陳海翎，王　倩，李菊芬，鄧麗麗

(北京積水潭醫(yī)院內分泌科　100035)

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瘦素受體基因Gln223Arg變異對代謝綜合征患者動態(tài)血壓的影響*

陳海翎，王倩，李菊芬，鄧麗麗

(北京積水潭醫(yī)院內分泌科100035)

[摘要]目的探討瘦素受體基因Gln223Arg變異與代謝綜合征的相關性及其對動態(tài)血壓的影響。方法選取來該院就診的代謝綜合征患者167例，健康體檢者216例，均進行血壓、動態(tài)血壓、生化指標、胰島素檢查。以聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)行DNA多態(tài)性分析，電泳并測序判斷瘦素受體基因Gln223Arg基因型。結果檢測到AA、GG、AG 3種基因型。代謝綜合征組攜帶A等位基因的頻率顯著高于對照組，攜帶A等位基因發(fā)生代謝綜合征和發(fā)生血壓節(jié)律呈非杓型的風險分別是攜帶G等位基因的3.302倍(P=0.000；95%CI:2.432～4.483)和2.506倍(P=0.000；95%CI：1.566～4.008)。AA基因型患者具有較高的體質量指數(shù)、血糖、血壓、空腹胰島素水平，血脂紊亂更嚴重，腰圍更大，胰島素抵抗指數(shù)更高。攜帶A等位基因的代謝綜合征患者各項動態(tài)血壓指標較高。結論瘦素受體基因Gln223Arg多態(tài)性A等位基因攜帶者發(fā)生代謝綜合征的風險大，動態(tài)血壓指標較高，并且更傾向于非杓型的血壓節(jié)律。

[關鍵詞]瘦素受體；基因多態(tài)性；代謝綜合征；動態(tài)血壓

目前瘦素、瘦素受體(leptin receptor,LEPR)及其基因受到國際上廣泛關注。由肥胖基因編碼的蛋白質激素瘦素在與LEPR結合后可抑制食欲、減少熱量攝取、提高機體代謝率及減少脂肪堆積。而研究發(fā)現(xiàn)LEPR基因與肥胖、高血糖、高血壓、高血脂等密切相關。這些危險因素在同一個體的集聚構成了代謝綜合征(metabolism syndrome,MS)，集聚的危險因素也造成了MS患者極高的心血管疾病發(fā)病率和病死率。而動態(tài)血壓監(jiān)測發(fā)現(xiàn)血壓節(jié)律的紊亂使心血管系統(tǒng)長時間處于過重負荷狀態(tài),導致心、腦和腎臟等靶器官損害的風險增加[1]。目前，關于LEPR基因Gln223Arg多態(tài)性與MS的關系及其對于動態(tài)血壓的影響的報道較少，基于此，本文探討LEPR基因Gln223Arg變異與MS的相關性及其對于動態(tài)血壓的影響。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1MS組167例(男92例，女75例)MS患者均為2005年10月至2012年6月本院門診初診未經(jīng)治療的MS患者，均符合2005年國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)的MS診斷標準[2]：男性腰圍大于或等于90 cm，女性腰圍大于或等于80 cm，符合以下因素中任意2項，(1)三酰甘油(TG)≥1.70 mmol/L;(2)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)減低，男性低于1.0 mmol/L,女性低于1.30 mmol/L;(3)血壓升高,收縮壓(SBP)≥130 mm Hg和(或) 舒張壓(DBP)≥85 mm Hg;(4)空腹血糖(FPG)≥5.6 mmol/L。排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、瓣膜疾病、先天性心臟病患者。

1.1.2對照組本院同期健康體檢者216例(男121例，女95例)，根據(jù)體檢結果排除了肥胖、血壓、血脂、血糖等異常，并排除有高血壓、肥胖、高血脂、高血糖家族史者。

1.2方法采用鹽析法抽提DNA，DNA多態(tài)性分析采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法。

1.2.1引物設計與合成上游：5′-ACC CTT TAA GCT GGG TGT CCC AAA TAG-3′；下游：5′-AGC TAG CAA ATA TTT TTG TAA GCA ATT-3′。特異性擴增包含Gln223Arg位點的序列。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成并進行質量鑒定。

