魏靜，高晨

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100026

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·綜述·

微小RNA在朊病毒病等神經(jīng)退行性疾病中的研究進(jìn)展

魏靜，高晨

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100026

摘要：朊病毒病是一類具有傳染性、不可逆且致命的神經(jīng)退行性疾病，其致病機(jī)制為體內(nèi)正常編碼的細(xì)胞型朊蛋白(cellular prion protein，PrPC)構(gòu)象發(fā)生變化，形成了具有感染性的異常癢病型朊病毒(scrapie prion protein，PrPSc)，但具體機(jī)制不清楚，目前為止尚無有效治療方法。微小RNA(microRNA,miRNA)可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控細(xì)胞蛋白表達(dá)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及功能起重要作用。近年來，對(duì)一些特定miRNA在朊病毒病中相應(yīng)調(diào)控機(jī)制、自發(fā)免疫、炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及靶基因預(yù)測(cè)方面的研究可為治療朊病毒病提供新的角度。本文就miRNA在朊病毒病發(fā)生中的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并詳細(xì)探討其中研究較為深入的miRNA。

關(guān)鍵詞：微小RNA；朊病毒??；調(diào)控機(jī)制；分子標(biāo)記

神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative disease)，是一類慢性進(jìn)行性神經(jīng)組織退行變性導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的總稱。病理上表現(xiàn)為腦和(或)脊髓神經(jīng)元的退行變性和丟失。主要疾病包括帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、亨廷頓病(Huntington disease，HD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)及傳播性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathy，TSE)。這一類疾病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，病理表現(xiàn)和疾病特征也不盡相同，但大腦特定區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞退行性病變和細(xì)胞丟失是共同特征[1]。

傳播性海綿狀腦病又稱朊病毒病，是一類具有感染性的神經(jīng)退行性疾病，主要存在于人類和動(dòng)物中。依據(jù)病因可分為散發(fā)型、傳染型和遺傳型。人類朊病毒病包括散發(fā)型克雅病(sporadic Creutzfeldt-Jakob disease，sCJD)、家族型克雅病(familial CJD，fCJD)、醫(yī)源型克雅病(iatrogenic CJD,iCJD)、變異型克雅病(variant CJD，vCJD)、致死性家族失眠癥(fatal familial insomnia，F(xiàn)FI)、格斯特曼(Gerstmann-Str?ussler-Scheinker，GSS)綜合征和庫魯病(Kuru)，以及新確認(rèn)的變異性蛋白酶敏感型朊病毒病(variably protease-sensitive prionopathy，VPSPr)[2]。動(dòng)物朊病毒病則主要包括羊癢疫(scrapie)、牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy，BSE)、鹿的慢性消耗病(chronic wasting disease，CWD)等。

朊病毒病不同于其他神經(jīng)退行性疾病，其具有傳染性。原因是體內(nèi)正常編碼的細(xì)胞型朊蛋白(cellular prion protein，PrPC)構(gòu)象發(fā)生變化，形成了具有感染性的異常癢病型朊病毒(scrapie prion protein，PrPSc)，導(dǎo)致神經(jīng)組織中出現(xiàn)海綿狀空泡樣變性、淀粉樣斑塊沉積、神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)細(xì)胞增生等病理改變。朊蛋白正常生理功能的喪失及朊病毒產(chǎn)生的毒性作用可能是致病機(jī)制。研究顯示，朊蛋白結(jié)構(gòu)變化及致病過程中有多種因子參與，包括脂質(zhì)、蛋白、RNA等[3]。

