張小龍，李琦涵

中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118

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·綜述·

腸道病毒71型與天然免疫系統(tǒng)相互作用的研究進展

張小龍，李琦涵

中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118

摘要：腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)為小RNA病毒科腸道病毒屬成員，是引起手足口病的主要病原體之一。EV71流行廣泛，其感染可引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并造成重癥手足口病，給公共衛(wèi)生安全帶來極大挑戰(zhàn)。EV71的致病機制與病毒和宿主天然免疫系統(tǒng)的相互作用關系密切，涉及病毒逃逸干擾素反應、病毒抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號通路及病毒與天然免疫細胞相互作用等多個環(huán)節(jié)。本文就近年來EV71與宿主天然免疫系統(tǒng)相互作用的研究進展進行綜述。

關鍵詞：腸道病毒71型；天然免疫；手足口病

腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是引發(fā)手足口病的主要病原體之一，主要感染5歲以下嬰幼兒。其感染常引起發(fā)熱和手、足、口等部位潰瘍及皰疹，某些情況下還可侵犯呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)而引起無菌性腦膜炎、肺水腫、心肌炎、心肺衰竭等癥狀，是引發(fā)重癥手足口病的最主要病原體[1-2]。近年來，我國大陸地區(qū)EV71的持續(xù)流行嚴重影響了兒童健康，亦給社會和患兒家庭帶來了巨大的經(jīng)濟負擔[3]。目前已開發(fā)出針對EV71的預防性滅活疫苗，Ⅲ期臨床試驗顯示其對EV71感染引起的手足口病具有良好的保護性[4-5]。但仍沒有針對EV71的特異性抗病毒藥物，對EV71感染引發(fā)的重癥手足口病也僅限于支持治療，而重癥病例存活后可能出現(xiàn)不良預后，如神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[6-7]及學習和認知障礙[8-9]。因此，研制針對EV71感染的特異性抗病毒藥物具有重要意義。

特異性抗病毒藥物的研發(fā)依賴于對病原體致病機制的了解。天然免疫系統(tǒng)是機體抵抗病原體感染的第一道防線，更是特異性免疫反應感知病原體入侵的前哨。宿主利用天然免疫系統(tǒng)來防止EV71感染，而EV71亦進化出多種能力來逃避相應的抗病毒反應，這些過程涉及許多復雜的病毒與宿主相互作用，對這些相互作用的了解有助于深入認識病毒的致病機制。

1EV71抗宿主Ⅰ型干擾素反應

Ⅰ型干擾素反應是宿主免疫反應的第一道防線，具有重要的抗病毒能力。通常病毒感染宿主細胞后，天然免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)如Toll樣受體3/7/8/9(Toll-like receptors 3/7/8/9，TLR3/7/8/9)、維A酸誘導基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)及黑色素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)識別病毒RNA，并通過一系列信號轉(zhuǎn)導作用啟動Ⅰ型干擾素表達[10]，Ⅰ型干擾素進而誘導大量效應因子表達以改變細胞內(nèi)環(huán)境，使其不利于病毒復制，同時促進病毒抗原向適應性免疫細胞的呈遞作用，并激活T細胞以啟動特異性免疫反應[11-13]。體內(nèi)外實驗表明，Ⅰ型干擾素具有抗EV71感染的能力[14-16]，但EV71感染的細胞時常不能有效表達Ⅰ型干擾素[17-19]，尤其是在腦組織和消化道組織細胞中[20]。EV71感染的同時也抑制了Ⅰ型干擾素效應基因的表達[21]。近年來積累的研究資料表明，EV71利用多種蛋白在多個環(huán)節(jié)上對宿主細胞Ⅰ型干擾素抗病毒反應進行的攻擊是造成以上現(xiàn)象的主要原因(圖1)。

