

武婷，張洪，趙小珍
（山西省分析科學研究院，山西太原030006）

摘要：建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC- MS/MS）測定果蔬中三唑酮的方法。樣品以乙腈勻漿提取，并采用氨基固相萃取柱（Sep- Pak Vac）進行樣品的凈化，采用超高效液相色譜柱WATERS ACQUITY C18（50×2.1 mm，1.7 μm）型分離，乙腈和0.1%甲酸水溶液進行梯度洗脫。三唑酮在1.0～100.0 ng/mL范圍內(nèi)，線性關系良好，回歸系數(shù)R2為0.999 8，回收率達到84.9%～89.3%，精密度達到2.96%～3.53%。該方法操作快捷、提取效率高、重現(xiàn)性好、實用價值較高。

關鍵詞：超高效液相色譜-質(zhì)譜法；果蔬；三唑酮

0　引言

三唑酮（Triadimefon），商品名百菌酮、粉銹寧，是一種高效、低毒、持效期長、內(nèi)吸性強的三唑類殺菌劑。噴施三唑酮后，它由莖葉吸收后可分布到全植株，一般認為其代謝產(chǎn)物三唑醇起主要的滅菌作用［1］。伴隨著農(nóng)藥產(chǎn)品的增多和農(nóng)藥產(chǎn)品的濫用，農(nóng)藥對環(huán)境造成的危害日趨嚴重。國內(nèi)外對三唑酮殘留限量有較嚴格的規(guī)定，如在《歐洲藥典》中規(guī)定植物藥中最大允許殘留限量（MRL）為0.1 mg/kg［1］。我國對三唑酮的控制也日益引起有關部門的重視，在2012年發(fā)布的中華人民共和國國家標準GB 2763—2012中就對三唑酮MRL做了相應的規(guī)定，三唑酮在稻谷、玉米中MRL為0.5 mg/kg，在小麥、油菜籽中的MRL為0.2 mg/kg，在棉籽、結球甘藍、豌豆、梨、荔枝、香蕉中的MRL為0.05 mg/kg，在黃瓜、甜菜中的MRL為0.1 mg/kg，在蘋果、柑橘中MRL 為1.0 mg/kg。

關于三唑酮的分析方法有多種報道，文獻中對三唑酮的檢測主要采用氣相色譜法（GC）［1-2］、液相色譜法（HPLC）［2-3］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）［4-10］和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC- MS/MS）［11］。本方法建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLCMS/MS）檢測果蔬中三唑酮的方法，分離時間大大縮短，溶劑消耗量也減小到最低用量，具有更高的靈敏度和分離度，節(jié)約了試驗成本，并做到了真正意義上的環(huán)境友好型方法，為果蔬中三唑酮的檢測提供了有力的技術支持。

1　試驗部分

1.1儀器與試劑

ACQUITY UPLC XEVO TQ型超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國WATERS公司產(chǎn)品；Pipet- Lite XLS型移液器，美國Rainin Instrument公司產(chǎn)品；Retsch GM200型組織搗碎機，Germany公司產(chǎn)品；TGL-16M型高速離心機，湘智離心機公司產(chǎn)品產(chǎn)品；N- EVAP型氮吹儀，USA公司產(chǎn)品；Sep- Pak Vac型氨基固相萃取柱，SUPELCO，USA公司產(chǎn)品；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

三唑酮（Triadimefon）對照品，購自國家標準物質(zhì)中心；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，甲苯為優(yōu)級純，實驗室用水為超純水；氯化鈉為優(yōu)級純，無水硫酸鈉為分析純，用前在650℃下灼燒4 h，貯于干燥器中，冷卻后備用。

三唑酮標準溶液：精密稱取三唑酮標準品0.1 000 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，此溶液1 mL相當于1.00 mg三唑酮。臨用時，用乙腈稀釋至所需的質(zhì)量濃度。

1.2色譜條件

不同流動相色譜條件見表1。

表1　不同流動相色譜條件

色譜柱：WATERS ACQUITY C18（50×2.1 mm，1.7 μm）型；進樣量：10 μL；柱溫：40℃。

1.3質(zhì)譜條件

電離模式：ESI+；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：450℃；錐孔流速：50 L/Hr；脫溶劑氣流速：900 L/Hr；碰撞氣流速：0.17 mL/min；母離子：294.2；子離子：197.1（定量離子），225.2；錐孔電壓：25 V；碰撞能量：15，13 eV。

1.4樣品預處理

1.4.1 提取

取20 g樣品（精確至0.01 g）于80 mL聚丙烯離心管中，加入40 mL乙腈，用高速組織搗碎機在轉(zhuǎn)速15 000 r/min下勻漿提取1 min，加入5 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，以轉(zhuǎn)速3 800 r/min下離心5 min，取上清液20 mL（相當于10 g試樣量），在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至1 mL，待凈化。

