王藝紅，郭慶龍，周鳳竹，茍宗超，王洪海，張雪蓮

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

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·論著·

利用表型芯片系統(tǒng)高通量分析H37Ra與H37Rv差異表型

王藝紅，郭慶龍，周鳳竹，茍宗超，王洪海，張雪蓮

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

摘要：H37Rv是結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)有毒株，H37Ra是從H37Rv獲得的穩(wěn)定減毒株，但目前H37Ra毒力減弱原因尚不完全清楚。本研究利用表型芯片系統(tǒng)，高通量分析H37Ra生長表型，并與H37Rv表型比較，篩選兩菌株表型差異，分析與H37Ra毒力減弱可能的相關(guān)表型及分子機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與H37Rv相比，H37Ra耐酸及耐滲透壓能力顯著下降，且不能利用丁二酸單甲酯和吐溫40作為碳源。結(jié)核分枝桿菌耐酸能力直接影響其在吞噬體中的生存和代謝，耐高滲能力影響其必需營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，代謝途徑的改變影響其在宿主內(nèi)的能量攝取，三者改變均可能與H37Ra毒力減弱相關(guān)。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；表型；毒力

結(jié)核病是長期危害人類健康的主要傳染病之一。2015年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)數(shù)據(jù)表明，2014年全球約150萬人死于結(jié)核病[1]。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria，M.)是引起結(jié)核病的重要病原菌，其中H37Rv為結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)有毒株，并于1998年完成全基因組測(cè)序，標(biāo)志著對(duì)結(jié)核分枝桿菌的研究進(jìn)入后基因組時(shí)代[2]。

H37Ra是1935年由H37Rv減毒獲得的穩(wěn)定菌株，兩者形態(tài)特征存在重要差異。H37Ra表面隆起[3]，失去索狀結(jié)構(gòu)[4]，且不與中性紅染料結(jié)合[5]。1954年，Mackaness等[6]研究發(fā)現(xiàn)H37Ra在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存能力下降；1964年，Larson等[7]發(fā)現(xiàn)H37Ra在被感染小鼠中毒力喪失；1973年，Alsaadi等[8]提出H37Ra在被感染豚鼠中不具備毒力，但其毒力減弱的原因并不清楚。長期以來，多個(gè)團(tuán)隊(duì)對(duì)H37Ra毒力減弱可能的分子機(jī)制進(jìn)行了研究[9-12]。1999年，Brosch等[13]發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列IS6110能催化介導(dǎo)H37Rv基因組片段缺失和突變。2008年，Zheng等[14]確定了H37Ra ATCC 25177的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)H37Ra基因組存在53個(gè)位點(diǎn)的插入和21個(gè)位點(diǎn)的缺失，這些突變直接影響結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、生長過程及初級(jí)代謝等各項(xiàng)表型，可能為其毒力減弱的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，進(jìn)行大規(guī)模的表型分析一直是較大的難題。2001年，Bochner等[15]以大腸埃希菌( Escherichia，E.)為模式細(xì)胞，提出并發(fā)展了表型芯片(Phenotype MicroArray，PM)系統(tǒng)。2008年，Viti等[16]對(duì)PM系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，成功將其應(yīng)用于牛分枝桿菌(Mycobacterium，M.)菌株表型的分析。2013年，Khatri等[17]利用PM系統(tǒng)對(duì)H37Rv、牛分枝桿菌及結(jié)核分枝桿菌北京株的差異表型進(jìn)行了研究。至今，PM系統(tǒng)已被用于1 000多種細(xì)胞表型的相關(guān)研究。

本研究利用PM系統(tǒng)，高通量獲得減毒株H37Ra的代謝表型，與H37Rv比較，探討H37Ra毒力減弱株的代謝表型特點(diǎn)，并分析遺傳學(xué)差異，以獲得可能與結(jié)核分枝桿菌毒力相關(guān)的信息。