1.2.2PCR擴增PCR擴增標準程序(英國Hybaid Express 全自動PCR擴增儀)，(1)預變性：94 ℃ 5 min；(2)PCR反應：94 ℃ 5 s；(3)退火：59.4 ℃ 40 s；(4)延伸：72 ℃ 45 s。共循環(huán)36次，72 ℃再延伸10 min。

1.2.3限制性核酸內切酶酶切取PCR擴增產(chǎn)物8.2 μL，10×Buffer 1 μL，Msp I(英國Biolabs公司)8 μL，dH2O 20 μL，水浴(37 ℃)4 h。

1.2.4電泳判斷基因型及測序酶切產(chǎn)物點樣至含溴化乙啶的2%的瓊脂糖凝膠，電壓120 V電泳40 min；紫外燈下檢測照相；于美國Kodak凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳圖；由國家人類基因組北方研究中心進行抽樣測序，核實基因型。

1.2.5身高、體質量、腰圍、SBP、DBP等數(shù)據(jù)采集對照組及MS組患者測量身高、體質量、腰圍并計算體質量指數(shù)(body mass index,BMI)。測量SBP、DBP并佩戴美國DMS動態(tài)血壓監(jiān)測儀進行動態(tài)血壓監(jiān)測(ambulatory blood pressure monitoring，ABPM)。以24 h動態(tài)血壓均值130/80 mm Hg,白晝均值135/85 mm Hg，夜間均值120/75 mm Hg，夜間血壓下降率超過10%為正常參照值。其中，夜間血壓下降率=(白晝均值-夜間均值)/白晝均值；收縮壓(舒張壓)負荷為監(jiān)測過程中收縮壓(舒張壓)超過140(90)mm Hg的次數(shù)百分率。

1.2.6胰島素抵抗采用日立7170型全自動生化儀檢測清晨空腹血脂等生化指標。采用放免法測定空腹血清胰島素(Insulin)，胰島素測定中使用的試劑均由北京北方生物制劑所提供，按照說明書操作。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)評估用穩(wěn)態(tài)模型評估法計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment insulin resistance index,HOMA-IR)，即:HOMA-IR=空腹胰島素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。

2結果

2.1多態(tài)性基因型分析PCR擴增產(chǎn)物片段大小為 421 bp，酶切后3種基因型產(chǎn)生3種酶切產(chǎn)物。AA純合子(Gln/Gln,Gln223):421 bp 、GG純合子(Arg/Arg,Arg223):294+127 bp和AG雜合子(Gln/Arg,Gln223/Arg223):421+294+127 bp。電泳圖見圖1，測序結果見圖2。

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗顯示，基因型分布的Pearson chi-square P值在MS組為0.632，在對照組為0.778(P>0.05)，提示Gln223Arg基因型分布頻率達到遺傳平衡，具有群體代表性。

2.3基因多態(tài)性與發(fā)生MS的關系MS組年齡范圍為25～78歲，對照組為26～77歲。兩組一般臨床情況及生化指標見表1，可見兩組的年齡、性別構成比以及有吸煙史、飲酒史的比例差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。而MS組的BMI、血壓以及不同性別患者的腰圍均顯著高于對照組(P<0.05)。MS組的空腹血糖、總膽固醇、低密度脂蛋白、TG均顯著高于對照組，而高密度脂蛋白顯著低于對照組(P<0.05)。MS組的空腹胰島素則顯著高于對照組(P<0.01)。這均符合MS的疾病臨床特點。

MI：Marker I，條帶為100、200、300、400、500、600 bp；P：PCR產(chǎn)物，421 bp；AA(Gln/Gln):421 bp；GG(Arg/Arg):294+127 bp；AG(Gln/Arg):421+294+127 bp。

圖1LEPR基因Gln223Arg 多態(tài)性代謝綜合征MS pⅠ酶切電泳圖

表1　MS組與對照組一般臨床資料比較±s)

