付賽賽，付冉冉，李進(jìn)福

(1.河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2.河南省商丘市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校護(hù)理系)

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大腸桿菌誘導(dǎo)30代后對環(huán)丙沙星耐藥性的變化試驗

付賽賽1，付冉冉2，李進(jìn)福1

(1.河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2.河南省商丘市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校護(hù)理系)

摘要：為探究誘導(dǎo)30代后的大腸桿菌對環(huán)丙沙星的耐藥性變化，為臨床控制致病性大腸桿菌病提供參考。使用環(huán)丙沙星對8株“耐藥菌”進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，將1/2 MIC作為初始誘導(dǎo)濃度。挑取每隔5代的菌株，并在每個原有菌株編號下標(biāo)5、10、15、20、25、30表示誘導(dǎo)代數(shù)，共得到誘導(dǎo)培養(yǎng)菌株60株，用于誘導(dǎo)菌株外排表達(dá)量的測定。結(jié)果表明：部分菌株在第5代時，MIC值已經(jīng)增加1倍，部分菌株至30代時，MIC值才發(fā)生變化，其最大值增加至原來的8倍，多數(shù)為原來的2～4倍。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；環(huán)丙沙星；耐藥基因

大腸桿菌病是由大腸埃希氏菌引起的人獸共患病，最早從嬰兒糞便中分離獲得，被認(rèn)為是非致病菌。直到十九世紀(jì)中葉，科學(xué)家逐漸認(rèn)識到一些特殊血清型的大腸桿菌具有病原性，主要引起嬰幼兒及幼畜、雛禽的腹瀉和敗血癥。1894年，首例報道大腸桿菌可引起禽類的大批死亡，并從心、肝、脾中分離到大腸桿菌[1-2]。

大腸桿菌病是人獸共患的常見原發(fā)或繼發(fā)性細(xì)菌病，對人畜健康危害極大，抗菌藥物在這類疾病的防控中發(fā)揮著非常重要的作用。近年來，由于長期濫用抗菌藥物，造成了大腸桿菌耐藥菌株的不斷產(chǎn)生，在獸醫(yī)臨床上已出現(xiàn)多重耐藥性、超強(qiáng)耐藥的大腸桿菌(即同時對獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物，如β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類和氟喹諾酮類等產(chǎn)生耐藥性)，?？蓪?dǎo)致常規(guī)藥物的藥效下降甚至消失，臨床可供選擇藥物大幅減少，給人類健康帶來嚴(yán)重威脅[3]。主動外排系統(tǒng)是微生物產(chǎn)生多重耐藥性的一個重要機(jī)制，能夠介導(dǎo)藥物的外排，阻止抗菌藥物在菌體內(nèi)的集聚。目前，對主動外排系統(tǒng)的研究已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一[4-5]。本試驗對臨床分離的8株大腸桿菌進(jìn)行了藥敏試驗，用微量肉湯稀釋法測定了分離菌對臨床常用藥物——環(huán)丙沙星的敏感性，找出主動外排相關(guān)靶基因，為防控大腸桿菌的合理用藥及防止耐藥菌株的傳播提供重要理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗菌株8株大腸桿菌由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所分離、鑒定、保存及耐藥性檢測，標(biāo)記編號分別為1、045、94、048、017、T7、035、040。

1.2試劑及儀器環(huán)丙沙星(98.0%)由河南某獸藥公司提供，MH培養(yǎng)基(肉湯)，ddH2O，麥康凱瓊脂均購自某醫(yī)藥有限公司。

1.3細(xì)菌處理

1.3.1細(xì)菌復(fù)蘇無菌操作臺下接菌，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，觀察平皿板上細(xì)菌生長情況，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)和性狀初步判斷是否為目的細(xì)菌。挑單個菌落接種于不加藥物的MH肉湯，37℃水域恒溫水浴震蕩培養(yǎng)過夜，然后接種于麥康凱培養(yǎng)基上鑒別細(xì)菌，得到的細(xì)菌液保存?zhèn)溆貌?biāo)記為0代菌。

1.3.2細(xì)菌誘導(dǎo)將1/2 MIC的CIP作為初始誘導(dǎo)濃度。37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，即為1代，連續(xù)共傳30代，傳代過程中，每隔5代測定MIC，并調(diào)整MH肉湯中的藥物濃度，使之始終保持1/2MIC。并將誘導(dǎo)菌液劃線于麥康凱培養(yǎng)基，觀察菌落形態(tài)及是否污染有雜菌。若在傳代過程中菌株生長不良，則使用上代菌株在無藥物狀態(tài)下使細(xì)菌生長，但不計代數(shù)，然后加入1/2MIC藥物繼續(xù)傳代。挑取每隔5代的菌株，并在每個原有菌株編號下標(biāo)5、10、15、20、25、30表示誘導(dǎo)代數(shù)，共得誘導(dǎo)培養(yǎng)菌株60株，用于誘導(dǎo)菌株外排表達(dá)量的測定。