1材料與方法

1.1材料

結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。主要試劑有IF-0a GN/GP Base(1.2×)(Biolog)、Biolog Redox Dye Mix G(100×)(Biolog)、Middlebrook 7H9 Broth(Difco)、Middlebrook 7H10 Agar(Difco)，其他化學(xué)試劑均為國家分析純(analytical reagent，AR)產(chǎn)品。PM板有PM1、PM2A、PM3B、PM5、PM9、PM10、PM11、PM12，購自Biolog公司。

1.2方法

1.2.1H37Ra菌懸液的制備為減少表型芯片板實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)背景，對(duì)H37Ra菌懸液的制備進(jìn)行改進(jìn)。具體操作：H37Ra于7H10-10% OADC(/)固體板中培養(yǎng)3周，用接種環(huán)刮下菌苔，置于7H9-0.025%四丁酚醛，以4 mm玻璃珠振蕩破碎菌團(tuán)，接種于7H9-0.05%吐溫80-10% OADC(//)，37 ℃靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，600 nm處光密度(optical density，)為0.40～0.60。離心收集菌體，用pH 6.8的0.025%四丁酚醛-20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗兩遍，再用0.025%四丁酚醛-20 mmol/L PBS重懸菌體。

1.2.2表型芯片板對(duì)H37Ra表型的高通量檢測(cè)表型芯片板高通量檢測(cè)方法由Biolog公司提供[16,18]。具體方法：根據(jù)1.2.1制備菌懸液，25 ℃培養(yǎng)24 h，離心去除PBS，以IF-0a GN/GP Base重懸菌體，調(diào)整菌懸液600=0.60，于PM板各孔加入100 μL混合培養(yǎng)液，每孔菌懸液600=0.044，密封。37 ℃避光培養(yǎng)168 h，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定各孔600。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩個(gè)平行組。

1.2.3H37Ra利用碳源的驗(yàn)證分析根據(jù)1.2.1制備菌懸液，調(diào)整菌懸液600=0.60，接種于分別以0.5%葡萄糖、0.5%甘油、10 mmol/L乙酸鹽、10 mmol/丙酸鹽、0.1%吐溫80為單一碳源的7H9培養(yǎng)基中，初始菌懸液600=0.01。37 ℃靜置培養(yǎng)，每96 h測(cè)定菌懸液的600值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三個(gè)平行組。

1.2.4H37Ra耐受pH范圍的驗(yàn)證分析根據(jù)1.2.1制備菌懸液，調(diào)整菌懸液600=0.60，將制備好的菌懸液分別接種于pH 4.5、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0及常規(guī)pH的7H9-0.05%吐溫80-10%OADC(//)培養(yǎng)基中，初始菌懸液630=0.044。37 ℃靜置培養(yǎng)，以Dye Mix G為指示劑，每48 h測(cè)定菌液的630值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三個(gè)平行組。

2結(jié)果

2.1PM系統(tǒng)對(duì)H37Ra表型的高通量檢測(cè)

PM系統(tǒng)由20塊(PM1～PM20)預(yù)裝有不同底物的微孔板組成，可為H37Ra提供不同的生長環(huán)境。在H37Ra培養(yǎng)過程中，細(xì)胞呼吸產(chǎn)生的NADH能導(dǎo)致指示劑Dye Mix G中無色的四唑染料發(fā)生不可逆衰減，轉(zhuǎn)化為紫色的甲瓚，甲瓚于630 nm波長處存在特異性吸收。細(xì)胞的呼吸作用越強(qiáng)，產(chǎn)生的NADH越多，四唑染料減少量越多，培養(yǎng)混合物于630 nm波長處的特異性吸收越強(qiáng)。通過分光光度計(jì)檢測(cè)630值，能快速有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞在PM系統(tǒng)不同環(huán)境中新陳代謝的能力[19-20]。

