高玉榮，劉立君，李本領(lǐng)，李大鵬（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶　163319）

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發(fā)酵食品中降膽固醇益生菌的篩選及鑒定

高玉榮，劉立君，李本領(lǐng)，李大鵬
（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

摘要：以發(fā)酵香腸、酸菜及酸奶為原料，通過平板分離、體外降膽固醇能力的測定及益生功能評價(jià)，篩選出1株膽固醇降解率為69.2%的益生菌菌株S- 59。該菌株不僅具有良好的耐酸能力、耐膽鹽能力，而且具有較強(qiáng)的疏水性。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)，將其鑒定為嗜酸乳桿菌。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵食品；降膽固醇；益生菌；篩選

隨著生活水平的提高及膳食結(jié)構(gòu)的變化，人們對高脂肪、高膽固醇食物的攝入逐漸增多，導(dǎo)致動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病患者的數(shù)量不斷增加。因此，研究和利用具有降膽固醇功能的微生物以降低食品和人體血清中的膽固醇，對改善人們的健康水平有重要的意義［1］。在認(rèn)識了降膽固醇對機(jī)體的有益功能后，國內(nèi)外掀起了降膽固醇益生菌研究及應(yīng)用的熱潮。這些研究主要集中在降膽固醇益生菌的篩選和鑒定、降膽固醇機(jī)理，以及降膽固醇微生物制劑和降膽固醇保健食品的開發(fā)［2-3］。本文以酸菜、酸奶等發(fā)酵食品為原料，從中篩選具有降膽固醇功能的益生菌，并對篩選出來的益生菌通過形態(tài)鑒定、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列分析進(jìn)行菌種鑒定。

1　試驗(yàn)材料

1.1分離原料

酸奶、酸菜、發(fā)酵香腸，市售。

1.2 菌種

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

2　試驗(yàn)方法

2.1乳酸菌的分離

將發(fā)酵香腸浸提液、酸菜汁、酸奶進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別吸取1×10-5，1×10-6，1×10-7的稀釋液0.1 mL于MRS- CaCO3固體培養(yǎng)基平板上，涂布分離，于37℃條件下培養(yǎng)24 h。將具有明顯溶鈣圈的單菌落挑至MRS固體斜面上，37℃培養(yǎng)24 h。

2.2體外降膽固醇乳酸菌初篩

將分離出的斜面菌種置于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)12～14 h，進(jìn)行活化。按3%的接種量接種到含有膽固醇的MRS- CHOL培養(yǎng)基［1］中，于37℃條件下培養(yǎng)72 h后測定其中的膽固醇含量［4］。2.3體外降膽固醇乳酸菌的復(fù)篩

將初篩獲得的膽固醇降解率較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩，將活化的菌懸液按3%的接種量分別接種含有0.2 mg/mL膽固醇的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)72 h后測定膽固醇含量［4］。

2.4體外降膽固醇乳酸菌的益生功能評價(jià)

2.4.1菌種耐酸性能評價(jià)

挑取1～2環(huán)斜面菌種到10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)12～14 h。取5 mL菌液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，收集菌體，加入10 mL經(jīng)鹽酸（1 mol/L）調(diào)節(jié)pH值為2.0的生理鹽水中，于37℃條件下培養(yǎng)4 h后，通過平板計(jì)數(shù)法測細(xì)胞存活率［5］。

2.4.2菌種耐膽鹽性能評價(jià)

挑取1～2環(huán)斜面菌種到10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)12～14 h。取5 mL菌液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，收集菌體，加入10 mL 含0.3%豬膽鹽的生理鹽水中，于37℃條件下培養(yǎng)4 h后，通過平板計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞存活率［5］。

2.4.3菌種疏水性評價(jià)

將斜面菌種進(jìn)行活化，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)14 h后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，收集菌體細(xì)胞，測定菌體細(xì)胞的疏水性。

3　結(jié)果與分析

3.1發(fā)酵食品原料中降膽固醇微生物的篩選

3.1.1乳酸菌的分離

從酸菜、發(fā)酵香腸和酸奶中，采用MRS固體培養(yǎng)基，通過平板分離法分離出120株具有明顯溶鈣圈且表面光滑乳白色的單菌落。

3.1.2降膽固醇微生物的初篩

降膽固醇乳酸菌的初篩見表1。

表1　降膽固醇乳酸菌的初篩

按照5%的接種量將活化菌株接種到含有膽固醇的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)72 h后，測定體外降膽固醇的能力，共有18株菌株的降膽固醇能力大于40%。

