張輝軍，王葆青，瞿介明

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肺科，上海 200032；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院呼吸科，上海 200025

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·論著·

內(nèi)毒素耐受對核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2信號通路的影響

張輝軍1，王葆青1，瞿介明2

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肺科，上海 200032；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院呼吸科，上海 200025

摘要：為研究內(nèi)毒素耐受對核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2，NOD2)信號通路的影響，將小鼠單核-巨噬細胞RAW264.7分為兩組，分別給予小劑量脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(100 ng/mL)或磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)預(yù)處理20 h，建立內(nèi)毒素耐受組和對照組。每組細胞分別給予大劑量LPS(1 000 ng/mL)或熱滅活煙曲霉孢子刺激，于刺激后0、2、6、12、24 h采用定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測細胞NOD2、受體相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2，RIP2)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)mRNA表達；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測細胞上清液中白細胞介素8(interleukin 8，IL-8)和TNF-α濃度。結(jié)果顯示，內(nèi)毒素耐受組無論是大劑量LPS還是熱滅活煙曲霉孢子刺激均不能增加NOD2、RIP2 和TNF-α mRNA表達及細胞上清液中IL-8、TNF-α濃度；而對照組大劑量LPS和熱滅活煙曲霉孢子刺激均可提高NOD2、RIP2 和TNF-α mRNA表達及細胞上清液中IL-8、TNF-α濃度，尤以刺激后12 h增加顯著，與刺激前(0 h)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，內(nèi)毒素耐受可能對NOD2信號通路有抑制作用。

關(guān)鍵詞：內(nèi)毒素耐受；脂多糖；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2；煙曲霉

內(nèi)毒素是革蘭陰性細菌細胞壁組分中的一種脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，能激發(fā)過度炎癥反應(yīng)，是臨床上全身炎癥反應(yīng)綜合征或感染性休克的常見原因[1]。內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance，ET)是指接受小劑量LPS刺激后形成的對后續(xù)大劑量LPS呈低反應(yīng)或無反應(yīng)的現(xiàn)象，其在動物模型和人體中均得到證實[2]。然而，到目前為止內(nèi)毒素耐受機制還未完全明確[3]。

先天性免疫是機體抵御病原微生物入侵的第一道屏障。動物的先天性免疫主要通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)來實現(xiàn)的。LPS是目前研究最多的PAMP，它是Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)的特異性配體。當(dāng)LPS與TLR4結(jié)合，TLR4被激活，繼而激活核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，引起大量促炎性細胞因子釋放。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2，NOD2)蛋白是一種胞質(zhì)內(nèi)PRR，又稱為凋亡加強結(jié)構(gòu)域蛋白15(caspase recruitment domain-containing protein 15，CARD15)，表達于中性粒細胞、樹突細胞、上皮細胞中，主要參與胞質(zhì)內(nèi)病原微生物的識別?，F(xiàn)已證實NOD2蛋白在抗細菌感染免疫中起重要作用。此外，本課題組以前的研究還發(fā)現(xiàn)NOD2與機體識別煙曲霉(Aspergillus，Af)的天然免疫反應(yīng)有關(guān)，熱滅活煙曲霉(heat-killed Aspergillus，HAf)孢子刺激可上調(diào)NOD2蛋白的表達，增加促炎性細胞因子的釋放[4-5]。NOD2識別的配體主要為胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)，這是一種存在于所有革蘭陰性和陽性細菌細胞壁內(nèi)具有生物活性的肽聚糖的基本結(jié)構(gòu)。NOD2識別細菌成分后誘導(dǎo)自身寡聚化，募集受體相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2，RIP2)，并與RIP2相互作用；然后 RIP2與NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)激酶相互作用，激活NF-κB，促進促炎性細胞因子的轉(zhuǎn)錄[6-7]。