*:P<0.05;**:P<0.01。

表2　MS組與對照組LEPR 基因Gln223Arg基因型構成比與等位基因頻率[n(%)]

**:P<0.01。

圖2　LEPR基因Gln223Arg多態(tài)性測序結果(突變周圍)

兩組LEPR基因Gln223Arg多態(tài)性各基因型、等位基因頻率的比較見表2?？梢妰山M基因型構成比與等位基因頻率均存在顯著差異，MS組AA基因型及AG基因型所占比例顯著高于對照組，MS組攜帶A等位基因的頻率顯著高于對照組(P<0.01)。在等位基因頻率的比較中，OR值為3.302(95%CI,2.432～4.483)，即攜帶有A等位基因發(fā)生MS的風險是攜帶G等位基因的3.302倍。

2.4基因多態(tài)性各基因型對代謝綜合征各組分的影響MS組患者按照LEPR基因Gln223Arg多態(tài)性的3種基因型分組后，3組間年齡差異無統(tǒng)計學意義。但AA基因型患者具有較高的BMI、血糖水平、血壓水平、空腹胰島素水平，血脂紊亂更嚴重，腰圍更大，胰島素抵抗指數(shù)更高，差異有統(tǒng)計學意義，其中血糖、TG、高密度脂蛋白及胰島素抵抗指數(shù)的差異有統(tǒng)計學意義(表3)。

2.5各基因型對MS患者動態(tài)血壓的影響MS組動態(tài)血壓監(jiān)測97.36%符合動態(tài)血壓診斷高血壓的標準。不同基因型間24 h、白天、夜間血壓以及血壓最大值、最小值、血壓負荷、心率各項動態(tài)血壓指標均有AA>AG>GG 的趨勢。除了最小收縮期血壓、最小舒張期血壓和夜間舒張期血壓外，其余各項指標在3種基因型間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中收縮期血壓負荷在3種基因型間的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006)，見表4。

以夜間血壓下降率是否大于或等于10%化分血壓節(jié)律是否為杓型，結果MS組患者3種基因型發(fā)生血壓非杓型的比例同樣是AA>AG>GG(P=0.000)。攜帶A和G等位基因發(fā)生血壓節(jié)律呈非杓型的比率例分別為76.57%和56.60%(P=0.000)。攜帶A等位基因發(fā)生血壓節(jié)律呈非杓型的風險是G等位基因的2.506倍(OR=2.506,95%CI：1.566-4.008)。

表3　MS組不同LEPR 基因Gln223Arg基因型的相關指標比較

*:P<0.05;**:P<0.01。

表4　LEPR基因Gln223Arg基因型對MS患者動態(tài)血壓指標的影響

續(xù)表4　LEPR 基因Gln223Arg基因型對MS患者動態(tài)血壓指標的影響

*:P<0.05;**:P<0.01。

3討論

肥胖基因的蛋白產(chǎn)物瘦素具有控制食物攝入、能量消耗、防止異位脂質沉積、改變肌肉或肝臟的胰島素敏感性、聯(lián)接免疫系統(tǒng)與內分泌系統(tǒng)等廣泛的生物學效應，因而與肥胖及其代謝紊亂相關[3]。瘦素需與其特異性的LEPR相結合作用發(fā)揮。突變頻率較高的Gln223Arg多態(tài)性是LEPR胞外區(qū)基因的編碼區(qū)第6外顯子上第668位堿基突變。這可造成谷氨酰胺變?yōu)榫彼?，導致LEPR與瘦素親和力及信號傳導過程的改變，影響瘦素與受體結合和作用的發(fā)揮。

LEPR基因Gln223Arg變異已被證實與肥胖[4]、2型糖尿病(T2DM)[5]、高血壓[6]、血脂紊亂[7]等諸多心血管疾病危險因素密切相關。而且國外研究發(fā)現(xiàn)Gln223Arg多態(tài)性可能還是MS的易感因素[8]。MS正是上述多種心血管危險因子在同一個體聚集的集中表現(xiàn)，這種協(xié)同作用危害更大[9]。但目前關于LEPR基因Gln223Arg變異與MS相關性的研究國內罕見報道，對動態(tài)血壓的影響亦欠明確。