其中，PM1和PM2A各提供一個(gè)陰性對(duì)照孔(A1)及95種不同的單一碳源，可用于分析H37Ra對(duì)不同碳源的攝取和利用能力；PM3B提供一個(gè)陰性對(duì)照孔(A1)和95種不同的氮源組合，可用于分析H37Ra對(duì)不同氮源的攝取和利用能力；PM5用于H37Ra對(duì)不同營養(yǎng)補(bǔ)充物攝取和利用的分析；PM9可用于細(xì)胞耐受滲透壓環(huán)境的分析；PM10可用于細(xì)胞耐受pH環(huán)境的分析；PM11、PM12可用于細(xì)胞耐受抗生素和脅迫環(huán)境的分析。本研究共分析了H37Ra在64種不同環(huán)境中的細(xì)胞表型。

H37Ra于PM系統(tǒng)中培養(yǎng)168 h后，測(cè)定764個(gè)微孔中培養(yǎng)混合物的630值。結(jié)果表明，在碳源板PM1和 PM2中，H37Ra能有效利用多種底物作為碳源，其中利用甘油(PM1-B3)、吐溫80(PM1-E5)、-葡萄糖(PM1-C9)、丙酮酸(PM1-H8)、乙酸(PM1-C8)、乳酸(PM1-B9)、海藻糖(PM1-A10)、-谷氨酸(PM1-B12)和丁酸(PM2A-D12)的效率較高；在氮源板PM3中，能有效利用谷氨酸(PM3B-A12)、丙氨酸(PM3B-A7)、天冬酰胺(PM3B-A9)、谷氨酰胺(PM3B-B1)和胞嘧啶核苷(PM3B-F4)作為氮源；在滲透壓板PM9中，能耐受1% NaCl和2% NaCl的滲透壓，在3% NaCl的滲透壓環(huán)境中呼吸微弱，在4% NaCl的滲透壓環(huán)境中不能進(jìn)行正常代謝；同時(shí)，H37Ra于酸性板PM10中不能耐受pH 3.5～5.5的環(huán)境，呼吸極其微弱，在pH 6.0～7.0環(huán)境中代謝能力增強(qiáng)(圖1)。

2.2H37Ra利用碳源的驗(yàn)證結(jié)果

為進(jìn)一步分析H37Ra利用不同碳源的生長曲線，同時(shí)對(duì)PM系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，配制包括葡萄糖、甘油、乙酸鹽、丙酸鹽、吐溫80在內(nèi)的單一碳源培養(yǎng)基。利用PM系統(tǒng)高通量檢測(cè)H37Ra表型，芯片板通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞呼吸產(chǎn)生的NADH量變化，來評(píng)價(jià)細(xì)胞在PM系統(tǒng)不同環(huán)境中新陳代謝的能力。該系統(tǒng)靈敏、快速，可設(shè)置較高初始菌液密度[16,18]，以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期僅7 d。本研究中，為全面持續(xù)觀察H37Ra不同生長階段利用不同單一碳源生長繁殖的能力，獲得完整的生長曲線，采取較低的H37Ra接菌量，不同單一碳源培養(yǎng)基的初始菌懸液600=0.01[21]。