PRR一直是免疫學(xué)研究的熱點，但到目前為止，關(guān)于NOD2在內(nèi)毒素耐受中的作用研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，NOD2配體可增加LPS誘導(dǎo)的細胞因子釋放，這種協(xié)同作用在內(nèi)毒素休克時也可觀察到[8]。Pauleau等發(fā)現(xiàn)2-/-小鼠內(nèi)毒素休克時的存活率增加[9]。此外，Kim等研究也發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的促炎性細胞因子釋放需NOD2的存在[10]。這些研究均提示，NOD2信號通路與LPS誘導(dǎo)的促炎性細胞因子釋放有關(guān)，因此推測NOD2信號通路有可能參與內(nèi)毒素耐受的過程。對此進行研究，將有助于闡明內(nèi)毒素耐受的機制，并為內(nèi)毒素耐受應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

小鼠單核-巨噬細胞系RAW264.7細胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。煙曲霉菌株由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌研究室惠贈。實時聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)相關(guān)試劑有TRIzolTMReagent(Invitrogen，USA)、SuperScript Ⅱ(Invitrogen，US)、Ex Taq?Hot-Start Version 2.0 for Real-time PCR Kit(TaKaRa公司)、SYBR?Green Ⅰ熒光定量PCR檢測試劑盒(TaKaRa公司)。白細胞介素8(interleukin 8，IL-8)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1煙曲霉孢子的收獲將煙曲霉菌株接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4 d。在超凈工作臺內(nèi)用生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面，收集分生孢子懸液，8層紗布過濾以去除菌絲；將孢子懸液轉(zhuǎn)入離心管中，3 000 r/min離心15 min，去除上清液，孢子重懸于生理鹽水中；用血球計數(shù)板計孢子數(shù)，調(diào)整孢子懸液密度為6.7×109/mL，煮沸1 h滅活；將收獲的熱滅活煙曲霉孢子懸液稀釋100倍，接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)基以檢測孢子活性。

1.2.2細胞培養(yǎng)及處理將RAW264.7細胞調(diào)整密度為5×105/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，4 h 后細胞完全貼壁。細胞貼壁后內(nèi)毒素耐受組加小劑量LPS，終濃度為100 ng/mL；對照組加等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)。20 h后棄上清液，用相應(yīng)的無血清培養(yǎng)液洗2遍，加新鮮培養(yǎng)液，2 h后給予大劑量LPS(1 000 ng/mL)或熱滅活煙曲霉孢子(細胞/孢子比為1∶10)刺激，每組于加入大劑量LPS或熱滅活煙曲霉孢子后0、2、6、12、24 h取樣本。該實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.3實時PCR檢測mRNA基因引物合成：通過文獻檢索獲得引物序列(表1)，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer Primer 5.0和PubMed BLAST驗證引物，反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳證實目的條帶大小符合，無明顯雜帶。

在相應(yīng)時間點取樣本，用冰PBS洗3遍，每孔加0.3 mL TRIzol反復(fù)吹打，使細胞變性，收集至1.5 mL無酶Eppendorf管，-70 ℃保存。提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用定量PCR分別檢測NOD2、RIP2、TNF-α mRNA及管家基因GAPDH mRNA，每次檢測時將外參標(biāo)準(zhǔn)品進行10倍梯度稀釋，取4個梯度(106、105、104、103copies/μL)作為擴增標(biāo)準(zhǔn)品，采用iCycle定量PCR專用分析軟件根據(jù)循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各測定孔的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定對應(yīng)的log基因拷貝數(shù)(log copy number)，自動列出最終定量結(jié)果，以其拷貝數(shù)與GAPDH的比值作為基因的最終相對表達量。

表1定量PCR引物序列

Tab.1Primers of quantitative PCR

GeneSense(5'-3')Antisense(5'-3')LengthNOD2GAAGTACATCCGCACCGAGGACACCATCCATGAGAAGACAG174bpRIP2ACGTCTGCAGCCTGGTATAGCAGGGCATCTAGCGACTGGTTAA101bpTNF-αGGTTTCGAAGTGGTGGTCTTGCCTGCCCCAATCCCTTTATT131bpGAPDHGGTATCGTGGAAGGACTCATGACATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC188bp

A:Expression of NOD2 mRNA after stimulation of LPS.B:Expression of RIP2 mRNA after stimulation of LPS.C:Expression of TNF-α mRNA after stimulation of LPS.D:Expression of NOD2 mRNA after stimulation of HAf.E:Expression of RIP2 mRNA after stimulation of HAf.F:Expression of TNF-α mRNA after stimulation of HAf.

