李莉

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CoxA16感染不同病情手足口病患者NK細(xì)胞表達(dá)變化及臨床意義*

李莉①

【摘要】目的：分析探討NK細(xì)胞在CoxA16感染的不同病情手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）患者中的表達(dá)差異及臨床意義。方法：收集2015年4-8月本院感染科確診的CoxA16感染HFMD病例外周血標(biāo)本54例，按臨床表現(xiàn)分為普通型組（16例）、重型組（18例）和危重型組（20例）；同時(shí)，收集EV71感染重型HFMD病例18例作為對照組。患者年齡均為15～24個(gè)月。采用流式細(xì)胞術(shù)對上述外周血標(biāo)本中NK細(xì)胞進(jìn)行檢測。結(jié)果：與正常健康兒童NK細(xì)胞參考值比較，普通型患者中NK細(xì)胞在淋巴細(xì)胞亞群中的相對百分比明顯增高，而在重癥病例中，重型患者NK細(xì)胞相對百分比降低，危重型病例NK細(xì)胞卻顯著升高。普通型組與重癥組（包括重型組及危重型組）及重型組與危重型組組間NK細(xì)胞百分比比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，EV71感染重癥病例中NK細(xì)胞百分比高于正常值，與CoxA16感染重癥病例的NK細(xì)胞低于正常值相反，兩組間NK細(xì)胞表達(dá)差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：CoxA16感染HFMD患者外周血中NK細(xì)胞的表達(dá)與其病情進(jìn)展程度具有很大的相關(guān)性；而且在重癥HFMD病患者中NK細(xì)胞的表達(dá)高低還與患者感染的不同病毒類型有關(guān)。推測NK細(xì)胞在不同病情HFMD中的活化效應(yīng)不僅受到感染病毒致病性高低的影響，而且在病情危重時(shí)，在很大程度上主要受到危重型臨床癥狀的影響。

【關(guān)鍵詞】NK細(xì)胞； CoxA16； 手足口??； EV71； 臨床意義

①昆明市兒童醫(yī)院 云南 昆明 650228

First-author’s address：Kunming Children’s Hospital，Kunming 650228，China

手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）是全球性兒童傳染疾病，近年來在亞太地區(qū)暴發(fā)流行呈上升趨勢，以2歲左右兒童感染居多［1-3］。引發(fā)HFMD的致病病原體主要包括腸道病毒71（Enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒16（CoxA16）兩種，其中EV71具有嗜神經(jīng)毒性，能夠引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，病情危重時(shí)會(huì)導(dǎo)致患者死亡；目前大量研究集中于對其致病分子機(jī)制研究［4-6］。而對于CoxA16，多數(shù)報(bào)道顯示其引發(fā)的HFMD病情較輕，重癥病例數(shù)相對較少，因此，研究相對較少；但自2008年其在芬蘭引發(fā)HFMD暴發(fā)流行以來，目前也被認(rèn)為是與EV71同樣可以導(dǎo)致患者病情發(fā)展至危重、甚至死亡的致病病原體［7-8］。

NK細(xì)胞，作為人體內(nèi)抗病毒免疫反應(yīng)的主要免疫細(xì)胞之一，在病毒感染后，不僅能直接釋放顆粒酶和穿孔素殺傷和清除已感染的靶細(xì)胞，而且還能產(chǎn)生大量炎性因子、免疫調(diào)節(jié)因子抑制病毒的表達(dá)。同時(shí)NK細(xì)胞還可激活、招募其他效應(yīng)細(xì)胞參與抗病毒免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)感染細(xì)胞發(fā)生凋亡［9］。文獻(xiàn)［10］表明，NK細(xì)胞缺乏不僅會(huì)增加CMV、VZV、HSV、痘病毒以及流感病毒的易感性，而且會(huì)加重疾病的病情。這說明，NK細(xì)胞減少或缺失很可能是病毒感染后影響疾病發(fā)展惡化的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。目前，對于CoxA16感染后，HFMD患者體內(nèi)的NK細(xì)胞功能尚無定論，因此，本研究旨在尋找發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞在CoxA16感染的不同病情HFMD中的作用及臨床意義。