1.4.2 凈化

在Sep- Pak Vac型柱中加入約2 cm高無水硫酸鈉，并放入下接雞心瓶的固定架上。加樣前先用4 mL乙腈+甲苯（3+1）預洗柱，當液面到達硫酸鈉的頂部時，迅速將樣品濃縮液轉(zhuǎn)移至凈化柱上，并更換新雞心瓶接收。再每次用2 mL乙腈+甲苯（3+1）洗滌樣液瓶3次，并將洗滌液移入柱中。在柱上加上50 mL貯液器，用25 mL乙腈+甲苯（3+1）洗脫農(nóng)藥及相關化學品合并于雞心瓶中，并在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至凈干。將濃縮液置于氮氣吹干儀上吹干，迅速加入1 mL的乙腈+水（3+2）混勻，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，供UPLC- MS/MS分析。

1.5方法學試驗

1.5.1線性關系

選擇不含有三唑酮的西紅柿為果蔬樣品代表。準確稱取20 g（精確至0.01 g）未添加三唑酮的西紅柿勻漿液，準確加入三唑酮的對照品溶液，使樣品中三唑酮的質(zhì)量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 ng/mL，分別對這些溶液進行UPLCMS/MS分析，記錄MRM圖，得峰面積，并對各溶液的峰面積和質(zhì)量濃度進行線性回歸分析，得到線性回歸方程和相關系數(shù)。

1.5.2檢出限與定量限

檢出限與定量限是衡量方法靈敏度的指標之一。將對照品溶液逐級稀釋，分別對這些溶液進行UPLC- MS/MS分析，記錄MRM圖中定量離子的信噪比，以3倍信噪比計算得出檢出限，10倍信噪比計算得出定量限。

1.5.3回收率和精密度測定

選擇不含有三唑酮的西紅柿為果蔬樣品代表。按照加樣回收法低、中、高3個水平對空白樣品進行加標，每個質(zhì)量濃度平行6份，使西紅柿樣品中三唑酮的添加量為0.125，0.250，0.500 μg/kg，按照1.4方法進行樣品處理。按照色譜-質(zhì)譜方法進樣，計算每個質(zhì)量濃度下的回收率，同時計算相對標準偏差。

2　結果與分析

2.1線性關系

選用三唑酮的溶液質(zhì)量濃度為1.0～100.0 ng/mL的樣品溶液進樣分析，以峰面積為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線。得到標準曲線為Y=2 091.3X- 778.58，R2=0.999 8。線性關系良好，完全符合方法學要求。

三唑酮的標準工作曲線見圖1，三唑酮標準溶液的MRM見圖2。

2.2檢出限與定量限

對逐級稀釋溶液中三唑酮的質(zhì)量濃度進行分析，將所得MRM圖中的色譜峰進行信噪比計算。質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL時，信噪比大于3倍空白信噪比，得出檢出限為0.5 ng/mL。質(zhì)量濃度為1.0 ng/mL時，信噪比大于10倍空白信噪比，得出定量限為1.0 ng/mL。

圖1　三唑酮的標準工作曲線

圖2　三唑酮標準溶液的MRM

2.3回收率與精密度

西紅柿樣品中三唑酮的回收率與精密度見表2。

表2　西紅柿樣品中三唑酮的回收率與精密度

西紅柿樣品中平均回收率為84.9%～89.3%。根據(jù)國家標準GB/T 27404—2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測中對檢測方法確認的技術要求中，被檢測組分濃度含量小于0.1 mg/kg時，回收率達到60%～120%，即符合方法學的要求。計算各質(zhì)量濃度下平行6次的試驗結果，計算相對標準偏差。

2.4實際樣品分析

按試樣方法對市場上購買的蘋果、梨、西紅柿、韭菜、黃瓜等共10批次蔬菜水果進行三唑酮殘留量分析。結果表明，被測的10批次樣品中，均未檢出三唑酮。

3　結論

本研究建立了果蔬中三唑酮的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC- MS/MS）檢測方法。通過線性關系、檢出限與定量限、加標回收率和精密度試驗等方法學考查，得出該法結果滿意，完全符合方法學要求。該方法前處理簡單、快速、準確，檢出限低、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，為果蔬中三唑酮的殘留監(jiān)控提供了有力的技術支撐。

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Study on Method of Determination of Triadimefon in Fruits and Vegetables by using Ultra High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry

WU Ting，ZHANG Hong，ZHAO Xiaozhen
（Shanxi Academy of Analytical Science，Taiyuan，Shanxi 030006，China）

Abstract：A method for determination of triadimefon in fruits and vegetables is developed by using ultra high performance liquid chromatography- mass spectrometry（UPLC- MS/MS）. The samples are extracted by acetonitrile firstly and the extracts are cleaned using Sep- Pak Vac- SPE. The extracts are separated by a WATERS ACQUITY C18（50×2.1 mm，1.7 μm）utilizing gradient elution with acetonitrile and 0.1%formic acid. The linear relationship（R2=0.999 8）is fine in the concentration range of 1.0 to 100.0 ng/mL. The recoveries are in the range of 84.9%to 89.3%. The RSD is in the range of 2.96%to 3.53%. The method has a practical value with stable，simple，rapid，precise，high extraction efficiency and good reproducibility.

Key words：ultra high performance liquid chromatography - mass spectrometry；fruits and vegetables；triadimefon

中圖分類號：TS255.7

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.04.042

文章編號：1671- 9646（2016）04b- 0040- 03

收稿日期：2016- 03- 24

作者簡介：武婷（1982—），女，碩士，工程師，研究方向為食品添加劑的分析與檢測。