1神經(jīng)退行性疾病與微小RNA

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由動(dòng)物、植物和病毒基因組所編碼的長(zhǎng)19～23個(gè)核苷酸的小分子單鏈RNA，不具有開放讀碼框架(open reading frame，ORF)，不編碼蛋白質(zhì)，但參與機(jī)體各種重要的生理和病理過程。它們能與靶蛋白mRNA 的3′-非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)堿基互補(bǔ)配對(duì)而起作用，使靶蛋白mRNA降解或表達(dá)抑制，從而導(dǎo)致特定基因的沉默。miRNA的分布具有明顯的組織和細(xì)胞特異性，腦組織中的miRNA高度保守，含量極其豐富，提示其在腦組織的生理和病理功能中起重要調(diào)節(jié)作用[4]。miRNA可使下游靶基因表達(dá)抑制或降解，其自身的活性與穩(wěn)定性也受細(xì)胞內(nèi)一些生化過程的影響[5]，同時(shí)受上游調(diào)控因子的調(diào)控。如在C57BL/6小鼠巨噬細(xì)胞中施加干擾素γ后，可使巨噬細(xì)胞中miR-3474b表達(dá)下調(diào)，而下調(diào)的miR-3473b又可抑制自發(fā)免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)反饋途徑，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的自發(fā)免疫應(yīng)答[6]。而在人原代神經(jīng)元中，施加β淀粉樣蛋白和白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)時(shí)，可使細(xì)胞內(nèi)核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號(hào)途徑激活，使miR-125b和miR-146a表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的miR-125b和miR-146a則分別下調(diào)相應(yīng)的下游靶基因，從而導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞增生、突觸發(fā)生過程失調(diào)、自發(fā)免疫信號(hào)途徑改變等[7]。

近年來，miRNA與神經(jīng)退行性疾病之間的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。在阿爾茨海默病患者海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)異常的miRNA增加；患者腦組織的芯片分析也顯示，即使在早期阿爾茨海默病患者中，miR-107也明顯下調(diào)。BACE1是切割β淀粉樣蛋白前體蛋白而產(chǎn)生具有阿爾茨海默病病理特征的β淀粉樣蛋白的主要成分，研究表明該酶的mRNA水平調(diào)控受miR-107影響[8]。在帕金森病研究中，患者腦多巴胺神經(jīng)元中miR-133b明顯缺失，一個(gè)與疾病相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)rs12720208影響了miR-433與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子20(fibroblast growth factor 20，F(xiàn)GF20)調(diào)控序列的結(jié)合，導(dǎo)致突觸核蛋白(α-synuclein)增加[9]。同時(shí)，Tiribuzi等也發(fā)現(xiàn)高水平miR-7會(huì)導(dǎo)致α-synuclein增加[10]。亨廷頓病中某些miRNA的表達(dá)影響疾病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[11]。這些均提示，miRNA參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展。

朊病毒病作為一類具有感染性且致死的神經(jīng)退行性疾病，不但與阿爾茨海默病、帕金森病等非感染性神經(jīng)退行性疾病有相似的臨床表現(xiàn)和病理特征，而且一些在阿爾茨海默病和帕金森病中參與調(diào)控的miRNA也被發(fā)現(xiàn)在朊病毒病中失調(diào)。如miR-146a不僅在阿爾茨海默病患者腦中表達(dá)上調(diào)[12]，在瘙癢因子22A感染的小鼠腦組織中也上調(diào)[13]；miR-128在亨廷頓病患者腦中表達(dá)下調(diào)[9]，而在瘙癢因子22L感染的N2a細(xì)胞中檢測(cè)到上調(diào)[14]。目前，在朊病毒病研究領(lǐng)域，由于人體樣本不易獲得，多數(shù)研究以模式動(dòng)物或細(xì)胞模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。模式動(dòng)物包括瘙癢因子感染的倉鼠和小鼠，細(xì)胞模型則包括ScN2a等。雖然這些研究的替代模型不能完全反映朊病毒在人體中的真正變化，但大量實(shí)驗(yàn)證明其所揭示的一些機(jī)制為此類疾病致病機(jī)制的研究，甚至疾病檢測(cè)標(biāo)記的篩選，均提供了非常重要的科學(xué)線索。

2朊病毒病中差異表達(dá)miRNA

在探索miRNA是否參與朊病毒感染的致病機(jī)制研究中，很多科學(xué)家進(jìn)行了嘗試：Montag等研究感染BSE的食蟹猴腦組織中miRNA表達(dá)譜[15]；Saba等比較了瘙癢因子感染小鼠動(dòng)物模型中腦組織中miRNA表達(dá)譜[13]；Montag等用瘙癢因子感染的N2a細(xì)胞模型進(jìn)行了miRNA表達(dá)譜的比較[14]。結(jié)果見表1。