1　資料與方法

1.1一般資料 采集2015年4-8月本院感染科確診的CoxA16感染手足口病患者外周血標(biāo)本54例；患者年齡15～24個(gè)月；按臨床分類分為普通型組16例、重型組18例及危重型組20例。此外，還收集了15～24月年齡段EV71感染重癥手足口病病例外周血標(biāo)本15例作為對照。各組間一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)衛(wèi)生部頒發(fā)的《手足口病診療指南》（2010年版）及《腸道病毒71型（EV71）感染重癥病例臨床救治專家共識(shí)》（2011年版）的診斷標(biāo)準(zhǔn)按照臨床分類［11-12］，即普通型病例（手、足、口、臀部皮疹，伴或不伴發(fā)熱）；重癥病例，包括重型（出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)，如：精神差、嗜睡、易驚醒、譫妄；頭痛、嘔吐；肢體抖動(dòng)，肌陣攣、眼球震顫、共濟(jì)失調(diào)、眼球運(yùn)動(dòng)障礙；無力或急性遲緩性麻痹；驚厥。體征可見腦膜刺激征，腱反射減弱或消失）以及危重型（出現(xiàn)下列情況之一者：頻繁抽搐、昏迷、腦疝或呼吸困難、紫紺、血性泡沫痰、肺部羅音等或休克等循環(huán)功能不全表現(xiàn)）收集病例。

1.3試劑及主要儀器 試劑：采用BD公司生產(chǎn)的檢測淋巴細(xì)胞亞群的試劑盒 BD Multitest 6-color TBNK Reagent。該試劑盒中含有識(shí)別富集不同淋巴亞群（T細(xì)胞、B細(xì)胞以及NK細(xì)胞）的抗體，其中包括識(shí)別NK細(xì)胞的抗體（CD16和CD56 PE）、識(shí)別T細(xì)胞的抗體（CD3 FITC）、為淋巴細(xì)胞群設(shè)置的CD45 PerCP-Cy?5.5、檢測CD4+T細(xì)胞的CD4 PE-Cy?7、識(shí)別B淋巴細(xì)胞的CD19 APC以及識(shí)別CD8+T細(xì)胞的CD8 APC-Cy7。主要檢測儀器：BD FACSCanto?，使用BD FACSCanto?軟件進(jìn)行參數(shù)設(shè)置、質(zhì)控監(jiān)測以及數(shù)據(jù)分析。

1.4方法 流式細(xì)胞儀檢測：采集患者靜脈血2～3 mL，注于EDTA-Na抗凝管中。按照操作說明書，分別向已編好號(hào)的試管中加入20 μL六色單克隆抗體和同型對照；分別向試管中加入混勻的100 μL抗凝血；混勻，避光，室溫孵育15～20 min；加入已稀釋好的溶血素600 μL混勻避光室溫溶血8～10 min；上機(jī)檢測。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以中位數(shù)及5%～95%置信區(qū)間表示各組NK細(xì)胞的表達(dá)情況，比較采用 X2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CoxA16感染不同病情HFMD患者外周血NK細(xì)胞的表達(dá)比較 數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，普通型HFMD患者外周血淋巴細(xì)胞亞群中NK細(xì)胞百分比（15.850%）顯著高于正常健康兒童NK細(xì)胞參考值（8.000%），而在重癥病例中，NK細(xì)胞在臨床分類的重型以及危重型HFMD中表達(dá)不一致；重型時(shí)為6.535%，低于正常值，而危重型時(shí)為22.645%，顯著高于正常值。由此提示在普通型病例中，NK細(xì)胞可能發(fā)揮著重要的抗病毒免疫效應(yīng)；但在病情發(fā)展至重癥時(shí)，NK細(xì)胞發(fā)揮的免疫效應(yīng)很可能因患者重癥程度病情不同而表現(xiàn)不同，見表1。

表1　CoxA16感染不同病情HFMD患者外周血NK細(xì)胞的表達(dá)比較 %

2.2NK細(xì)胞表達(dá)變化與病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系比較 重型組NK細(xì)胞表達(dá)為（6.394±2.036）%，明顯低于普通型組的（16.423±4.438）%和危重型組的（25.284±9.725）%，差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且普通型組明顯低于危重型組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此說明，15～24個(gè)月年齡段、CoxA16感染的HFMD患者外周血中NK細(xì)胞的表達(dá)變化與患者的不同病情間具有很大的相關(guān)性，見圖1。