在診斷上，本研究采用了2005年國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)標準，并按其要求選用了國人特異性的腰圍切點，而未采用2004年的中華醫(yī)學會糖尿病學分會(CDS)的標準。其主要原因是一些研究認為IDF標準作為目前全球最新標準診斷MS比較靈敏(靈敏度為100%,特異度為92.5%)，而對于非MS者,則與CDS標準有同樣的鑒別力[10]。

本研究中，攜帶有A等位基因發(fā)生MS的風險是G等位基因的3.302倍。攜帶有A等位基因的MS患者發(fā)生胰島素抵抗的風險是G等位基因的3.446倍,而且代謝紊亂更加嚴重。巴西學者的研究亦支持LEPR基因Gln223Arg多態(tài)性是MS的易感因素[8]，但其研究認為帶來MS高發(fā)風險的是G等位基因。檢索近年來中外學者對LEPR基因Gln223Arg多態(tài)性與肥胖、T2DM、高血壓、血脂紊亂、等MS的單一組分之間的關系的研究發(fā)現(xiàn)，結論也并不一致。目前越來越多的研究肯定了A等位基因攜帶者具有更高的血糖[5]、血壓[6]、胰島素水平[11]，更嚴重的血脂紊亂[7]和更加肥胖[4]。這些均支持本研究的結論。因此有理由相信LEPR基因Gln223Arg多態(tài)性A等位基因是MS及其各組分的易感因素。

筆者認為各研究存在較大分歧的原因可能有：(1)相同基因突變在不同人群中頻率不同，所起的作用可能不同；(2)人類肥胖、血壓、血糖等復雜性狀受多因素、多基因的影響,單個基因的影響相對較小。樣本量有限時,對微效基因相關性的分析將受到影響。而且一個基因上的一點變異也不可能完全概括該基因對表型的全部作用。(3)各研究的方案設計及樣本的選擇方法也不相同。特別是當入選者為老齡人群時，不良生活習慣等環(huán)境因素對于疾病的影響將遠遠大于對年輕人群的影響，甚至最終完全逆轉了基因對于疾病的影響。本研究入選者近400例，而且MS組選擇的是初發(fā)患者，平均年齡在中年水平，盡可能減少了這些因素的影響。

考慮LEPR基因Gln223Arg多態(tài)性變異導致代謝紊亂的可能機制為:Gln223Arg多態(tài)性基因變異導致LEPR表達減少和蛋白結構異常,影響其信號轉導功能[4]，造成受體不敏感，分泌過多的瘦素。瘦素與其他細胞因子等相互作用，通過交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活[12]、迷走神經(jīng)調節(jié)功能受損[13]、一氧化氮機制[14]、腎素-血管緊張素系統(tǒng)[15]、IR[16]等機制共同促進了肥胖、高血壓、高血糖、血脂紊亂等危險因素的叢集出現(xiàn)，進而出現(xiàn)MS。

另外本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶A等位基因的MS患者各項動態(tài)血壓指標較高，而且發(fā)生血壓節(jié)律呈非杓型的風險是G等位基因的2.506倍。這說明帶有A等位基因者高血壓更加嚴重，并且容易發(fā)生血壓節(jié)律的改變。具體血壓節(jié)律紊亂的原因可能與前面提到的基因變異最終引起交感及副交感神經(jīng)活動失常有關，最終導致血壓節(jié)律呈非杓型。而節(jié)律的變異使心血管系統(tǒng)更長時間地處于過重負荷狀態(tài),導致心、腦和腎臟等靶器官損害的全面風險增加[1]。故血壓的晝夜節(jié)律是判斷高血壓病情嚴重程度的重要指標之一。研究表明非杓型血壓節(jié)律者有更高的心律失常檢出率[17]以及卒中和心肌梗死發(fā)生率[18]，而且可導致內皮功能障礙及血小板聚集、黏附能力增加[19]。國外研究甚至認為非杓形血壓是心肌重構及左室舒張功能障礙的決定因子[20]和卒中、心肌梗死風險的最佳預測因素[18]。而且非杓形血壓是獨立于血壓負荷及其他引起腎損害的危險因素之外的腎功能惡化危險因素[21]。