1.4藥液配置將稱量好的藥品用高壓滅菌去離子水配制成濃度為2560 μg/mL的藥液，分裝時使用注射器和0.25 μm濾頭分裝至1.5 mL EP管中置-20℃保存(保存時間長，隨用隨取)。

1.5最小抑菌濃度測定按照肉湯稀釋棋盤法(參照MIC)測定。具體方法如下，將1到6排第1孔分別加入50 μL(512 μg/mL)環(huán)丙沙星，分別加入50 μg/mL菌液，將1～6排從左到右進(jìn)行倍比稀釋，第1～6排1～6孔中，環(huán)丙沙星濃度依次為256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL。用同樣方法將每株細(xì)菌每種藥物重復(fù)三次，對比結(jié)果觀察是否出現(xiàn)重現(xiàn)性。參考CLSI抗菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)[6]，當(dāng)質(zhì)控菌符合規(guī)定的藥敏范圍時，對供試菌的MIC值進(jìn)行判讀。當(dāng)出現(xiàn)單一跳孔時，參照平行操作結(jié)果記錄抑制細(xì)菌生長的最高藥物濃度，如多次出現(xiàn)跳孔現(xiàn)象，必須重新操作。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌鑒定結(jié)果第30代菌株在 MH肉湯中過夜培養(yǎng)后可見肉湯出現(xiàn)不同程度的混濁。第30代菌株在麥康凱培養(yǎng)基上形成桃紅，扁平，圓形，隆起，光滑，濕潤菌落，與資料描述中大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上生長性狀基本一致，故鑒定為大腸桿菌[7]。

2.2最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果詳見表1。由表1可見，經(jīng)過30代誘導(dǎo)，環(huán)丙沙星對所有菌株MIC都發(fā)生了不同程度的改變，其中菌株1、T7在第5代時，耐藥性變強(qiáng)，MIC值已經(jīng)增加1倍；環(huán)丙沙星對035菌株第10代MIC即發(fā)生改變，而菌株040至第30代才發(fā)生改變。從以上試驗可以看出不同菌株對環(huán)丙沙星耐藥性不同，環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)可以改變菌株的 MIC，誘導(dǎo)可使耐藥菌株的耐藥性更強(qiáng)。由于這些菌株本身即為耐藥性較強(qiáng)的菌株，誘導(dǎo)后可使MIC值最大增加為原來的8倍(T7)，多數(shù)為原來的2～4倍。

表1　乳酸環(huán)丙沙星對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)

3小結(jié)與討論

試驗研究首先使用1/2MIC環(huán)丙沙星對耐藥菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，給耐藥菌株造成抗生素生存壓力，導(dǎo)致菌株的耐藥性更強(qiáng)，MIC值相應(yīng)增加。部分菌株在培養(yǎng)至5代、10代時，即適應(yīng)了較高的環(huán)丙沙星濃度，耐藥性增加，表現(xiàn)為MIC升高，外排基因表達(dá)量增加，則可能出現(xiàn)與環(huán)丙沙星耐藥性有關(guān)的其它機(jī)制變化，比如靶位突變；產(chǎn)生 aac(6′)-Ⅰb-cr酶等[8]。

部分適應(yīng)較慢菌株培養(yǎng)至25代、30代時，MIC才出現(xiàn)明顯變化。部分菌株MIC增加8倍，多數(shù)為增加2～4倍。部分主動外排基因增加非常明顯，達(dá)到了原代菌株的數(shù)倍，甚至數(shù)百倍，部分菌株雖然耐藥性增加，但主動外排基因表達(dá)則反而下降，這可能與菌株之間的個體差異有關(guān)，有待進(jìn)一步研究探討。參考文獻(xiàn)

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[4]張卓然,夏夢巖,倪語星.微生物耐藥的基礎(chǔ)與臨床[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2007.

[5]Keith Poole, Efflux-mediated antimicrobial resistance[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005,56,20-51.

[6]CLSI. performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 20th informational supplement, M100-S20[S]. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institude, 2010.

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收稿日期：2015-11-20

作者簡介：付賽賽(1991.9-)，女，在讀碩士，E-mail:546251799@qq.com

中圖分類號：S852.61+2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-7307(2016)03-0004-002