圖1腸道病毒71型抑制宿主細胞Ⅰ型干擾素反應

Fig.1Inhibition of type Ⅰ interferon response in host cells by EV71

3C蛋白是EV71的一個非結(jié)構(gòu)蛋白，其與病毒其他蛋白共同表達于受感染細胞的細胞質(zhì)中。EV71 3C蛋白對病毒復制具有重要作用[22-23]，也在多個不同途徑中參與病毒與宿主細胞的相互作用。在EV71感染的神經(jīng)元中，3C蛋白誘導宿主細胞凋亡[24]。小鼠模型感染實驗顯示，3C蛋白可顯著抑制小鼠體內(nèi)Ⅰ型干擾素的表達[20]。TLR3感知細胞中的病毒雙鏈RNA，TLR7則感知病毒單鏈RNA，它們激活共同的下游轉(zhuǎn)錄因子——干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)，因此IRF7在Ⅰ型干擾素應答過程中扮演重要角色。3C蛋白可結(jié)合并斷裂TLR3及TLR7信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子IRF7，抑制Ⅰ型干擾素基因表達[25]；還能通過特異性結(jié)合TLR3的下游信號傳遞蛋白——含Toll/白細胞介素1受體結(jié)構(gòu)域能誘導β干擾素的接頭分子(Toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter-inducing interferon β，TRIF)，誘導TRIF斷裂，使其失去激活Ⅰ型干擾素基因表達的能力[26]。

RIG-1作為不同于TLR的另一種PRR，負責在細胞質(zhì)中感知細胞內(nèi)的病毒雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，并通過下游信號傳遞蛋白——線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS；也稱IPS-1)傳遞Ⅰ型干擾素激活信號。EV71 3C蛋白可與RIG-1蛋白N端結(jié)合，封閉其與MAVS結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，使RIG-1不能有效募集和激活MAVS，從而阻斷抗病毒信號傳遞[18]；另有研究顯示，EV71 3C蛋白可直接催化RIG-1蛋白斷裂[27]。

MDA5與RIG-1同屬RIG-1樣受體家族，是與RIG-1有著類似功能的PRR，可感知細胞內(nèi)的雙鏈病毒RNA。MDA5主要負責識別長片段的病毒雙鏈RNA，并通過MAVS激活IRF3/7，進而誘導Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。EV71可通過半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)依賴途徑斷裂MDA5蛋白，阻斷其對下游因子IRF3的激活及Ⅰ型干擾素的表達[19]。Feng等研究則發(fā)現(xiàn)，EV71 與脊髓灰質(zhì)炎病毒及柯薩奇病毒A3型(coxsackievirus A3，CA3)共同利用表達于宿主細胞質(zhì)中的非結(jié)構(gòu)蛋白2A，以非caspase依賴途徑斷裂MDA5[27]。這兩個相互矛盾的研究結(jié)果可能預示著EV71在不同的生理條件下利用了不同的途徑來干擾MDA5介導的Ⅰ型干擾素激活信號傳遞。

MAVS是Ⅰ型干擾素信號傳遞通路中關鍵的信號傳遞蛋白，其向下游傳遞胞質(zhì)PRR RIG-1和MDA-5的激活信號，進而引發(fā)Ⅰ型干擾素表達，很多病毒正是以MAVS為攻擊靶點來逃逸宿主細胞的抗病毒反應。EV71 2A蛋白能在MAVS的3個不同甘氨酸殘基位點特異性斷裂MAVS，并將斷裂的MAVS蛋白從線粒體外膜上釋放到細胞質(zhì)中，使其不能激活下游的Ⅰ型干擾素基因轉(zhuǎn)錄因子IRF3，從而阻止感染EV71的宿主細胞表達Ⅰ型干擾素[17]。多種腸道病毒均被證實利用了與此相同的策略來干擾宿主的抗病毒反應[27]。

雖然EV71 2A及EV71 3C蛋白對細胞Ⅰ型干擾素信號通路進行了多環(huán)節(jié)攻擊，但并未完全抑制宿主Ⅰ型干擾素的表達。在EV71感染的多種細胞中，干擾素β(interferon β，IFN β)的轉(zhuǎn)錄水平仍有一定程度上調(diào)[21,28-29]。然而，EV71對Ⅰ型干擾素下游應答通路同樣具有抑制作用。當EV71感染橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)細胞時，EV71 2A蛋白能下調(diào)干擾素α受體1(interferon α receptor 1，IFNAR1)表達，減少其對下游轉(zhuǎn)錄因子STAT的磷酸化，抑制Ⅰ型干擾素激活下游效應因子[28]。當EV71感染人胚肺成纖維細胞(MRC-5)和RD細胞時，EV71可通過負向調(diào)控IFNAR1的下游信號分子JAK1，導致JAK1和酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2,TyK2)無法磷酸化，從而關閉Ⅰ型干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)的應答[29]。