圖1定量PCR檢測NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表達

Fig.1Expressions of NOD2,RIP2 and TNF-α mRNA detected by quantitative PCR

1.2.4ELISA檢測細胞上清液中IL-8和TNF-α濃度采用定量夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)統(tǒng)一檢測各時間點細胞培養(yǎng)上清液中IL-8和TNF-α濃度，具體步驟按說明書操作。

1.3統(tǒng)計分析

采用SPSS 12.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1NOD2、RIP2和TNF-α mRNA的表達

內(nèi)毒素耐受組細胞接受大劑量LPS或熱滅活煙曲霉孢子刺激后各時間點(2、6、12、24 h)NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表達與刺激前(0 h)比較無顯著增加；對照組細胞接受大劑量LPS或熱滅活煙曲霉孢子刺激后各時間點(2、6、12、24 h)NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表達增加，尤以12 h時最顯著，與刺激前(0 h)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.2細胞上清液中IL-8和TNF-α濃度

內(nèi)毒素耐受組細胞接受大劑量LPS或熱滅活煙曲霉孢子刺激后各時間點(2、6、12、24 h)與刺激前(0 h)比較，細胞上清液中IL-8和TNF-α濃度無顯著增加；對照組細胞接受大劑量LPS或熱滅活煙曲霉孢子刺激后各時間點(2、6、12、24 h)細胞上清液中IL-8和TNF-α濃度增加，尤以12 h時最顯著，與刺激前(0 h)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

A:Concentration of IL-8 after stimulation of LPS.B:Concentration of TNF-α after stimulation of LPS.C:Concentration of IL-8 after stimulation of HAf.D:Concentration of TNF-α after stimulation of HAf.

圖2ELISA檢測細胞上清液中IL-8和TNF-α濃度

Fig.2Concentrations of IL-8 and TNF-α detected by ELISA

3討論

天然免疫系統(tǒng)能對危險信號如細菌、腫瘤、組織損傷進行監(jiān)測并作出反應(yīng)。監(jiān)測到危險信號時，天然免疫系統(tǒng)可被激活，PRR在此過程中發(fā)揮重要作用。然而，過度炎癥反應(yīng)對機體是有害的，機體需一些重要機制對炎癥反應(yīng)進行精密調(diào)節(jié)，以防止發(fā)生感染性休克、自身免疫性疾病等不良后果。其中一個重要機制就是內(nèi)毒素耐受[2,11]。促炎性細胞因子TNF-α可能是評判內(nèi)毒素耐受最好的標(biāo)記。在LPS耐受體內(nèi)實驗中，第一次LPS刺激后TNF-α分泌迅速升高，給予LPS再次刺激后TNF-α分泌顯著減少[12]。本實驗選擇小鼠單核-巨噬細胞RAW264.7作為細胞模型，首先給予小劑量LPS預(yù)刺激，當(dāng)再給予大劑量LPS刺激時TNF-α和IL-8釋放無明顯增加；而對照組給予大劑量LPS刺激后TNF-α和IL-8釋放顯著增加，證明內(nèi)毒素耐受細胞模型建立成功。