表1朊病毒感染的miRNA表達(dá)譜

Tab.1miRNA expression profiles of prion infection

模型組織上調(diào)毒株標(biāo)準(zhǔn)(倍數(shù))參考文獻(xiàn)小鼠腦組織mmu-miR-146a、mmu-miR-342-3p、mmu-miR-128、mmu-miR-320、mmu-miR-let-7b、mmu-miR-328、mmu-miR-139-5p、mmu-miR-338-3p、mmu-miR-337-3p22A>1.75[13]人、獼猴腦組織hsa-miR-342-3p、hsa-miR-26a、hsa-miR-494BSE>2.7[15]小鼠mmu-miR-598、mmu-miR-411、mmu-miR-743b-5p、mmu-miR-708、mmu-miR-128、mmu-miR-338-5p22L>2.0[14]小鼠腦組織突觸mmu-miR-146a、mmu-miR-221、mmu-miR-142-3p、mmu-miR-150、mmu-miR-144、mmu-miR-143、mmu-miR-142-5p、mmu-miR-451RML>2.0[16]

但檢測(cè)結(jié)果并不一致，原因可能：①采用了不同的樣本來源(如基因型個(gè)體不同、臨床進(jìn)展不同)、實(shí)驗(yàn)技術(shù)和分析手段。②進(jìn)行比較的組織部位和細(xì)胞類型不同。miRNA表達(dá)譜具有明顯的組織和細(xì)胞特異性，Saba等比較的瘙癢因子感染小鼠大腦，腦組織中不同類型細(xì)胞的miRNA變化會(huì)掩蓋真實(shí)情況。③體外培養(yǎng)細(xì)胞的分析結(jié)果并不能真正反映機(jī)體水平miRNA表達(dá)譜的改變。因此，尋找一種能在機(jī)體水平并對(duì)同一組織中不同類型細(xì)胞進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析和研究的方法是很有必要的。

無細(xì)胞循環(huán)miRNA(circulating cell-free miRNA)可穩(wěn)定存在于血液、腦脊液、尿液等體液中，通常由外泌體釋放。外泌體是一類由細(xì)胞釋放的直徑50～130 nm的囊泡，含蛋白和多種RNA，其中包括特有的miRNA分子[17]。外泌體經(jīng)細(xì)胞分泌途徑形成后，被釋放到胞外空間，體液中也可檢出[18]。PrPC和PrPSc均與外泌體有關(guān)。外泌體中的PrPSc可能是神經(jīng)細(xì)胞之間感染的主要原因，而外泌體中出現(xiàn)的特異性miRNA可能不僅與致病機(jī)制有關(guān)，還可能成為朊病毒病診斷的重要標(biāo)記。由于目前缺乏無創(chuàng)的朊病毒病檢測(cè)方法，體液或血液中存在的特異性蛋白及一些其他分子對(duì)疾病的診斷有著重大意義。

據(jù)此，Bellingham等對(duì)朊病毒感染的神經(jīng)細(xì)胞外泌體miRNA進(jìn)行芯片分析發(fā)現(xiàn)，與未受感染的神經(jīng)細(xì)胞外泌體相比，在朊病毒感染的神經(jīng)細(xì)胞外泌體中，let-7b、let-7i、miR-128a、miR-21、miR-222、miR-29b、miR-342-3p及miR-424顯著上調(diào)，而miR-146a下調(diào)[17]。其中l(wèi)et-7b、miR-128a、miR-342-3p上調(diào)與Saba等和Montag等在瘙癢因子感染的小鼠腦組織和N2a細(xì)胞中的研究結(jié)果一致[13-14]，表明朊病毒感染的神經(jīng)細(xì)胞外泌體中循環(huán)miRNA的變化可部分反映瘙癢因子感染的腦組織中miRNA變化，而外泌體中出現(xiàn)的具有獨(dú)特變化特征的miRNA其意義需進(jìn)一步驗(yàn)證。在最新研究中，Boese等利用RML感染的小鼠腦組織海馬體和前腦中分離的神經(jīng)突觸分析了疾病發(fā)展過程中miRNA表達(dá)譜的變化，結(jié)果表明其miRNA如同瘙癢因子22A感染的小鼠腦組織中失調(diào)的miRNA[16]。