EV71在利用病毒自身組分來對抗宿主Ⅰ型干擾素反應的同時，還可調(diào)動宿主細胞的因子來逃避天然免疫反應。EV71感染人膠質(zhì)母細胞瘤細胞(SF268)時，細胞中的NEDD4蛋白家族成員NEDD4L表達量增加，且NEDD4L對EV71在HeLa細胞中的復制具有促進作用。EV71利用了NEDD4L對IFN-β基因轉(zhuǎn)錄的負向調(diào)控作用，抑制受感染細胞的IFN-β分泌[30]。

雖然EV71可阻斷TLR3/7、MDA5和RIG-1等識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的PRR所介導的抗病毒反應，但宿主細胞還可借助損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)的PRR來抵抗EV71感染。EV71感染可引起上皮細胞、內(nèi)皮細胞、肌肉細胞和神經(jīng)細胞凋亡[24,31-33]，同時死亡細胞釋放的DNA作為一種DAMP信號被細胞胞內(nèi)體膜上的PRR成員 TLR9識別，進而激活NF-κB信號通路，并最終誘導細胞產(chǎn)生IFN-α以介導抗病毒反應[34]。

對脊髓灰質(zhì)炎病毒的研究顯示，組織中Ⅰ型干擾素及其下游效應因子的表達水平是組織細胞對脊髓灰質(zhì)炎病毒易感性的重要決定因素，Ⅰ型干擾素抗病毒反應極大限制了脊髓灰質(zhì)炎病毒的復制，而脊髓灰質(zhì)炎病毒也可能利用了少數(shù)個體Ⅰ型干擾素抗病毒反應缺陷的漏洞而成功入侵其CNS[35]。EV71與脊髓灰質(zhì)炎病毒同屬腸道病毒，其對宿主細胞Ⅰ型干擾素反應的抑制作用，尤其是在腦組織及胃腸道組織中的有效抑制，是否與其組織向性及致病機制相關，值得進一步研究。

2EV71抗宿主Ⅱ型干擾素反應

動物及臨床試驗顯示，EV71感染可誘導體內(nèi)IFN-γ水平顯著上升[15,20,36-38]，IFN-γ受體敲除小鼠實驗表明，IFN-γ具有限制EV71感染的特性[15,39-40]，但EV71可利用2A和3D蛋白調(diào)控并逃避細胞的IFN-γ抗病毒反應。在不降低細胞IFN-γ受體表達的情況下，3D和2A蛋白均通過影響IFN-γ應答通路中的轉(zhuǎn)錄因子STAT1來干擾細胞IFN-γ應答反應。其中EV71 3D蛋白在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平降低STAT1表達，并阻止STAT1蛋白第701位酪氨酸殘基磷酸化，從而影響其進入細胞核激活下游效應因子IRF1表達的能力[15]；EV71 2A蛋白則通過阻止STAT1蛋白第727位絲氨酸殘基磷酸化，進而影響STAT1蛋白的二聚化及STAT1二聚體的穩(wěn)定性，以此消除其激活STAT1蛋白促進IRF1表達的能力[15]。因此，即使感染EV71的宿主細胞增加了IFN-γ表達量，但由于其下游效應因子的激活被EV71 2A及3D蛋白共同阻斷，弱化了IFN-γ調(diào)動細胞抗病毒反應的能力，從而使EV71逃逸IFN-γ反應，在受感染細胞中成功復制并擴散。但該過程為體外細胞實驗所觀察到，在EV71感染者體內(nèi)，尤其是在發(fā)展為重癥病例的患者體內(nèi)是否存在相同的過程，仍值得進一步探究。