圖1PM系統(tǒng)中pH及NaCl濃度對(duì)H37Ra代謝的影響

Fig.1Effects of pH and NaCl concentration on relative dye reduction in H37Ra

結(jié)果表明，H37Ra能充分利用葡萄糖和甘油作為碳源，生長情況與完全培養(yǎng)基幾乎一致，培養(yǎng)24 d，H37Ra持續(xù)生長且生長速度較快。H37Ra能有效利用乙酸鹽作為碳源，培養(yǎng)前16 d，H37Ra持續(xù)生長且生長速度較快；培養(yǎng)第16～24天，生長趨于平緩。H37Ra利用丙酸及吐溫80作為碳源的能力較弱(圖2)。在液體培養(yǎng)條件下，H37Ra在不同單一碳源中的生長能力：甘油>葡萄糖>乙酸鹽>丙酸鹽或吐溫80。在PM系統(tǒng)中，H37Ra利用碳源代謝的能力：甘油>葡萄糖>乙酸鹽>吐溫80>丙酸鹽。兩者對(duì)吐溫80和丙酸鹽的利用結(jié)果存在細(xì)微差異，可能與兩種檢測(cè)方法中碳源濃度設(shè)置存在差異有關(guān)。同時(shí)，PM系統(tǒng)通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞新陳代謝能力分析細(xì)胞對(duì)底物的利用能力，整個(gè)系統(tǒng)更敏感，能有效區(qū)分吐溫80與丙酸利用效率的細(xì)微差異?？傮w而言，生長曲線測(cè)定結(jié)果與PM系統(tǒng)結(jié)果一致，兩者能相互補(bǔ)充驗(yàn)證。

圖2H37Ra在不同單一碳源中的生長情況

Fig.2Growth curve of H37Ra in different carbon substrates

2.3H37Ra的pH耐受范圍

配制不同pH范圍的完全培養(yǎng)基，進(jìn)一步分析H37Ra可耐受的pH范圍，同時(shí)對(duì)PM系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明(圖3)，以H37Ra在完全培養(yǎng)基(pH 6.9)中的呼吸情況為陽性對(duì)照，H37Ra在pH 7.0的培養(yǎng)基中具有較強(qiáng)的呼吸代謝，在pH 6.0的培養(yǎng)基中呼吸代謝開始減弱，在pH 5.0及pH 4.5的培養(yǎng)基中不能實(shí)現(xiàn)正常呼吸代謝功能。在PM系統(tǒng)研究中，H37Ra不能耐受pH 3.5～5.5的環(huán)境，兩者結(jié)果一致，能相互補(bǔ)充驗(yàn)證。

圖3H37Ra在不同pH條件下的呼吸代謝情況

Fig.3Metabolism of H37Ra at different pH values

3討論

H37Rv是結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)有毒株，H37Ra是從H37Rv獲得的穩(wěn)定減毒株。長期以來，多個(gè)團(tuán)隊(duì)致力于通過差異基因組學(xué)的分析方法，尋找H37Ra減毒的可能機(jī)制，但目前尚不完全清楚。2008年，Zheng等[14]提出H37Ra基因組中的突變直接影響結(jié)核分枝桿菌的表型特征、生長及初級(jí)代謝，可能為H37Ra毒力減弱的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，為減毒機(jī)制研究提供了新的思路。

本研究利用PM系統(tǒng)高通量分析H37Ra表型，篩選H37Ra在碳源利用、氮源利用、耐受滲透壓及耐受pH等方面的主要表型，并比較H37Rv與H37Ra的差異表型，探究H37Ra毒力減弱的可能機(jī)制，從而獲得H37Rv中可能與毒力相關(guān)的基因。

本研究表明，H37Ra于PM系統(tǒng)中不能耐受pH 3.5～5.5的環(huán)境(圖1)。2013年，Khatri等[17]利用PM系統(tǒng)對(duì)H37Rv的表型進(jìn)行高通量分析，發(fā)現(xiàn)H37Rv在PM系統(tǒng)中能耐受pH 5.5的酸性環(huán)境。Portaels等[22]及Chapman等[23]也對(duì)H37Rv耐受pH范圍進(jìn)行了研究，表明H37Rv能耐受pH 5.0～8.4的環(huán)境。兩種菌株相比，H37Ra較37Rv 耐酸能力顯著下降。