許多與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的蛋白曾被報(bào)道可由外泌體釋放[19]。在外泌體的早期研究中，通常認(rèn)為其可去除細(xì)胞中的無用蛋白及一些大分子[20]。近年研究還報(bào)道外泌體具有如下功能[18]：細(xì)胞間通訊；細(xì)胞間傳遞病原體，如受感染的朊蛋白；作為miRNA的攜帶者，可在細(xì)胞間傳遞miRNA。由于外泌體中也含有核酸，尤其是mRNA與miRNA，因此對(duì)外泌體中RNA進(jìn)行二代測(cè)序及后續(xù)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)可確定某些與疾病相關(guān)的潛在分子標(biāo)記[21]。例如，分析健康人血漿中外泌體發(fā)現(xiàn)，外泌體中miRNA含量豐富，與外周血單個(gè)核細(xì)胞中的miRNA種類有重合部分，也存在表達(dá)不一致的情況[22]。

通過對(duì)健康人血清及血細(xì)胞中的miRNA測(cè)序，Chen等發(fā)現(xiàn)血清中檢測(cè)到的大部分miRNA與血細(xì)胞中的miRNA類型相似，表明血液中的miRNA不僅可來自與疾病相關(guān)的外泌體，也可來自血液中的血細(xì)胞[23]。本課題組對(duì)sCJD患者及健康人全血中的miRNA進(jìn)行深度測(cè)序，比較分析后發(fā)現(xiàn)某些miRNA在sCJD患者中有顯著變化；經(jīng)體外定量反轉(zhuǎn)錄-PCR初步驗(yàn)證，這些miRNA包括hsa-miR-146a、hsa-miR-219a、hsa-let-7f-3p、hsa-miR-188-3p和hsa-miR-4646-5p。進(jìn)一步在大樣本sCJD患者及健康人中的驗(yàn)證工作正在進(jìn)行中，以期獲得可作為sCJD診斷的潛在分子標(biāo)記(未發(fā)表)。

2.1miR-146a

miR-146a在小鼠和人的腦細(xì)胞中廣泛存在，受NF-κB調(diào)控，在天然免疫應(yīng)答和炎癥信號(hào)通路中起重要調(diào)節(jié)作用。在同為神經(jīng)退行性疾病的阿爾茨海默病、sCJD及GSS綜合征患者的腦細(xì)胞中，均可檢測(cè)到miR-146a上調(diào)[24]。

miR-146a在巨噬細(xì)胞中有免疫調(diào)節(jié)作用。在朊病毒病中，朊病毒通過激活天然免疫通路來誘導(dǎo)大腦膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥應(yīng)答。免疫細(xì)胞表面受體蛋白Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)識(shí)別入侵抗原后，可通過銜接蛋白和信號(hào)分子傳導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)，這些信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞因子和前列腺素大量生成，一些在吞噬過程中所必需的有關(guān)活性氧中間產(chǎn)物生成的基因也隨之表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在感染RML毒株的CD1小鼠腦組織海馬體和皮層區(qū)中，TLR2在眾多受體中上調(diào)最為顯著，其他受體如Fc(FCGR1、FCGR2)及補(bǔ)體受體〔整合素αM(integrin αM，ITGAM)、ITGAX〕也有所上調(diào)；將淀粉樣蛋白注射至小鼠腦組織海馬體中，TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn)，缺失TLR4信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)基因小鼠C3H/HeJ對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)不敏感，且轉(zhuǎn)基因小鼠在感染朊病毒毒株139A和ME7后發(fā)病速率顯著加快。以上結(jié)果表明，促進(jìn)TLR信號(hào)通路可延緩朊病毒病感染時(shí)間，使疾病發(fā)展減慢，而TLR信號(hào)通路缺乏則使朊病毒病進(jìn)展加速[25]。