有研究發(fā)現(xiàn)，LPS預(yù)刺激不僅可對后續(xù)大劑量LPS刺激起保護作用，還可減少其他炎癥刺激所引起的促炎性細胞因子釋放，如革蘭陽性細菌感染[13]。而革蘭陽性細菌細胞壁成分MDP是NOD2的特異性配體，提示LPS預(yù)處理可能對NOD2的功能產(chǎn)生影響?，F(xiàn)已證實，NOD2信號通路不僅在細菌感染免疫中發(fā)揮重要作用，在抗煙曲霉感染免疫中也發(fā)揮重要作用，Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉刺激可增加NOD2和RIP2的表達；通過RNA干擾減少NOD2基因表達，則可減少煙曲霉誘導(dǎo)的促炎性細胞因子產(chǎn)生。Wu等[14]的研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗TLR2抗體預(yù)處理阻斷TLR2，可減少MDP誘導(dǎo)的促炎性細胞因子釋放，提示NOD2信號通路與TLR2信號通路存在某種密切聯(lián)系。LPS是TLR4的特異性配體，雖然科學(xué)家們對TLR4信號通路和NOD2信號通路分別進行了深入研究，但關(guān)于兩者相互聯(lián)系的研究較少。Selvanantham等研究發(fā)現(xiàn)，細菌感染時NOD2蛋白能協(xié)同TLR4增加IL-2的產(chǎn)生并促進恒定自然殺傷T細胞(invariant nature killer T cell，iNKT細胞)的激活[15]。在過度表達NOD2的sw620細胞中，LPS誘導(dǎo)的IL-8產(chǎn)生明顯增加[16]。這些研究結(jié)果均提示，NOD2信號通路與TLR4信號通路在機體抗感染免疫反應(yīng)中密切相關(guān)，但具體機制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，對于小劑量LPS預(yù)處理的RAW264.7細胞，無論是用大劑量LPS還是熱滅活煙曲霉孢子刺激，均未能上調(diào)NOD2、RIP2基因的表達，同時TNF-α、IL-8的分泌受到抑制；而對照組細胞大劑量LPS和熱滅活煙曲霉孢子刺激均顯著上調(diào)NOD2、RIP2基因的表達，顯著增加TNF-α、IL-8的分泌，提示LPS預(yù)處理對NOD2信號通路產(chǎn)生抑制作用，從而減少了促炎性細胞因子釋放。

綜上所述，內(nèi)毒素耐受可抑制NOD2信號通路，但具體機制和意義有待進一步研究。

參考文獻

[1]Castegren M,Skorup P,Lipcsey M,Larsson A,Sj?lin J.Endotoxin tolerance variation over 24 h during porcine endotoxemia:association with changes in circulation and organ dysfunction[J].PLoS One,2013,8(1):e53221.

[2]López-Collazo E,del Fresno C.Pathophysiology of endotoxin tolerance:mechanisms and clinical consequences[J].Crit Care,2013,17(6):242-253.

[3]Bessede A,Gargaro M,Pallotta MT,Matino D,Servillo G,Brunacci C,Bicciato S,Mazza EM,Macchiarulo A,Vacca C,Iannitti R,Tissi L,Volpi C,Belladonna ML,Orabona C,Bianchi R,Lanz TV,Platten M,Della Fazia MA,Piobbico D,Zelante T,Funakoshi H,Nakamura T,Gilot D,Denison MS,Guillemin GJ,Duhadaway JB,Prendergast GC,Metz R,Geffard M,Boon L,Pirro M,Iorio A,Veyret B,Romani L,Grohmann U,Fallarino F,Puccetti P.Aryl hydrocarbon receptor control of a disease tolerance defence pathway[J].Nature,2014,511(758):184-190.

[4]Zhang HJ,Qu JM,Shao CZ,Zhang J,He LX,Yuan ZH.Aspergillus fumigatus conidia upregulates NOD2 protein expression both in vitro and in vivo[J].Acta Pharmacol Sin,2008,29(10):1202-1208.

[5]Li ZZ,Tao LL,Zhang J,Zhang HJ,Qu JM.Role of NOD2 in regulating the immune response to Aspergillus fumigatus[J].Inflamm Res,2012,61(6):643-648.

[6]Antosz H,Osiak M.NOD1 and NOD2 receptors:integral members of the innate and adaptive immunity system[J].Acta Biochim Pol,2013,60(3):351-360.

[7]Boyle JP,Parkhouse R,Monie TP.Insights into the molecular basis of the NOD2 signalling pathway[J].Open Biol,2014,4(12):140178-140190.