3.1.3降膽固醇微生物的復(fù)篩

降膽固醇乳酸菌的復(fù)篩見表2。

表2　降膽固醇乳酸菌的復(fù)篩

對初篩出的18株菌株進(jìn)行復(fù)篩，確定降膽固醇能力大于60%的菌株4株。

3.2降膽固醇微生物益生功能評價(jià)

（1）耐酸性能的測定。

耐酸能力的測定見表3。

表3　耐酸能力的測定

由表3可知，4株菌株在酸性環(huán)境下存活率大于30%，其中S- 59在pH值為2的酸性環(huán)境下培養(yǎng)4 h后存活率最高為48.8%。

（2）耐膽鹽性能的測定。

耐膽鹽能力的測定見表4。

表4　耐膽鹽能力的測定

由表4可知，4株乳酸菌在膽鹽0.3%的生理鹽水中培養(yǎng)4 h后存活率最高的菌株為S- 61，存活率為32.2%；其次是菌株S- 59，存活率31.8%，但二者差異不顯著。

（3）疏水性的測定。

疏水性的測定見表5。

表5　疏水性的測定

由表5可知，菌株S- 59和S- 61具有較高的疏水率，分別為31.6%和28.7%；資料報(bào)道疏水率介于20%和50%為中度疏水，因此菌株S- 59和S- 61細(xì)菌表面的疏水性達(dá)到了中度疏水，作為益生菌可以在腸道黏膜表面黏附并定殖。

由以上益生功能及發(fā)酵性能評價(jià)結(jié)果看出，S- 59菌株不僅具有較強(qiáng)的降膽固醇能力，而且有較強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽能力和疏水性。因此，對S- 59菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

3.3菌種鑒定

3.3.1形態(tài)鑒定

（1）個體形態(tài)鑒定。

S- 59菌株顯微形態(tài)（10×100）見圖1。

由圖1可知，S- 59菌株的革蘭氏染色結(jié)果為紫色，是革蘭氏陽性（G+）菌；形態(tài)為桿狀，單個生長為主。

圖1　S- 59菌株顯微形態(tài)（10×100）

（2）菌落特征觀察。

S- 59菌落形態(tài)見圖2。

圖2　S- 59菌落形態(tài)

由圖2可知，S- 59菌株的菌落直徑為1～2 mm，呈圓形，表面凸起，微白色，濕潤且邊緣整齊。

3.3.2生理生化試驗(yàn)

生理生化鑒定結(jié)果見表6。

根據(jù)《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步將菌株鑒定為嗜酸乳桿菌。

4　結(jié)論

（1）以發(fā)酵香腸、酸菜及酸奶為原料，通過平板分離、體外降膽固醇能力的測定獲得4株降膽固醇能力大于60%的菌株。

表6　生理生化鑒定結(jié)果

（2）通過益生功能評價(jià)，篩選出1株膽固醇降解率為69.2%的益生菌菌株S- 59，不僅具有良好的耐酸能力和耐膽鹽能力，而且具有較強(qiáng)的疏水性。

（3）經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)，將益生菌菌株S- 59鑒定為嗜酸乳桿菌。

參考文獻(xiàn)：

［1］李昵．降膽固醇乳酸菌的篩選及其降解機(jī)理研究［D］．廈門：集美大學(xué)，2012.

［2］王春光，張雪，李達(dá)，等.酸菜來源植物乳桿菌的分離鑒定與耐受性研究［J］.食品科技，2010（10）：35-38.

［3］靳志強(qiáng)，王延祥，李平蘭，等．植物乳桿菌耐酸耐膽鹽的體外試驗(yàn)及其降膽固醇作用［J］．中國食品學(xué)報(bào)，2009，9（5）：24-28．

［4］中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所. GB/T 5009.128—2003，食品中膽固醇的測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004．

［5］杜連群.工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］．天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1992：47-51．◇

Screening and Identification of Probiotics with Degrading Cholesterol Ability

GAO Yurong，LIU Lijun，LI Benling，LI Dapeng
（Food College，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

Abstract：Using fermented sausage，sauerkraut juice，yogurt as materials，a probiotic strain of S- 59 with 69.2%of cholesterol degrading rate is screened by the plate separation，evaluation of determination and probiotic function. The strain has not only good acid resistance ability，bile salt tolerance ability，but also the ability of hydrophobic. By the morphological，physiological and biochemical experiments，the strain is identified as Lactobacillus acidophilus.

Key words：fermented food；degrading cholesterol；probiotic；screen

中圖分類號：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.04.041

文章編號：1671- 9646（2016）04b- 0037- 03

收稿日期：2016- 03- 03

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究（面上）項(xiàng)目（12541585）。

作者簡介：高玉榮（1970—），女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵工程。