為更深入研究人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中miR-146a的功能，可在人星形膠質(zhì)細(xì)胞U373中分別檢測(cè)過表達(dá)或阻滯miR-146a時(shí)Toll樣/IL-1受體(Toll/interleukin 1 receptor，TIR)信號(hào)通路中的下游信號(hào)分子——腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子〔IL-1受體相關(guān)激酶1(interleukin 1 receptor-associated kinase 1，IRAK-1)、IRAK-2、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF-6〕的表達(dá)水平[26]。IRAK-1、IRAK-2和TRAF-6曾被認(rèn)為是miR-146a的靶基因，其中IRAK-1和TRAF-6后來被證實(shí)為miR-146a的直接靶基因[27]。在過表達(dá)miR-146a的人星形細(xì)胞U373中施以IL-1β刺激時(shí)，IRAK-1、IRAK-2和TRAF-6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及IRAK-1的蛋白水平均顯著降低；而在阻滯miR-146a表達(dá)的人星形細(xì)胞U373中施以IL-1β刺激時(shí)，IRAK-1 和IRAK-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平則受正調(diào)控。由此表明，miR-146a在炎癥應(yīng)答中起負(fù)調(diào)控作用。IL-6和環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)是IL-1β誘導(dǎo)產(chǎn)生的兩種重要炎癥分子。研究表明，在體外培養(yǎng)細(xì)胞中過表達(dá)或敲除miR-146a并施以IL-1β刺激時(shí)，過表達(dá)miR-146a的細(xì)胞中IL-6和COX-2 mRNA水平降低，而敲除miR-146a的細(xì)胞則相反。表明miR-146a可調(diào)控IL-6和COX-2表達(dá)，再次證明miR-146a可調(diào)控炎癥應(yīng)答[26]。miR-146a的抗炎作用還表現(xiàn)為可調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)的其他促炎因子，如IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等。

總之，在感染朊病毒的膠質(zhì)細(xì)胞中可檢測(cè)到miR-146a上調(diào)，從而使細(xì)胞內(nèi)自發(fā)免疫信號(hào)激活，同時(shí)引起一系列炎癥相關(guān)基因表達(dá)的改變。這些基因還包括在JAK-STAT及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號(hào)通路中起作用的蛋白(miR-146a上調(diào)時(shí)可引起STAT1和STAT2下調(diào))。有趣的是，作為miR-146a靶基因的TRAF-6被證實(shí)與MAPK/JNK信號(hào)通路有關(guān)[26]，而MAPK/JNK信號(hào)通路在以前研究中常被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，在包括朊病毒在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病中還未有報(bào)道。因此，miR-146a是否在受感染的小鼠腦細(xì)胞凋亡中起調(diào)控作用仍需深入研究。

2.2miR-342-3p

2009年，Montag等對(duì)獼猴腦組織中的miRNA表達(dá)做了芯片檢測(cè)，并與人腦細(xì)胞中已發(fā)表的miRNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)具有相似性。定量反轉(zhuǎn)錄-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，6只受瘋牛病病毒感染的獼猴腦細(xì)胞中hsa-miR-342-3p和hsa-miR-494顯著上調(diào)[15]。隨后在sCJD 1型和2型患者中也發(fā)現(xiàn)hsa-miR-342-3p上調(diào)，這也許是存在于朊病毒病中的普遍現(xiàn)象，因此hsa-miR-342-3p可作為診斷人和動(dòng)物朊病毒病的一種新的分子標(biāo)記。