結(jié)核分枝桿菌感染宿主后，通過FcR和CR3等表面受體識(shí)別，經(jīng)胞吞作用進(jìn)入吞噬細(xì)胞，聚集在吞噬體中，吞噬體內(nèi)環(huán)境被激活，逐漸酸化，pH從6.2降至5.5[24]。吞噬體內(nèi)的酸性環(huán)境極不利于結(jié)核分枝桿菌生存，直接影響其生長代謝。為了更好地適應(yīng)環(huán)境，結(jié)核分枝桿菌H37Rv表現(xiàn)出一定程度的耐酸能力，從而具有更強(qiáng)的毒力；而H37Ra的耐酸能力下降，這可能是其毒力下降的原因之一。在人巨噬細(xì)胞模型中，H37Ra與H37Rv的存活率、生長速度及對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響均存在顯著差異[25-26]，且H37Ra干擾吞噬體內(nèi)環(huán)境的能力受損[27]。Abramovitch等[28]研究發(fā)現(xiàn)，雙組分調(diào)控系統(tǒng)PhoPR能感受低pH信號(hào)，并誘導(dǎo)aprABC表達(dá)，幫助細(xì)菌適應(yīng)酸性環(huán)境。同時(shí)，在酸性刺激下，受PhoP調(diào)控的基因lipF、2、1、Rv2390c、whiB6等表達(dá)普遍上調(diào)[29]。H37Ra與H37Rv差異基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，雙組分調(diào)控系統(tǒng)PhoPR存在基因突變[14]，同時(shí)有研究確證phoPR是結(jié)核分枝桿菌的重要毒力基因[30]。因此，參與酸性調(diào)節(jié)和耐受的相關(guān)基因可能是與結(jié)核分枝桿菌毒力有關(guān)的基因。

在PM系統(tǒng)中，本研究還發(fā)現(xiàn)H37Ra失去了對(duì)高滲透壓的耐受能力。H37Ra在3% NaCl的滲透壓環(huán)境中呼吸極其微弱(圖1)，而Khatri等[17]研究表明H37Rv在PM系統(tǒng)中能耐受4% NaCl的高滲透壓環(huán)境。細(xì)菌在感染宿主過程中需應(yīng)對(duì)宿主內(nèi)環(huán)境中變化的高滲環(huán)境，因此滲透壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)不僅與營養(yǎng)物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，還可能與結(jié)核分枝桿菌毒力密切相關(guān)，對(duì)能否有效侵染宿主至關(guān)重要[31]。比較H37Rv與H37Ra基因組，有一個(gè)膜蛋白基因Rv0037存在突變，而Rv0037為主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)蛋白，與調(diào)節(jié)細(xì)胞化學(xué)滲透壓響應(yīng)、營養(yǎng)物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)[14]。因此，推測(cè)Rv0037突變可能與H37Ra耐滲透壓能力下降有關(guān)，可能是結(jié)核分枝桿菌的毒力相關(guān)基因。

Khatri等[17]利用PM系統(tǒng)對(duì)H37Rv的碳源利用能力進(jìn)行了高通量分析。此后，Lofthouse等[32]設(shè)計(jì)包括38種不同單一碳源和23種不同單一氮源培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)，對(duì)Khatri的研究結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。本研究比較了PM系統(tǒng)中H37Rv與H37Ra能高效利用的碳源或氮源種類是否存在差異，結(jié)果表明兩種菌株在大部分碳源或氮源的利用上沒有明顯差異；但與H37Rv相比，H37Ra不能有效利用吐溫40和丁二酸單甲酯作為碳源(表1)。

表1H37Rv與H37Ra菌株高效利用碳源或氮源的比較

Tab.1Differences in utilization of carbon and nitrogen substrates between H37Rv and H37Ra

SubstrateH37Rv-Biolog*H37Rv-Culture**H37Ra-Biolog***GlycerolYYYD-GlucoseYYYAceticacidYYYPyruvicacidYYYButyricacidYYYD-TrehaloseYYYL-LacticacidYNYL-GlutamicacidYYYTween40YNCTween80YYYMono-methylsuccinateYNCL-AlanineYYYL-AsparagineYNYD-SerineYCC

*:data from Khatri’research;**:data from Lofthouse’research;***:data from the present research;Y:utilization of carbon/nitrogen source;C:no utilization of carbon/nitrogen source;N:no data.