圖1　NK細(xì)胞表達(dá)變化與病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系比較

2.3CoxA16感染重型HFMD患者與EV71感染重型HFMD患者外周血中NK細(xì)胞表達(dá)比較 與正常健康兒童參考值（8.000%）比較，EV71感染的重型HFMD患者外周血NK細(xì)胞百分比明顯升高升高，與CoxA16感染的重型HFMD患者NK細(xì)胞百分比降低的情況相反，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。在重型HFMD患者體內(nèi)，NK細(xì)胞的表達(dá)變化與患者感染病毒（CoxA16或EV71感染）類型間具有一定的相關(guān)性。即不同病毒感染情況下，NK細(xì)胞受病毒刺激活化程度不同，表達(dá)差異也相對明顯，見圖2。

表2　CoxA16感染重型HFMD患者與EV71感染重型HFMD患者外周血中NK細(xì)胞表達(dá)比較 %

圖2　CoxA16感染重型HFMD患者與EV71感染重型HFMD患者外周血中NK細(xì)胞表達(dá)比較

3　討論

病毒感染后，NK細(xì)胞作為主要免疫細(xì)胞之一，同T細(xì)胞、B細(xì)胞一起在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著非常重要的抗病毒免疫作用［13-15］。目前關(guān)于NK細(xì)胞發(fā)育的最新研究同時(shí)觀察到NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL細(xì)胞）在反應(yīng)時(shí)相及高峰出現(xiàn)上有顯著互補(bǔ)，即NK細(xì)胞反應(yīng)在前，CTL細(xì)胞緊隨其后。當(dāng)CTL細(xì)胞反應(yīng)遲鈍或缺乏時(shí)NK細(xì)胞的高峰及持續(xù)時(shí)間會(huì)自動(dòng)延后。這提示NK細(xì)胞對CTL有調(diào)節(jié)作用，而且NK細(xì)胞的發(fā)育很可能早于T細(xì)胞［16］?；诖?，筆者推測，處于成長發(fā)育期兒童體內(nèi)的NK細(xì)胞功能也很可能優(yōu)于T細(xì)胞，而且還有一種情況是T細(xì)胞功能受抑時(shí)，NK細(xì)胞發(fā)揮的抗病毒免疫反應(yīng)很可能更強(qiáng)。

對于成長期的兒童，其體內(nèi)的淋巴細(xì)胞亞群與年齡密切相關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道，年齡處于15～24個(gè)月的正常健康兒童，其外周血中NK細(xì)胞百分比相對較低（8.000%）。當(dāng)年齡大于2歲后，NK細(xì)胞隨年齡增大而逐漸增多，成人時(shí)，NK細(xì)胞達(dá)13.000%。本研究中選取的患者病例年齡均處于15～24個(gè)月，在病毒刺激情況下，普通型及危重型患者NK細(xì)胞均明顯升高，而重型患者NK細(xì)胞減低；而且普通型與重型、危重型以及重型與危重型間NK細(xì)胞表達(dá)比較均有顯著差異，一方面說明NK細(xì)胞的表達(dá)與CoxA16感染的不同HFMD病情有關(guān)，另一方面也提示即便同是重癥HFMD，重型及危重型患者體內(nèi)NK細(xì)胞的表達(dá)也可能會(huì)截然相反。這可能與CoxA16感染的重癥HFMD患者在不同臨床表現(xiàn)時(shí)，其體內(nèi)的免疫功能已經(jīng)出現(xiàn)紊亂有關(guān)。