[8]Farzi A,Reichmann F,Meinitzer A,Mayerhofer R,Jain P,Hassan AM,Fr?hlich EE,Wagner K,Painsipp E,Rinner B,Holzer P.Synergistic effects of NOD1 or NOD2 and TLR4 activation on mouse sickness behavior in relation to immune and brain activity markers[J].Brain Behav Immun,2015,44:106-120.

[9]Pauleau AL,Murray PJ.Role of NOD2 in the response of macrophages to Toll-like receptor agonists[J].Mol Cell Biol,2003,23(21):7531-7539.

[10]Kim H,Zhao QJ,Zheng H,Li X,Zhang T,Ma XJ.A novel crosstalk between TLR4- and NOD2-mediated signaling in the regulation of intestinal inflammation[J].Sci Rep,2015,5(5):12018-12034.

[11]Lee KH,Biswas A,Liu YJ,Kobayashi KS.Proteasomal degradation of NOD2 protein mediates tolerance to bacterial cell wall components[J].J Biol Chem,2012,287(47):39800-39811.

[12]Cavaillon JM,Adib-Conquy M.Bench-to-bedside review:endotoxin tolerance as a model of leukocyte reprogramming in sepsis[J].Crit Care,2006,10(5):233.

[13]Bohannon JK,Hernandez A,Enkhbaatar P,Adams WL,Sherwood ER.The immunobiology of Toll-like receptor 4 agonists:from endotoxin tolerance to immunoadjuvants[J].Shock,2013,40(6):451-462.

[14]Wu J,Zhang Y,Xin Z,Wu X.The crosstalk between TLR2 and NOD2 in Aspergillus fumigatus keratitis[J].Mol Immunol,2015,64(2):235-243.

[15]Selvanantham T,Escalante NK,Cruz Tleugabulova M,Fiévé S,Girardin SE,Philpott DJ,Mallevaey T.NOD1 and NOD2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection[J].J Immunol,2013,191(11):5646-5654.

[16]Rosenstiel P,Fantini M,Br?utigam K,Kühbacher T,Waetzig GH,Seegert D,Schreiber S.TNF-alpha and IFN-gamma regulate the expression of the NOD2(CARD15)gene in human intestinal epithelial cells[J].Gastroenterology,2003,124(4):1001-1009.

Effect of endotoxin tolerance on nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 signaling pathway

ZHANG Huijun1,WANG Baoqing1,QU Jieming2

1.Department of Pulmonary Medicine,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China;2.Department of Pulmonary Medicine,Ruijin Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200025,China

Abstract:To investigate the potential effect of endotoxin tolerance on nucleotide-binding oligomerization domain containing 2(NOD2)signaling pathway,murine macrophage RAW264.7 cells were pretreated with lipopolysaccharide(LPS,100 ng/mL)or phosphate buffered saline(PBS)for 20 h to establish endotoxin tolerance group and control group respectively.Both groups were subjected to the treatment with LPS(1 000 ng/mL)or heat-killed Aspergillus(HAf).The mRNA levels of NOD2,receptor-interacting protein 2(RIP2)and tumor necrosis factor α(TNF-α)were measured at 0,2,6,12,24 h after stimulation by real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR).The concentrations of secreted TNF-α and interleukin 8(IL-8)were also quantified by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The collective results showed that neither LPS nor HAf had any significant effect on NOD2,RIP2,and TNF-α transcription or TNF-α and IL-8 secretion in the endotoxin tolerance group.On the contrary,a clear up-regulation was detected in the control group upon either LPS or HAf treatment,concomitant with a peak at 12 h after stimulation.These data indicate that the NOD2 signaling pathway might be suppressed under endotoxin tolerance conditions.

Key words:Endotoxin tolerance;Lipopolysaccharide;Nucleotide-binding oligomerization domain containing 2；Aspergillus

基金項目：教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點-新教師基金資助(20090071120029)

通信作者：瞿介明

Corresponding author.QU Jieming,E-mail:jmqu0906@163.com

(收稿日期：2015-11-18)