正常條件下，結(jié)核分枝桿菌通過三羧酸循環(huán)代謝糖類獲取能量；被巨噬細(xì)胞吞噬后，其在機(jī)體內(nèi)主要利用宿主的脂類而不是糖類作為碳源和能量來源[33]。因此，部分脂類代謝缺陷可能是H37Ra毒力喪失的原因之一。丁二酸單甲酯和吐溫40均為脂類碳源，但結(jié)核分枝桿菌中還沒有與丁二酸單甲酯和吐溫40代謝直接相關(guān)基因的報(bào)道，仍需深入研究才能確證丁二酸單甲酯和吐溫40代謝相關(guān)基因或途徑與H37Ra毒力缺失的相關(guān)性。

PM系統(tǒng)于2001年由Bochner等[15]提出，至今已被用于包括結(jié)核分枝桿菌等1 000多種細(xì)胞表型的研究，但目前國內(nèi)外尚無PM系統(tǒng)用于H37Ra表型研究并與H37Rv比較的相關(guān)數(shù)據(jù)。由于結(jié)核分枝桿菌易形成菌塊，菌懸液不易分散，利用PM系統(tǒng)進(jìn)行研究往往易形成較高的數(shù)據(jù)背景，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究通過改進(jìn)菌懸液制備方法，減少了PM系統(tǒng)研究中的數(shù)據(jù)背景，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確率。通過設(shè)計(jì)碳源利用分析及耐受pH范圍的實(shí)驗(yàn)，對(duì)PM系統(tǒng)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，表明兩者相一致。研究表明，PM系統(tǒng)為一種快速、有效的表型分析方法，不僅為分枝桿菌高通量表型篩選研究提供了方便，也為臨床分枝桿菌的分型鑒定提供了一種可靠手段。

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High throughput analysis of phenotypic differences between H37Ra and H37Rv using Biolog Phenotype MicroArray

WANG Yihong，GUO Qinglong，ZHOU Fengzhu，GOU Zongchao，WANG Honghai，ZHANG Xuelian

State Key Laboratory of Genetic Engineering,School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200433,China

Abstract:Tuberculosis,caused by Mycobacterium(M.)H37Rv,is a human disease of major importance worldwide.The avirulent M. H37Ra which is used commonly in the laboratory was derived from H37Rv in 1935,but the mechanism of its virulence attenuation remains unclear.In order to explore its possible mechanism of virulence attenuation,screening for different phenotypes is important.To make a rapid and high throughput phenotypic analysis between H37Ra and H37Rv,as well as catch the different phenotypes related to virulence attenuation,the Biolog Phenotype MicroArray analysis was conducted.In this research,the phenotypes of H37Ra were determined and compared with its virulent counterpart H37Rv.Of 765 substrates surveyed,H37Ra phenotypes were highly similar to that of H37Rv,but there were several differences in carbon utilization,osmosis and pH arrays.These arrays suggested that H37Ra could not utilize mono-methyl succinate and Tween 40 as carbon source in contrast to H37Rv.More interestingly,the differences between H37Ra and H37Rv in the tolerance abilities of hyperosmosis and acid were found,and H37Ra could not tolerate circumstance of pH 5.5 or 3% NaCl,but H37Rv could.These metabolic differences may have a disparate impact on the survival of M. in the hosts and be closely related to the virulence attenuation of H37Ra.

Key words:Mycobacterium；Phenotype；Virulence

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81261120558)，上海市科技支撐項(xiàng)目(13431900203、15431900200)

通信作者：張雪蓮

Corresponding author.ZHANG Xuelian,E-mail:xuelianzhang@fudan.edu.cn

(收稿日期：2016-02-24)