3EV71與NF-κB信號通路

NF-κB信號通路是細胞應答外界刺激的重要途徑，其感知150種以上外界刺激并相應調(diào)節(jié)150種以上基因的轉(zhuǎn)錄活性[41]。多種病毒及細胞應答病毒刺激的產(chǎn)物可激活該通路，且該通路可產(chǎn)生多種與病毒感染相關的細胞因子、免疫信號分子等，因此NF-κB信號通路在宿主細胞抗病毒感染的免疫反應中扮演著重要角色。

在宿主細胞中，EV71利用多條途徑阻斷細胞NF-κB通路中的活化信號傳遞。EV71 2C蛋白通過結(jié)合p65蛋白的IPT結(jié)構(gòu)域來干擾p65/p50蛋白二聚體的形成，從而阻止NF-κB信號通路激活[42]；EV71 2C蛋白還可結(jié)合NF-κB 抑制蛋白激酶β(inhibitor of NF-κB kinase β，IKKβ)并阻止其磷酸化，使IKKα/IKKβ/IKKγ復合體不能激活下游NF-κB，進而阻斷腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)對NF-κB信號通路的激活[43]。由于多種受體分子通過IKKα/IKKβ/IKKγ復合體向NF-κB傳遞激活信號，因此2C蛋白對該“瓶頸”分子的抑制作用可能影響除TNF-α以外的更多刺激信號對NF-κB的激活。

EV71 3C蛋白也參與對NF-κB信號通路的抑制。3C蛋白通過斷裂NF-κB通路信號傳遞蛋白TAK1、TAB1、TAB2和TAB3，破壞TAK1蛋白復合體，使其無法激活下游的NF-κB[44]。EV71 3C蛋白能特異性斷裂TLR3的下游信號傳遞蛋白TRIF，而TRIF不僅參與Ⅰ型干擾素表達的信號傳遞，也參與NF-κB信號傳遞，因此3C蛋白對TRIF的斷裂作用同樣抑制了NF-κB基因的激活[26]。

EV71利用其非結(jié)構(gòu)蛋白2C和3C在不同環(huán)節(jié)共同抑制NF-κB激活信號的傳遞，但NF-κB信號通路下游效應因子白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)的表達在EV71感染時顯著上升[20,26,37,45]，提示細胞可能利用其他信號傳遞通路來激活促炎性因子IL-6的表達。最近研究顯示，在人腸道組織上皮細胞中，EV71感染激活了絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路中的細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)及c-Jun氨基末端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinase 1/2，JNK1/2)信號分子，并觸發(fā)了與NF-κB信號通路間的交互作用，從而誘導IL-6等促炎性因子的表達[46]。在未成熟樹突細胞(dendrtic cell，DC)中，EV71感染則激活MAPK信號通路中的JNK1/2和p38/MAPK分子，并誘導了IL-6產(chǎn)生[47]。EV71感染既可直接作用于NF-κB信號通路，阻斷其信號傳遞，又可從旁路途徑激活該通路，進而誘導高水平的IL-6表達，顯示了EV71與宿主細胞相互作用的復雜性。

4EV71與天然免疫細胞

DC是體內(nèi)功能最強的專職抗原呈遞細胞(antigen presenting cell，APC)，其攝取抗原并加工呈遞給T細胞，以激活初始T細胞的增殖與分化，是介導抗病毒感染的重要天然免疫細胞。DC在執(zhí)行其免疫功能的過程中需經(jīng)歷一個功能性成熟的過程，只有功能性成熟的DC才能誘導抗原特異性T細胞的產(chǎn)生，而未成熟的DC則有可能誘導對特異抗原的免疫耐受[48]。DC的成熟過程涉及眾多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。多項研究顯示，Ⅰ型干擾素控制著DC的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程，是刺激DC成熟必不可少的因子[11,49-50]。EV71可感染人類未成熟DC[38,47,51]，并誘導受感染DC中IFN-β表達量上升，但未誘導IFN-α表達量上調(diào)[38]，這是否影響DC的功能性成熟仍未知。