雖然種族和表型研究結果的多樣化提示LEPR基因Gln223Arg多態(tài)性可能為MS各單一組分的微效作用基因，但重要的是本研究提示了這一變異帶來了明顯的危險因素叢集。研究國人這一多態(tài)性與MS及血壓節(jié)律間的關系,有助于找到MS發(fā)病的遺傳機制,及早發(fā)現(xiàn)危險人群。同時本研究提示，對于存在Gln223Arg多態(tài)性變異的患者應早期開展對心臟病變的1級預防治療,重視對于動態(tài)血壓監(jiān)測中血壓節(jié)律的改善。而且防治措施應該是多角度多環(huán)節(jié)的，不僅側重于各危險因素的逐一控制，更應積極干預其深層發(fā)生機制如IR、交感神經(jīng)活性等。

由于復雜的基因-環(huán)境相互作用，本研究樣本量仍顯不足。本研究也未進行瘦素水平的檢測。今后,為了排除多基因遺傳和環(huán)境因素相互協(xié)同或干擾作用，尚需更全面的橫向的基因聯(lián)合變異研究，以進一步揭示真實的遺傳基礎。

參考文獻

[1]Ozdemir E,Yildirimturk O,Cengiz B,et al.Evaluation of carotid intima- media thickness and aortic elasticity in patients with nondipper hypertension[J].Echocardiography,2014,31(5):663-668.

[2]金文勝，潘長玉．國際糖尿病聯(lián)盟關于代謝綜合征定義的全球共識[J]．中華內分泌代謝雜志，2005，21(4)：附錄4b-附錄4I．

[3]Blaslov K,Bulum T,Duvnjak L.The role of endothelial dysfunction driven by adipocitokines in the development and progression of microvascular complications in patients with type 1 and type 2 diabetes[J].Med Hypotheses,2015,84(6):593-595.

[4]Angeli CB,Kimura L,Auricchio MT,et al.Multilocus analyses of seven candidate genes suggest interacting pathways for obesity-related traits in Brazilian populations[J].Obesity (Silver Spring),2011,19(6):1244-1251.

[5]應俊，石楠松，潘若望，等．瘦素受體基因Gln223Arg變異與浙南地區(qū)2型糖尿病的相關性研究[J]．中國老年學雜志，2009，29(7)：858-860．

[6]Liu Y,Lou YQ,Liu K,et al.Role of leptin receptor gene polymorphis in susceptibility to the development of essential hypertension:a case-control association study in a Northern Han Chinese population[J].J Hum Hypertens,2014,28(9):551-556.

[7]Sun YM,Wang LF,Li J,et al.The 223a > G polymorphism of the leptin receptor gene and lipid-lowering efficacy of simvastatin in Chinese patients with coronary heart disease[J].Eur J Clin Pharmacol,2009,65(2):157-161.

[8]Gottlieb MG,Bodanese LC,Leite LE,et al.Association between the Gln223Arg polymorphism of the leptin receptor and metabolic syndrome in free-living community elderly[J].Metab Syndr Relat Disord,2009,7(4):341-348.

[9]Cuspidi C,Sala C,Lonati L,et al.Metabolic syndrome,left ventricular hypertrophy and carotid atherosclerosis in hypertension:a gender-based study[J].Blood Press,2013,22(3):138-143.

[10]郭琦，王敬瀚，胡玉清，等．肥胖、高血壓、老年是代謝綜合征的3個主要組成成分[J]．中華高血壓雜志，2009，17(9)：830-834．

[11]Li L,Lee KJ,Choi BC,et al.Relationship between leptin receptor and polycystic ovary syndrome[J].Gene,2013,527(1):71-74.

[12]Head GA,Lim K,Barzel B,et al.Central nervous system dysfunction in obesity-induced hypertension[J].Curr Hypertens Rep,2014,16(9):466-473.