對(duì)hsa-miR-342-3p和hsa-miR-494關(guān)于神經(jīng)退行性疾病的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，這些靶基因與蛋白聚集失調(diào)有關(guān)。經(jīng)軟件預(yù)測(cè)的miR-342-3p靶基因共有6個(gè)，分別為脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)蛋白7(ATXN7)、亨廷頓互作蛋白1(Huntingtin interacting protein 1，HIP1)、人類非典型蛋白KIAA2020、神經(jīng)干細(xì)胞RNA結(jié)合蛋白1(musashi 1，MSI1)、核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1，NRF1)及tau微管蛋白激酶2(tau-tubulin kinase 2，TTBK2)[15]。其中HIP1可與其耦合蛋白(Huntingtin interacting protein 1 protein interactor，HIPPI)形成HIP1-HIPPI復(fù)合物，使亨廷頓病患者紋狀神經(jīng)元發(fā)生凋亡。HIP1與野生型亨廷頓蛋白(Huntingtin，Htt)相互作用要比突變的Htt結(jié)合更緊密。在亨廷頓病患者中，Htt突變后導(dǎo)致HIP1游離，游離的HIP1可通過C端pDED結(jié)構(gòu)域與其耦合蛋白HIPPI結(jié)合形成復(fù)合物，從而招募半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(cysteinyl aspartate specific proteinase 8，caspase-8)，并激活caspase-8和下游蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，HIP1-HIPPI復(fù)合物也會(huì)移到細(xì)胞核中，與caspase-1、caspase-8和 caspase-10啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)其表達(dá)。隨后，高表達(dá)的caspase-8前體被招募至HIP1-HIPPI復(fù)合物中，使細(xì)胞凋亡率增加[28]。雖然caspase-1在亨廷頓病的發(fā)病過程中起作用，但其在細(xì)胞凋亡中所起的作用尚未知，可能高表達(dá)的caspase-8前體會(huì)激活caspase-1轉(zhuǎn)錄，在某些條件下也可增加細(xì)胞凋亡率。盡管HIP1在亨廷頓病患者紋狀神經(jīng)元凋亡中的作用已有研究，但是否如所預(yù)測(cè)的受miR-342-3p的調(diào)控尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。此外，由miR-342-3p調(diào)控HIP1引起的細(xì)胞凋亡在朊病毒病及其他神經(jīng)退行性疾病中是否發(fā)生仍需進(jìn)一步研究。

2.3miR-128

miR-128很早就被證實(shí)與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。Saba等在朊病毒毒株22A感染的小鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)15個(gè)上調(diào)miRNA，包括miR-128。低濃度硫酸鐵和硫酸鋁可促使人腦細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生。當(dāng)腦細(xì)胞受活性氧攻擊時(shí)，一系列包括炎癥應(yīng)答、細(xì)胞凋亡及腦細(xì)胞死亡在內(nèi)的致病基因?qū)@著上調(diào)[8]。在體外培養(yǎng)的含人腦神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的HN細(xì)胞中施加硫酸鐵與硫酸鋁，誘導(dǎo)表達(dá)的基因與阿爾茨海默病患者腦細(xì)胞中的上調(diào)基因相似。對(duì)施加硫酸鐵與硫酸鋁的HN細(xì)胞進(jìn)行miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)，可產(chǎn)生活性氧的金屬硫酸鹽同樣可上調(diào)特定的miRNA，如miR-9、miR-125b和miR-128，這些miRNA在阿爾茨海默病患者腦細(xì)胞中同樣上調(diào)。由此表明，硫酸鐵與硫酸鋁可通過活性氧介導(dǎo)的特定調(diào)控因子及致病基因上調(diào)來誘發(fā)基因毒性，從而使腦細(xì)胞逐步喪失功能或凋亡[8]。這些特定miRNA失調(diào)的可能原因是金屬離子誘導(dǎo)了活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致腦細(xì)胞內(nèi)氧化-還原平衡失調(diào)。當(dāng)抑制阿爾茨海默病患者腦細(xì)胞中的miR-128表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)β淀粉樣蛋白降解，這為闡明阿爾茨海默病患者腦細(xì)胞中β淀粉樣蛋白生產(chǎn)/清除這一平衡的分子機(jī)制提供了線索[11]。