早期研究發(fā)現(xiàn)EV71可利用DC-SIGN分子作為受體進入未成熟DC中，促進DC的表型成熟及對T細胞的刺激[51]；而以后研究則發(fā)現(xiàn)DC利用其細胞表面的DC-SIGN分子黏附EV71顆粒，并促進EV71對其他易感細胞的感染[52]。DC既協(xié)助了EV71擴散，又激活了特異性免疫反應，其在EV71感染過程中似乎扮演著雙重角色。但以上研究均為體外實驗，且未明確區(qū)分具有不同特性的DC亞型，因此有必要進行更系統(tǒng)更深入的體內(nèi)實驗來明確DC在EV71感染中所扮演的角色。

EV71具有感染人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的能力[53]，進一步的研究確認EV71可感染CD14+細胞，并在CD14+細胞中復制。EV71對CD14+細胞的感染可能導致其由呼吸道或腸道黏膜向其他靶器官擴散。同時，EV71感染的CD14+細胞可刺激T細胞分裂，并在體內(nèi)誘導針對EV71的特異性抗病毒反應[54]。CD14+細胞有兩類：單核來源的DC和單核-巨噬細胞。體外實驗表明，EV71可感染人巨噬細胞并在其中有效復制[55]。巨噬細胞是另一種重要的專職APC。最近研究指出，當EV71感染幼鼠時，巨噬細胞向恒定型自然殺傷T細胞(invariant nature killer T cell，iNKT細胞)呈遞抗原和共刺激信號并激活iNKT細胞，活化的iNKT細胞則阻止EV71向幼鼠CNS擴散。對于適應性免疫系統(tǒng)還未發(fā)育完全的幼鼠而言，由巨噬細胞和iNKT細胞介導的保護作用對其抵抗EV71感染具有重要意義[56]。

天然免疫細胞是天然免疫應答的主要成分，是感應及清除病原體的功能執(zhí)行者，更是啟動特異性免疫反應的開關。天然免疫細胞的行為很大程度上決定了機體的特異性免疫系統(tǒng)是否對病原體產(chǎn)生應答，以及應答的程度和類型。目前，針對EV71與天然免疫細胞相互作用的研究不多，尤其缺乏深入的體內(nèi)研究。全面認識兩者相互作用過程必將為了解EV71致病機制提供有力的支持。

5結(jié)語

EV71預防性疫苗的出現(xiàn)為控制EV71引起的手足口病帶來了希望，但EV71流行的廣泛性、引發(fā)重癥手足口病的能力，以及重癥手足口病的不良預后等現(xiàn)實迫切需要尋找特異性的抗EV71藥物及療法。近年來，由于技術的進步及關注度的提高，EV71感染機制的研究取得了可喜的進步。研究提示，EV71與宿主天然免疫系統(tǒng)間存在復雜的相互作用，宿主細胞具有多種對抗病毒感染的機制，而EV71則進化出許多途徑來逃避宿主細胞的攻擊。雖然人們已意識到EV71的致病機制與其逃避天然免疫系統(tǒng)的抗病毒反應有關，但EV71與天然免疫反應的相互作用如何影響特異性免疫反應、個體對EV71的易感性及抵抗能力由什么決定、其組織向性涉及哪些因素、其通過什么途徑感染CNS，以及決定其病理表現(xiàn)的因素是什么，這些問題還遠未被闡釋清楚，給治療性藥物的研發(fā)帶來了挑戰(zhàn)。因此，應在現(xiàn)有研究成果的基礎上繼續(xù)深入了解EV71的致病機制，并最終清除EV71給人類帶來的危害。

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Progress on interactions between enterovirus 71 and innate immunity

ZHANG Xiaolong,LI Qihan

Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Disease;Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Kunming 650118,China

Abstract:Enterovirus 71(EV71)is a pathogen for hand,foot and mouth disease(HFMD),and its prevalence is a great challenge to public health.Pathogenesis of EV71 is closely related to a panel of host innate immune responses,such as escape of interferon response,suppression of nuclear factor κB(NF-κB)signaling pathway and interactions between virus and innate immune cells.This review focuses on the new progress on interactions between EV71 and host innate immunity.

Key words:Enterovirus 71;Innate immunity;Hand,foot and mouth disease

基金項目：北京協(xié)和醫(yī)學院“協(xié)和青年基金”(3332015051)

通信作者：李琦涵

Corresponding author.LI Qihan,E-mail：liqihan@imbcams.com.cn

(收稿日期：2015-12-29)