[13]De Lartigue G,Ronveaux CC,Raybould HE.Deletion of leptin signaling in vagal afferent neurons results in hyperphagia and obesity[J].Mol Metab,2014,3(6):595-607.

[14]Tsuda K.Leptin and nitric oxide in blood pressure regulation in humans[J].Am J Hypertens,2014,27(11):1428.

[15]Fontana V,Cabral De Faria AP,Oliveira-Paula GH,et al.Effects of angiotensin-converting enzyme inhibition on leptin and adiponectin levels in essential hypertension[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol,2014,114(6):472-475.

[16]Nalini D,Karthick R,Shirin V,et al.Role of the adipocyte hormone leptin in cardiovascular diseases - a study from chennai based population[J].Thromb J,2015,13(12):12.

[17]Ersoylu ZD,Tu?cu A,Yildirimtürk O,et al.Comparison of the incidences of left ventricular hypertrophy,left ventricular diastolic dysfunction,and arrhythmia between patients with dipper and non-dipper hypertension[J].Turk Kardiyol Dern Ars,2008,36(5):310-317.

[18]Vaz-De-Melo RO,Toledo JC,Loureiro AA,et al.Absence of nocturnal dipping is associated with stroke and myocardium infarction[J].Arq Bras Cardiol,2010,94(1):79-85.

[19]Rekhviashvili A,Tsinamdzgvrishvili B,Chkhetia M,et al.Relationship of 24-hour blood pressure rhythm with endothelial function and blood rheology[J].Georgian Med News,2008(159):21-26.

[20]Tadic M,Ivanovic B,Celic V,et al.Are the metabolic syndrome,blood pressure pattern,and their interaction responsible for the right ventricular remodeling?[J].Blood Press Monit,2013,18(4):195-202.

[21]Ishikawa J,Shimizu M,Hoshide S,et al.Cardiovascular risks of dipping status and chronic kidney disease in elderly Japanese hypertensive patients[J].J Clin Hypertens,2008,10(10):787-794.

Influence of leptin receptor gene Gln223Arg variation on ambulatory blood pressure in patients with metabolism syndrome*

Chen Hailing,Wang Qian，Li Jufen，Deng Lili

(Department of Endocrinology,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the correlation between leptin receptor(LEPR) gene Gln223Arg variation with metabolism syndrome and its influence on ambulatory blood pressure.MethodsTotally 167 patients with metabolism syndrome were selected and contemporaneous 216 individuals undergoing the physical examination were selected as the control group.The blood pressure,ambulatory blood pressure,biochemical indicators and insulin were detected in all the subjects.The DNA polymorphology analysis was performed by adopteint PCR-restricted fragment length polymorphism(RFLP).The Gln223Arg genotype was judged by electrophoresis and sequencing.ResultsThree genotypes of AA,GG and AG were detected.The frequency of carrying A alleles in the metabolism syndrome group was significantly higher than that in the control group.The occurrence risk of metabolism syndrome and non-dipper type blood pressure rhythm for carrying allele A was 3.302 times(P=0.000；95%CI:2.432-4.483)and 2.506 times of carrying allele G(P=0.000；95%CI：1.566-4.008).The patients with AA genotype had higher BMI，blood pressure,blood glucose and fasting insulin levels,more serious dyslipidemia,greater waist circumference and higher insulin resistance index.The patients with metabolism syndrome carrying A allele also had higher ambulatory blood pressure indexes.ConclusionLEPR gene Gln223Arg polymorphism A allele carrier has the great risk for metabolism syndrome occurrence,higher ambulatory blood pressure,moreover is more inclined to non-dipper type blood pressure rhythm.

[Key words]leptin receptor;gene;polymorphism,metabolism syndrome；ambulatory blood pressure monitoring

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.016

* 基金項目：北京市保健專項資金資助項目(京06-09號)。

作者簡介：陳海翎(1972-)，博士，副主任醫(yī)師，主要從事糖尿病，骨質疏松，代謝綜合征方面的研究。

[中圖分類號]R589

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1201-05

(收稿日期：2015-09-29修回日期：2015-12-16)