通過對(duì)患有亨廷頓病的轉(zhuǎn)基因猴進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)11個(gè)與疾病相關(guān)的miRNA變化[9]。其中miR-128a在患有亨廷頓病的猴和人類腦組織中均下調(diào)，這與亨廷頓病小鼠模型中的研究結(jié)果一致。miR-128a在神經(jīng)細(xì)胞中含量多，也是人與小鼠腦細(xì)胞中表達(dá)最多的miRNA之一。許多研究認(rèn)為miR-128a在腫瘤抑制與細(xì)胞凋亡中有調(diào)控作用。有趣的是，細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)在亨廷頓病發(fā)病機(jī)制中一直有報(bào)道，這可能是miR-128a調(diào)控引起神經(jīng)退行性疾病的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。事實(shí)上，作為凋亡信號(hào)通路之一的caspase-3在患亨廷頓病的猴中已被發(fā)現(xiàn)[29-30]。miR-128a還可與轉(zhuǎn)錄因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子相結(jié)合來調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的分化和耐受性[31-32]。過表達(dá)miR-128a可抑制神經(jīng)營養(yǎng)因子3受體(neurotrophic tyrosine kinase，receptor，type 3，NTRK3)基因和轉(zhuǎn)錄因子E2F3A[33]。此外，miR-128a高表達(dá)可調(diào)控NMD信號(hào)途徑。NMD是一種RNA監(jiān)測(cè)通路，可使一系列RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降解，最終導(dǎo)致重要的神經(jīng)元相關(guān)蛋白表達(dá)升高[34]。總之，miR-128a可調(diào)控眾多的與亨廷頓病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的基因，通過對(duì)miR-128a在亨廷頓病致病機(jī)制中作用的研究，可為治療朊病毒病帶來一些新的線索。

2.4miR-125b

雖然在瘙癢因子感染的小鼠腦細(xì)胞中未檢測(cè)到miR-125b失調(diào)，但在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病中，miR-125b仍有重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默病患者腦組織中miR-125b上調(diào)，與tau蛋白磷酸化急劇升高相關(guān)[35]。通過對(duì)miR-125b的一些靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了體內(nèi)這種新的病理機(jī)制。將miR-125b注射進(jìn)小鼠腦組織海馬體中，可誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化，同時(shí)小鼠認(rèn)知能力受損害。

失調(diào)的miRNA可通過影響多種信號(hào)途徑來促進(jìn)阿爾茨海默病進(jìn)展。但上調(diào)的miR-125b在小鼠海馬體神經(jīng)細(xì)胞和齒狀回腦部區(qū)域誘導(dǎo)tau蛋白高度磷酸化還是首次發(fā)現(xiàn)。若阻止內(nèi)源miR-125b表達(dá)，則tau蛋白磷酸化基礎(chǔ)表達(dá)水平降低。因此，若在阿爾茨海默病患者或小鼠模型中降低miR-125b表達(dá)水平，同時(shí)使tau蛋白磷酸化水平降低，則對(duì)治療阿爾茨海默病有效。

miR-125b也調(diào)控tau蛋白的激酶和磷酸酶活性。許多激酶，包括cdk5及其激活劑p35、GSK-3b及MAPK信號(hào)途徑的激酶，在阿爾茨海默病患者大腦中活性均上調(diào)。當(dāng)過表達(dá)miR-125b時(shí)，可導(dǎo)致p35蛋白表達(dá)及MAPK信號(hào)途徑上調(diào)。miR-125b所引起的激酶表達(dá)與活性上升很可能與激酶去抑制相關(guān)，如胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)。DUSP6也稱MAPK磷酸酶3，是miR-125b的一種新的靶基因，可作為ERK1/2負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子使其去磷酸化而失活。因此，由miR-125b引起的DUSP6下調(diào)，導(dǎo)致后者對(duì)下游的負(fù)調(diào)控作用降低，ERK1/2活性升高。隨后的時(shí)效實(shí)驗(yàn)也證明，miR-125b可誘導(dǎo)ERK1/2及p35激酶表達(dá)，從而促進(jìn)海馬體神經(jīng)細(xì)胞中tau蛋白高度磷酸化。由于ERK1/2此前已被證實(shí)可誘導(dǎo)cdk5，那么miR-125b通過下調(diào)DUSP6來誘發(fā)的ERK1/2激活可能最終激發(fā)異常的cdk5/p35活化，導(dǎo)致病理性tau蛋白在多處位點(diǎn)磷酸化。