NK細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)的非特異性殺傷細(xì)胞，在病毒急性感染初期，可迅速擴(kuò)增殺死體內(nèi)已感染病毒細(xì)胞，但在持續(xù)感染期，其殺傷病毒感染細(xì)胞的功能很可能因病毒的干擾而受到抑制［10，17-18］。有研究顯示在急性HBV感染早期，NK細(xì)胞的殺傷作用增強(qiáng)，而在慢性乙型肝炎、肝硬化患者體內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量及活性均受抑制，提示HBV的持續(xù)存在很可能與病毒抑制NK細(xì)胞為代表的固有免疫系統(tǒng)功能有關(guān)［19］。本研究中發(fā)現(xiàn)的CoxA16感染早期，普通型HFMD患者NK細(xì)胞顯著升高；而當(dāng)病情發(fā)展至重型時(shí)，機(jī)體內(nèi)NK細(xì)胞減低，該結(jié)果與上述研究結(jié)果相符。對于本研究中發(fā)現(xiàn)的危重型病例NK細(xì)胞顯著升高的原因，可能在于危重型時(shí)，患者體內(nèi)免疫功能的變化在很大程度上受到了患者危重的臨床癥狀的影響，由于致病病毒對于患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重干擾，患者出現(xiàn)抽搐、昏迷、腦疝、呼吸困難等非常嚴(yán)重的臨床癥狀，危及生命，此時(shí)，對機(jī)體內(nèi)部免疫功能起調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)-免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)很可能發(fā)揮著主要的作用，NK細(xì)胞數(shù)量激增很可能與該信號(hào)通路活化明顯有關(guān)，對于相關(guān)分子機(jī)制研究后期將進(jìn)行深入分析。

對于本研究發(fā)現(xiàn)的在重型HFMD患者體內(nèi)，NK細(xì)胞的表達(dá)變化與患者感染病毒（CoxA16或EV71感染）類型相關(guān)的結(jié)果，筆者認(rèn)為與致病病毒的毒性強(qiáng)弱有關(guān)；本研究中，CoxA16感染重型患者NK細(xì)胞減低，而EV71感染重型患者NK細(xì)胞增高。造成該現(xiàn)象的原因一方面推測為因CoxA16致病毒性相對EV71較弱，所以其刺激NK細(xì)胞活化的能力也相對較弱；另一方面也說明EV71的致病機(jī)制與其他腸道病毒致病機(jī)制不同，這也可能是其致病分子機(jī)制目前還尚無定論的原因之一。

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Clinical Significance of the NK Cells Expression Changes in HFMD Patients Infected by CoxA16 with Different Severity Degrees

LI Li.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：008-012

【Abstract】Objective：To compare and analyze the different expression of NK lymphocytes subset in peripheral blood in children with different severity degree of hand-foot-mouth disease（HFMD） after CoxA16 infection.Method：The peripheral blood samples of 54 CoxA16 infected patients from the confirmed cases with foot-and-mouth disease in the infectious disease department in our hospital from April 2015 to August 2015 were collected and devided into 3 groups according to the difference of severity degree，16 patients in the mild cases group，18 in the severe cases group，and 20 in critical illness cases group.separately.The other 18 peripheral blood samples of EV71 infected severe HFMD patients were selected as the control group.All the patients aged 15 to 24 months.The expression of NK lymphocyte in all cases above were detected by flow cytometry.Result：Compared to the reference value of NK cells in healthy children，the percentage of NK cells in peripheral blood was obviously elevated in the mild cases group，while it showed decreasing expression in the severe cases group patients but evident increasing in the critical illness cases group.Moreover，it had significantly differences between either the mild cases group and the two severe symptom cases（contain the severe cases group and critical illness cases group） or the severe cases group and critical illness cases group（P＜0.05）.Besides，contrasted to the decreasing expression of NK cells in CoxA16 infected cases，it showed obvious rising of NK cells in EV71 infected severe patients，of which the difference was also statistic significant（P＜0.05）.Conclusion： The expression of NK cells in peripheral blood were associated with the severity of the clinical manifestations in different CoxA16 infected patients，what’s more，it related to the different type of virus in the severe type cases.Thus，we predict that except the influence of the pathogenicity of different virus，the immune function of NK cells is more affected by the critical clinical symptom in critical condition.

【Key words】NK cells； Coxsackievirus A16； Hand-foot-mouth disease； EV71； Clinical significance

*基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃青年項(xiàng)目（2012FD100）；云南省衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014NS052）

通信作者：李莉

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.003

收稿日期：（2015-12-30） （本文編輯：蔡元元）