3miRNA在朊病毒病治療和診斷中的應(yīng)用展望

朊病毒病在神經(jīng)退行性疾病中由于具有感染性而顯得獨(dú)特。研究發(fā)現(xiàn)，至少有15個(gè)miRNA在朊病毒感染的小鼠腦細(xì)胞中失調(diào)。同時(shí)，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了與朊病毒病相關(guān)的眾多潛在靶基因，包括瘙癢因子感染的小鼠腦細(xì)胞中失調(diào)的119個(gè)基因及在轉(zhuǎn)錄中與miRNA相關(guān)的失調(diào)基因[14]。生物信息學(xué)與生化手段結(jié)合分析miRNA與mRNA關(guān)系，更深入揭示了miRNA表達(dá)與靶基因之間的關(guān)系，包括細(xì)胞內(nèi)蛋白降解途徑及細(xì)胞死亡、突觸功能和神經(jīng)形成相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。若對(duì)這些miRNA與mRNA關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，則會(huì)對(duì)治療朊病毒病提供新的分子基礎(chǔ)。在動(dòng)物模型和患者組織中觀察到變化的miRNA，有可能成為新型生物標(biāo)記，對(duì)朊病毒病的診斷提供新思路；同時(shí)，miRNA在其他神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病和亨廷頓病中的研究，不僅可揭示這些疾病的分子機(jī)制和治療靶點(diǎn)，也可為朊病毒病的研究提供思路。

近年來，有關(guān)循環(huán)miRNA的研究則為朊病毒病的檢測(cè)提供了一個(gè)新的方向。循環(huán)miRNA是一種存在于體液中的miRNA，具有穩(wěn)定性，在不同疾病患者血清中循環(huán)miRNA譜也不同。體液中無細(xì)胞循環(huán)miRNA在分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的微創(chuàng)篩選實(shí)驗(yàn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

在臨床治療方面，神經(jīng)退行性疾病被認(rèn)為在每個(gè)階段都有一個(gè)獨(dú)特的、具有蛋白特征性的、聚集的蛋白病變。在調(diào)控特定靶蛋白翻譯階段對(duì)特異的miRNA進(jìn)行干預(yù)可起潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。理論上，在神經(jīng)退行性疾病治療中有兩種方法[36]：一是增加miRNA表達(dá)水平以降低目標(biāo)毒蛋白翻譯水平，二是抑制對(duì)神經(jīng)保護(hù)相關(guān)基因負(fù)調(diào)控的miRNA表達(dá)。目前，化學(xué)修飾的反義寡聚核苷酸或miRNA多個(gè)靶基因表達(dá)序列均可被用作有功能的miRNA抑制劑，但如何使這些分子通過血-腦屏障進(jìn)入大腦中合適的細(xì)胞位置仍是技術(shù)難題。miRNA的脫靶效應(yīng)表明，在進(jìn)行臨床治療前對(duì)具體的miRNA仍需大量的特征描述和優(yōu)化措施。miRNA在治療包括朊病毒病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病中，雖尚處于起步階段，但很可能成為該領(lǐng)域的前沿問題之一。

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Current research progress on microRNAs in neurodegenerative diseases including prion diseases

WEI Jing,GAO Chen

National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention,State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,Beijing 102206,China

Abstract:Transmissible spongiform encephalopathies(TSEs),or prion diseases,are irreversible and fatal neurodegenerative disorders associated with the conformational conversion of cellular prion protein(PrPC),a normal cellular protein,into scrapie prion protein(PrPSc),a structural isoform that is infectious and with no effective treatment yet.MicroRNA can regulate cellular protein expression at transcriptional level and may play an critical role in the development process of central nervous system.Recent studies indicate that some specific microRNAs involved in the regulation of innate immune response and inflammation signaling pathways may also be implicated in prion diseases and provide some new insights into the treatment of prion diseases.This review highlights the progress on microRNAs in the occurrence of prion diseases and discusses the leading microRNAs in detail.

Key words:MicroRNA;Prion disease;Regulation mechanism;Biomarker

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81470099)，傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2012SKLID201)

通信作者：高晨

Corresponding author.GAO Chen,E-mail:chenchengao@hotmail.com

(收稿日期：2015-11-13)